Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Résumé

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Résumé

Réponse immunitaire efficace dépend de mobilisation rapide des leucocytes du sang vers le site de l'infection ou de blessure. Enquêter la migration des leucocytes in vivo est cruciale pour la compréhension de la base moléculaire de la migration des leucocytes transendotheliale et l'interaction avec l'endothélium vasculaire. Une approche puissante implique microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d'intérêt.

Ici, nous présentons un protocole pour les monocytes et les neutrophiles d'imagerie dans la ^gfp CR1 ^{/ poids} iv de la souris injectée avec CX ₃ oranges neutrophiles marqués par un colorant avec un microscope confocal inversé. Films time-lapse recueillies auprès de 30 minutes à plusieurs heures d'imagerie permettre à l'analyse du comportement des leucocytes dans les veines mésentériques sous les deux conditions stables et inflammatoires. Nous décrivons également les étapes pour induire localement inflammation des vaisseaux sanguins avec TLR2 / TLR1 agoniste Pam3SK4 et surveiller la subsequent recrutement des neutrophiles et des monocytes.

La technique présentée peut également être utilisé pour contrôler d'autres populations de leucocytes et étudier molécules impliquées dans le recrutement des leucocytes ou la traite à l'aide d'autres stimuli ou des souris transgéniques.

Introduction

Neutrophiles et des monocytes sont des cellules du système immunitaire inné qui circulent en continu dans le sang. Lors de blessure ou d'infection, les signaux inflammatoires induisent diapédèse leucocytaire dans les tissus endommagés et infectés, en entamant le présent mémoire une réponse immunitaire cellulaire ^3.1. La rapidité de la mobilisation des leucocytes détermine le résultat positif des réponses immunitaires. Ces processus complexes reposent sur ​​des molécules spécifiques (par exemple, sélectines, des chimiokines de l'endothélium lié) présents sur l'endothélium enflammé qui aident à l'établissement de contacts entre....

Protocole

Nota: Les procédures animaux ont été effectuées en conformité avec le comité d'éthique institutionnel de protection des animaux à Genève, la Suisse et l'Office vétérinaire cantonal. Numéro d'autorisation GE / 63/14.

1. Préparation d'une seule cellule Suspension de la moelle osseuse

1. Sacrifice des souris (8 à 12 semaines de old) par dislocation cervicale. Stériliser pattes de derrière avec 70% d'éthanol. Enlever la peau des pattes postérieures.
2. Disséquer les fémurs de souris et les tibias et enlever les tissus des jambes avec un scalpel. Rincer les jambes avec 90% d'éthanol et le placer dans une ....

Résultats

Le manuscrit décrit un protocole optimisé pour contrôler facilement le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques de souris anesthésiées en temps réel. L'utilisation d'une chambre de 37 ° C-thermostatée est impératif de maintenir la température de la souris et également en raison du mouvement des leucocytes dépendant de la température. Préparation de la souris est affiché sur la figure 1. La figure 2 montre l'ensemble de la zone vu au micros.......

Discussion

Les méthodes décrites dans ce manuscrit fournissent une approche cohérente pour étudier efficacement monocytes et le comportement des neutrophiles dans les veines mésentériques dans des conditions stables et inflammatoires.

L'étape cruciale de la préparation est l'immobilisation de l'intestin avec des tissus PBS-mouillées. Si effectué correctement, les vaisseaux mésentériques sont joliment exposés sur la lamelle pour l'acquisition d'image. Cela permet la sélection de plus.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes à fond rond en polystyrène de 5 ml  ;	Beckton Dickinson	352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45  ;   ; DT :4mm  ;	Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT :1mm  ;	Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye	Life Technologies	C34551
EasySep Aimant	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Souris Kit d’enrichissement des neutrophiles	Stem Cell Technologies	19762
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
FCS	PAA	A15-042
Huile d’immersion Type A	Nikon		n’importe quelle huile visqueuse  ;
Life Box Système de contrôle de la température	Life Imaging
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NH4Cl	Sigma Aldrich	A9434
Microscope confocal Nikon A1R	Nikon	A1R	, platine x/y/z motorisée, logiciel NIS elements PBS
	Life Technologies	D8537
sans rouge de phénol DMEM/F12	Life Technologies	21041-025	tout milieu sans rouge de phénol convient
PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	reconstitue dans le
sérum de rat	Technologies de cellules		incluses dans EasySep Kit d’enrichissement des neutrophiles de souris Boîte de
culture tissulaire 100	TPP	93100

Microscope inversé PBS souches