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Article de méthode

Lingettes nasal pour la grippe détection d'un virus et l'isolement des porcs

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DOI :

10.3791/53313

⸱

4 décembre 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Preventive Medicine, The Ohio State University

Dans cet article

Résumé

Les auteurs présentent un protocole de collecte de lingettes nasales pour porcs afin de détecter et d’isoler les virus de la grippe A.

Résumé

Surveillance des virus de l'influenza A chez le porc est essentielle à la santé humaine et animale en raison de la grippe A virus évolue rapidement dans les populations de porcs et de nouvelles souches sont continuellement en train d'émerger. Porcine sont en mesure d'être infecté par diverses lignées de virus influenza A qui les rend hôtes importants pour l'émergence et le maintien de la nouvelle grippe A souches de virus. L'échantillonnage des porcs dans divers contextes tels que les fermes commerciales porcs, les foires agricoles et les marchés d'animaux vivants est important de fournir une vue complète des souches actuellement en circulation IAV. L'ante-mortem technique d'échantillonnage de l'étalon-or actuel (collecte des écouvillons nasaux) est un travail intensif car il nécessite la contention physique des porcs. Lingettes nasales impliquent frotter un morceau de tissu à travers le groin du porc avec peu ou pas de retenue de l'animal. Le nasale essuyer procédure est simple à réaliser et ne nécessite pas de personnel avec vétérinaire ou de formation professionnelle de la manipulation des animaux. Wien que légèrement moins sensibles que les écouvillons nasaux, les taux de détection de virus et d'isolement sont suffisants pour faire nasale essuie une alternative viable pour l'échantillonnage de porcs individuels lorsque les méthodes d'échantillonnage faible de stress sont nécessaires. Le protocole de procédure décrit les étapes nécessaires pour recueillir une nasale viable essuyer d'un porc individuel.

Introduction

Les virus grippaux A (IAV) provoquent des maladies respiratoires chez de nombreuses espèces, y compris les oiseaux domestiques, les porcs et les humains. En raison de réassortiment du génome IAV segmenté évolution virale rapide peut se produire et de nouvelles souches IAV sortir fréquemment. Les porcs sont une espèce qui peut servir comme une cuve de mélange pour réassortiment des IAV d'espèces hôtes multiples. 1 Il existe actuellement trois principaux sous-types de l'IAV couramment circulant chez les porcs en Amérique du Nord (H1N1, H1N2, H3N2), mais de multiples introductions de VIA de l'homme ont a conduit à une vaste diversité IAV au sein de ces sous-types. 2 évolution rapide des IAV infectant les porcs a été évidente depuis 1998 quand un triple réassorti IAV contenant des segments de gènes provenant de virus humain, aviaire et porcine 3 est répandue chez les porcs aux États-Unis. 4 Le gène interne segments de cette triple réassorti IAV restent très fréquente chez IAV infectant actuellement porcine. 5

"> Dans le monde entier, l'IAV est une cause importante de maladie respiratoire chez les porcs présentant des signes cliniques typiques comprennent la fièvre, anorexie, léthargie, toux, respiration laborieuse, les éternuements, l'écoulement nasal et le gain de poids insuffisant. IAV peut être particulièrement coûteux pour semer fermes où la reproduction échec en raison de la fièvre induite IAV et de porcelets chétifs-né ont été documentés. 6,7 Aux États-Unis, l'IAV est couramment détectée dans les troupeaux de porcs commerciaux et la diversité antigénique et génomique étendue et l'évolution continue entre IAV porcine infecter a entravé le contrôle de cette virus. 11/08

Santé Les préoccupations du public au sujet de l'émergence d'une souche IAV pandémie résultant d'un réassortiment chez le porc ont été réalisé en 2009 quand un IAV porcine lignée contenant des segments de gènes de la lignée porcine nord-américaine triple réassorti et la lignée porcine aviaire de type eurasien causé une pandémie mondiale chez les humains. 12 Le virus pandémique (A (H1N1) pdm09) a depuisréassorti avec des porcs souches endémiques IAV 13,14 et certaines de ces nouvelles souches ont été réassortis transmis en retour à l'homme. 15 La fréquence des événements réassortiment et émergence de nouvelles souches IAV à potentiel pandémique rend la surveillance active des virus circulant chez les porcs IAV impératif, en particulier à l'interface de porc-humain.

