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Article de méthode

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

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DOI :

10.3791/53314

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16 novembre 2015

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1Department of Pathology and Immunology, University of Geneva

Dans cet article

Résumé

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Résumé

Réponse immunitaire efficace dépend de mobilisation rapide des leucocytes du sang vers le site de l'infection ou de blessure. Enquêter la migration des leucocytes in vivo est cruciale pour la compréhension de la base moléculaire de la migration des leucocytes transendotheliale et l'interaction avec l'endothélium vasculaire. Une approche puissante implique microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d'intérêt.

Ici, nous présentons un protocole pour les monocytes et les neutrophiles d'imagerie dans la gfp CR1 / poids iv de la souris injectée avec CX 3 oranges neutrophiles marqués par un colorant avec un microscope confocal inversé. Films time-lapse recueillies auprès de 30 minutes à plusieurs heures d'imagerie permettre à l'analyse du comportement des leucocytes dans les veines mésentériques sous les deux conditions stables et inflammatoires. Nous décrivons également les étapes pour induire localement inflammation des vaisseaux sanguins avec TLR2 / TLR1 agoniste Pam3SK4 et surveiller la subsequent recrutement des neutrophiles et des monocytes.

La technique présentée peut également être utilisé pour contrôler d'autres populations de leucocytes et étudier molécules impliquées dans le recrutement des leucocytes ou la traite à l'aide d'autres stimuli ou des souris transgéniques.

Introduction

Neutrophiles et des monocytes sont des cellules du système immunitaire inné qui circulent en continu dans le sang. Lors de blessure ou d'infection, les signaux inflammatoires induisent diapédèse leucocytaire dans les tissus endommagés et infectés, en entamant le présent mémoire une réponse immunitaire cellulaire 3.1. La rapidité de la mobilisation des leucocytes détermine le résultat positif des réponses immunitaires. Ces processus complexes reposent sur ​​des molécules spécifiques (par exemple, sélectines, des chimiokines de l'endothélium lié) présents sur l'endothélium enflammé qui aident à l'établissement de contacts entre les adhésifs leucocytes circulants et l'endothélium 1-3 .Pour obtenir un aperçu sur les molécules impliquées dans le leucocyte recrutement cascade, il est important de visualiser la cinétique de recrutement de cellules et de suivre le comportement de chaque cellule / population. Une méthode efficace consiste à microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d'intérêt.

contenu "> À ce jour, plusieurs approches en utilisant la microscopie intravitale ont été développés à l'image du système vasculaire 4,5. Par exemple, l'imagerie du derme de l'oreille vasculaire ou des veines mésentériques par microscopie confocale intravitale a été utilisé pour identifier le comportement de patrouille de Ly6C murin faibles monocytes et humaine CD14 dim CD16 + monocytes sur la face luminale de vaisseaux sanguins dans des conditions d'état d'équilibre de 6-8. Le modèle de système vasculaire crémaster de la souris est souvent utilisé pour surveiller le comportement des neutrophiles ou Ly6C inflammatoire élevés monocytes dans des conditions inflammatoires ou ischémiques chez les souris transgéniques. Dans ce cas, crémaster est stimulée par injection de intrascrotale IL1β, CCL2, TNFß ou fMLP. Après 2-4 heures, les tissus sont ensuite chirurgicalement extériorisés et analysés par microscopie confocale intravitale 9-11.

Le protocole suivant décrit un procédé pour surveiller les monocytes et neutrophiles dans le même temps à toutefluorescence inversé de microscope confocal. En outre, notre méthode en détail comment l'image du même navire avant (d'état d'équilibre) et après l'inflammation et comment suivre la cinétique de recrutement des leucocytes. A cet effet, nous utilisons le CX 3 CR1 souris GFP / poids, dont les monocytes expriment eGFP, iv injecté avec une orange neutrophiles murins marqués par un colorant. En utilisant un microscope confocal inversé, il est possible (1) pour suivre et analyser les patrouilles Ly6C faibles monocytes dans des conditions stables et (2) de suivre le recrutement de deux monocytes et neutrophiles dans le même navire après une inflammation locale. Ici, nous créons les conditions inflammatoires en utilisant l'agoniste TLR2 / TLR1 PAM3CSK4 12. En outre, comme l'imagerie peut aider à déterminer le rôle de molécules spécifiques d'intérêt dans les différentes étapes de la cascade de recrutement des leucocytes si elle est effectuée sur des souris knock-out spécifiques ou en présence d'anticorps bloquants 6,9,13.