L'interface de la peste humaine est important pour bi-directionnel de la transmission interespèces de l'IAV. Human-à-porcine transmission se produisant dans la production porcine commerciale est responsable d'une grande quantité de IAV diversité actuellement présent dans la population porcine. Les foires agricoles sont les plus grands paramètres de la mêlage des personnes et des porcs aux États-Unis et sont des sites pour la transmission zoonotique de l'IAV. 15-21 En 2012 connus, lors de l'épidémie de variante H3N2 IAV, 93% des cas signalés à la fréquentation une foire agricole dans les jours précédant l'apparition de la maladie. 15 L'analyse génomiquedes isolats viraux provenant de porcs d'exposition par rapport aux isolats humains confirmé transmission zoonotique. porcine 21 Exposition infectés par IAV souvent ne présentent pas de signes cliniques de la maladie, 21-23 indiquant la nécessité de tests de diagnostic directs.

L'échantillonnage des porcs visiblement malades ne suffira pas à réussir à identifier la prévalence IAV chez les porcs et ne peut être invoquée pour identifier de nouvelles souches de l'IAV émergents parmi les porcs. La surveillance active est absolument nécessaire pour la détection des souches émergentes de l'IAV chez le porc et d'évaluer leur menace à la fois pour les porcs et la santé publique. La plupart des activités de surveillance IAV sont volontaires et donc des méthodes peu perturbateurs sont nécessaires. Les trois principales procédures de prélèvement d'échantillons ante mortem pour IAV infecter les porcs sont: écouvillons nasaux, des fluides oraux, et les lingettes nasales. Les recommandations actuelles pour échantillonner porcine individuelle pour détecter liste IAV l'insertion de fibres synthétiques écouvillons dans les narines comme la méthode préféréepour recueillir les sécrétions nasales et les cellules épithéliales. 24,25 Parce que les porcs peuvent essayer d'éviter cette procédure, une équipe de personnel qualifié doit retenir porcs soit manuellement ou avec un piège en fonction de la taille de l'animal. 26 Le processus de retenue est laborieuse pour le personnel et stressant pour les porcs. En outre, l'exposition des porcs sont souvent impliqués dans plusieurs compétitions à une foire de sorte que la perception de stress supplémentaire sur un animal de la concurrence peut faire propriétaires résistant aux efforts de surveillance.

Avec probabilités de détection IAV allant de 80-100% dans IAV troupeaux infectés, fluides oraux sont devenus une alternative populaire aux écouvillons nasaux pour la détection moléculaire de l'IAV dans les populations de porcs. 27,28 De plus, les fluides oraux peut offrir une fenêtre plus large de détection IAV que écouvillons nasaux après l'infection initiale. Cependant, l'isolement de l'IAV fluides oraux a été problématique avec seulement 50% des tentatives d'isolement du virus entraînant IAV récupération. 29

Utilisation de lingettes nasales en lieu et place des écouvillons nasaux cours de la surveillance chez les porcs IAV surmonte les limitations décrites ci-dessus. Lingettes nasales ne nécessitent pas l'utilisation d'un piège de retenue et peuvent être effectuées sans stresser les animaux ou les témoins de la procédure. Formation technique minimale est nécessaire pour recueillir des lingettes nasales, ce qui permet aux professionnels non-vétérinaires, y compris les propriétaires de porcs, de recueillir les échantillons de surveillance. Lingettes nasaux ont été précédemment par rapport aux écouvillons nasaux pour la détection et l'isolement des virus de la grippe A et le 30 protocole détaillé pour cette méthode non invasive d'échantillonnage est décrite ci-dessous.

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Protocole

Tous les porcs utilisés pour la collecte des données suivantes ont été protégés en vertu de la Commission institutionnelle soin et l'utilisation des animaux Ohio State University (utilisation animale numéro de protocole 2009A0134-R1).

1. Préparation de transport viral moyen de prélèvement des échantillons et flacons

  1. Ajouter 37 g de Brain Heart Infusion à 900 ml d'eau purifiée et bien mélanger avec une barre d'agitation et d'agitateur magnétique tout en chauffant à 70 ° C pour dissoudre complètement la poudre.
  2. Autoclaver le bouillon à 121 ° C pendant 15 min. Laisser refroidir sur la paillasse jusqu'à ce que le bouillon atteigne la température ambiante. Réfrigérer à 4 ° C pendant la nuit si nécessaire.
  3. Dissoudre, par mélange avec un barreau d'agitation magnétique, 6,02 g de sel de sodium de pénicilline G et 10 g de sulfate de streptomycine dans 50 ml d'eau purifiée à la température ambiante. Ajouter de l'eau purifiée supplémentaire pour porter le volume total à 100 ml. Filtrer la solution à travers une membrane de 0,22 um de polyéthersulfone dans un flacon stérile.
  4. Ajouter stérilement la pénicilline filtré et la solution de streptomycine dans le cerveau refroidi Heart Infusion Broth et bien mélanger (barre d'agitation ou turbulence flacon à la main) pour rendre le milieu de transport viral.
  5. Aseptiquement tester le pH du milieu de transport viral; si nécessaire, ajuster le pH à 7,4 ± 0,2 en utilisant du HCl ou du NaOH.
  6. Effectuer des tests d'assurance qualité sur le milieu de transport viral en testant pour la grippe A protéine de matrice du virus par RT-PCR, comme décrit par Zhang et Harmon. 22
  7. Distribuer 5 ml de milieu de transport viral dans des bouteilles en polyéthylène haute densité stériles avec capacité de 8 ml. Étiqueter les flacons pour une utilisation dans le domaine.
  8. Conserver les flacons prêts à l'emploi dans cryo-boîtes standards à -20 ° C jusqu'à ce que la collecte de l'échantillon.

2. Collecte des nasale Lingettes de porcs

  1. Décongeler le nombre approprié de flacons immédiatement avant le prélèvement des échantillons; un flacon sera nécessaire par porc échantillonnée. Décongélation à mangertempérature dure environ 30 à 45 min. Conserver les flacons décongelés refroidir sur les paquets de glace jusqu'à utilisation.
  2. Don équipement de protection individuelle approprié que dictées par la situation (par exemple, une combinaison, des couvre-bottes, masque respiratoire, des bouchons d'oreille, etc.).
  3. Entrez dans la zone de l'animal. Si nécessaire, limiter le cochon à une petite zone mais ne retenir aucune. Ne pas réveiller de repos des animaux.
  4. Mettez une paire de gants d'examen jetables. Prenez soin de ne pas contaminer les gants par les porcs touchant, des personnes ou des objets inanimés.
  5. Utilisez une main gantée pour enlever un stériles 5,08 cm x 5,08 cm (2 po. X 2 po.) Coussin de gaze de coton de son emballage. Tampons de gaze stériles doivent être utilisées autant que possible. Tampons de gaze emballées individuellement sont plus faciles à utiliser que ceux enveloppé avec deux tampons de gaze par paquet.
  6. Maintenez le pad de gaze de coton avec les doigts d'une main exposer autant de la tablette que possible pour l'échantillonnage.
  7. Essuyez le tampon de gaze sur le museau du porc, en prenantdes précautions supplémentaires pour saisir les narines externes, si possible. Recueillir les sécrétions nasales visibles (environ 1 ml) avec le même tampon de gaze.
  8. Utilisation de la même main, plier le tampon de gaze sur lui-même pour faciliter le placement dans le flacon contenant le milieu de transport viral.
  9. Avec l'autre main, retirez le bouchon du flacon et placer la compresse de gaze plié dans le flacon. Reboucher le flacon et agiter le flacon pour assurer le mélange du tampon de gaze et de milieu de transport viral.
  10. Retirer les gants et les placer dans un récipient approprié. Changer de gants entre chaque porc.
  11. Vérifiez l'identifiant flacon. Numéro d'identification de porc, l'âge, le sexe, les signes cliniques, et d'autres notes jugées nécessaires par l'enquêteur.
  12. Réfrigérer les échantillons immédiatement après le prélèvement. Pensez à faire des aliquotes de l'échantillon avant de le congeler afin d'éviter de multiples cycles de gel-dégel. Dès que possible après la collecte, placer les échantillons sur glace sèche pour le transport au laboratoire. Conserver les flacons à -80° C jusqu'à ce que le test est initié.