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Protocole

Nota: Les procédures animaux ont été effectuées en conformité avec le comité d'éthique institutionnel de protection des animaux à Genève, la Suisse et l'Office vétérinaire cantonal. Numéro d'autorisation GE / 63/14.

1. Préparation d'une seule cellule Suspension de la moelle osseuse

  1. Sacrifice des souris (8 à 12 semaines de old) par dislocation cervicale. Stériliser pattes de derrière avec 70% d'éthanol. Enlever la peau des pattes postérieures.
  2. Disséquer les fémurs de souris et les tibias et enlever les tissus des jambes avec un scalpel. Rincer les jambes avec 90% d'éthanol et le placer dans une boîte de culture rempli de PBS.
  3. Sous le capot de la culture, le tissu propre à partir de fémurs et tibias avec un scalpel et séparé à l'articulation du genou. Couper chaque extrémité de l'os.
  4. Rincer la moelle osseuse de l'os à l'aide d'une aiguille de 23G et une seringue de 1 ml avec du milieu rempli de préparation (rouge de phénol libre de DMEM / F12, le sérum de rat à 1%), en une vis 50 ml tube. Perturber agrégats de cellules par passage à travers la délicatesse ne 23Gedle et une seringue de 1 ml. Amener le volume total à 25 ml avec du milieu de préparation.
  5. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C. Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1 ml de globules rouges tampon de lyse RBLC (8,3 g NH 4 Cl, 1 g de NaHCO 3, 1 ml d'EDTA (100 mM), complète à 1 L avec de l'eau distillée, filtre de 0,22 um) dans un 15 ml vis tube. Incuber 30 secondes sur la glace.
  6. Ajouter 10 ml de milieu de préparation et centrifuger à 250 x g, 5 min, 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de milieu de préparation.

2. neutrophiles enrichissement par sélection négative

  1. Ajouter 150 pi de souris enrichissement de neutrophiles cocktail (isolement des cellules de kit de plate-forme tels que EasySep). Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min.
  2. Ajouter 10 ml de phénol DMEM sans rouge. Inversez fois centrifugeuse 250 xg, 3 min, 4 ° C.
  3. Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1,75 ml de milieu de préparation dans 5 ml polystyrène tubes ronds de fond. Ajouter 250 ul BiotSélection en cocktail. Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min.
  4. Vortex les particules magnétiques (du kit de plate-forme d'isolement cellulaire) pendant 30 secondes pour remettre en suspension des particules. Ajouter 500 pi de particules magnétiques à la suspension cellulaire. Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min.
  5. Placer le tube dans l'aimant. Attendre 3 min.
  6. Inversez l'aimant sur un nouveau 5 ml polystyrène tubes ronds en bas pour recueillir les cellules non marquées souhaitées. Ne pas prendre la dernière goutte suspendue dans le tube. Les cellules non désirées restent dans le tube à l'intérieur de l'aimant. Jeter ce tube en déchets biologiques dangereux.
  7. Placez le nouveau tube dans l'aimant. Attendre 3 min.
  8. Inverser l'aimant sur un nouveau tube de 15 ml à vis pour collecter les cellules non marquées souhaitées. Ne pas prendre la dernière goutte suspendue dans le tube.
  9. Complète le volume à 5 ml avec du DMEM sans rouge de phénol.

3. L'étiquetage des neutrophiles

  1. Ajouter 0,5 pi d'un colorant orange, tels que téléphone mobile Tracker Orange (concentration de travail1 pm, SACSM - chlorométhyl-rodol-acétate, stock 10 mM dans le DMSO). Incuber 2 min à 37 ° C.
  2. Ajouter 2,5 ml de milieu de préparation. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C.
  3. Surnageant défausse. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de préparation, dans un tube de 1,5 ml.
  4. Prendre une aliquote de compter avec hématocytomètre.
  5. Incuber 5 min à 37 ° C. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C.
  6. Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1 ml de PBS. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C à laver.
  7. Surnageant défausse. Resuspendre le culot que 10x10 6 cellules par 100 pi de PBS. Garder sur la glace jusqu'à ce que l'injection intraveineuse. REMARQUE: les cellules doivent être iv injecté le plus rapidement possible. 6-12x10 6 neutrophiles / souris sont habituellement obtenue.

4. Préparation de la souris pour Microscopie intravitale

REMARQUE:.. Etape 4.1) et 4.2) doit être effectué au début de l'expérience, afin d'éviter le temps d'attente prolongée des neutrophiles marqués sur ice.