3. Détection du virus grippal A Nucleic Acid

  1. Décongeler les échantillons dans un bain de perles sec 37 ° C pendant 5 min, puis terminer la décongélation les échantillons sur la paillasse à température ambiante pendant 20-30 min. L'addition simultanée de plusieurs flacons à billes entraîne le bain à chauffer; il faut être prudent pour ne pas surchauffer les flacons.
  2. Retirer 100 pi de milieu de transport viral pour l'extraction de l'ARN.
    1. Utiliser un débit élevé (format de plaque à 96 puits) magnétique de la plate-forme de talon pour extraire l'ARN à partir d'un grand nombre d'échantillons. 31
  3. Utilisation essais de PCR de la transcriptase inverse en temps réel pour la détection rapide de la grippe A de virus. 31

4. L'isolement du virus grippal A partir Lingettes nasaux

  1. Décongeler les échantillons comme décrit ci-dessus à la section 3.1
  2. Traiter les échantillons décongelés avec le sulfate de gentamicine (1000ug / ml), de l'amphotéricine B (22,5 pg / ml), et du sulfate de kanamycine (325 ug / ml).
  3. Inoculer dans Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) des cellules épithéliales comme décrit précédemment. 32

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Résultats

L'utilisation réussie de cette méthode donne des résultats RRT-PCR qui, accompagnée de l'utilisation d'un contrôle interne lors de l'extraction de l'ARN et RT-PCR, montrent des échantillons ne contiennent des inhibiteurs de PCR de tout débris de l'environnement ramassé lors de l'échantillonnage. Après inoculation échantillon, puits d'isolement du virus devraient être libres de débris de l'environnement visible de l'échantillon. Il ya un accord raisonnable entre les résultats RRT-P...

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Discussion

Prélèvement d'échantillons provenant de porcs en utilisant des écouvillons nasaux polyester pointe est avéré utile dans la conduite de la surveillance IAV; Cependant, l'utilisation de la procédure de l'écouvillon nasal entrave les efforts de surveillance en raison de l'utilisation obligatoire de un piège à la retenue. Lingettes nasales représentent un raffinement des techniques porcine actuelles d'échantillonnage pour minimiser le stress sur les personnes et les porcs lors de la collecte de l'éch...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé en partie par des fonds fédéraux des Centres d’excellence pour la recherche et la surveillance de la grippe (CEIRS), de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, des Instituts nationaux de la santé, du ministère de la Santé et des Services sociaux, dans le cadre du contrat n°. HHSN272201400006C.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BBL Brain Heart InfusionBecton, Dickinson and Company211059
Pénicilline G Sel de sodiumMP Biomedicals, LLC0211945371500 u/mg
Sulfate de streptomycineAMRESCO LLC0382
Gentamicin SolutionMediatech, Inc.30-005-CR50 mg/ml
Amphotéricine B SolutionFisherS 24 25250 μg/ml
Sulfate de kanamycineTeknovaK21055000 μg/ml
TPP Système Rapid Filtermax TPPTechno Plastic Products AG  ;99150
Nalgen Flacons de diagnosticThermo Scientific342002-9025PEHD avec fermeture en PP blanc
Éponge de gaze Dermacea, 8 plisCovidien4412115,08 cm & fois 5,08 cm (2 in. & times ; 2 in)  ;
Gants d’examen en nitrileSaftey Choice19-170-010 (A-D)

Références

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