  1. Peser le CR1 GFP souris CX 3 (8-12 semaine ancienne).
  2. Préparer 800 ul d'anesthésiques kétamine (60 mg / kg, xylazine 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg dans du PBS).
  3. Anesthésier la souris. Ip d'injection avec 200 pl / 20 g de souris. Anesthésie de contrôle par l'orteil pincement et en cochant la fréquence respiratoire.
  4. Injecter neutrophiles (10x10 6 cellules dans 100 pi de PBS) par voie intraveineuse en utilisant les veines de la queue latérales ou le sinus rétro-orbitaire, à la convenance de l'expérimentateur.
  5. Placez la souris sur le coussin chauffant et protéger les yeux avec du gel oculaire.
  6. Une lamelle de verre (diamètre 35 mm) est placé dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm, qui a un trou 30 mm de diamètre. Utiliser l'huile est de maintenir la boîte de culture de tissu en contact avec la lamelle.
  7. Inciser la peau abdominale avec des ciseaux pour exposer le péritoine. Inciser péritoine avec des ciseaux pour exposer intestin.
  8. Ajouter 200 ul de PBS (pré-chauffée à 37 ° C) dans la peritoneal cavité. Prenez la souris dans votre main et tournez face vers le bas, de sorte que l'intestin sort de la cavité péritonéale avec une légère pression. Placer la souris dans la boîte de culture tissulaire.
  9. Deroll doucement l'intestin avec des cotons-tiges stériles sur la lamelle afin d'exposer les vaisseaux mésentériques.
  10. Couper des mouchoirs en papier dans les bandes et les mouiller avec 37 ° C chauffé PBS. Immobiliser l'intestin avec les morceaux de tissus en papier pour diminuer les mouvements résultant de péristaltisme.
  11. Mettre le plat de culture de tissus et de la souris à l'intérieur de la chambre thermostatée 37 ° C sur la scène du microscope inversé plateau sur mesure. Présentez une seringue contenant des anesthésiques sc dans la patte arrière. NOTE: En outre, la souris peut recevoir de l'oxygène (0,5 L / min) avec un masque.
  12. La souris de contrôle pour l'anesthésie par orteil pincement et la vérification de la fréquence respiratoire toutes les 30 min. Si nécessaire, fournir un coup de pouce d'anesthésiques (20 pi) de bien entretenir l'anesthésie. NE PASE: Le séchage de la vascularisation doit être évitée. Par conséquent, son humidité est maintenue en mouillant régulièrement les mouchoirs en papier utilisés pour immobiliser l'intestin à 37 ° C et réchauffé PBS.

5. Mesure des neutrophiles et des monocytes Comportement dans les navires enflammées in vivo en utilisant Microscopie intravitale

  1. Set lasers à 488- 561- et à la puissance la plus faible nécessaire pour éviter la phototoxicité induite par laser. Dans nos expériences, il est inférieur à 0,5%. Intensité de la GFP dans les monocytes et colorant orange dans les neutrophiles est si brillante que d'habitude 0,3% est suffisant. NOTE: Cela représente une puissance laser de 0,15 à 0,25 mW avec notre système.
  2. Acquérir des images de 512 x 512 pixels (soit 635 um) à 2.2 sec avec un sténopé ouverte en utilisant l'objectif sèche du microscope inversé 20X. Utilisez un z-profondeur comprise entre 10 à 20 um, qui assure un signal suffisamment avec les puissances laser faible.
    REMARQUE: Nous effectuons habituellement des expériences avec un z-profondeur comprise entre 12 à 1656; m. Dans le cas des chiffres et des films présentés, la profondeur z-est de 20 um. Le contraste de phase permet l'identification des parois endothéliales et l'imagerie est effectuée sur les veines mésentériques. Comme les cellules de patrouille se déplacent assez lentement à une vitesse de 5 à 10 um / min 6, l'enregistrement d'un champ d'intérêt toutes les 20 secondes est satisfaisant. Avec les réglages décrits, la platine motorisée permet l'enregistrement de jusqu'à 7 domaines d'intérêt dans le même temps.
  3. Placez la souris et les vaisseaux mésentériques dans la chambre de thermostat du microscope sont de leur permettre de se remettre de la préparation pendant 30 minutes avant l'acquisition du premier film. Pendant ce temps, choisir plusieurs domaines d'intérêt. Focus sur la surface luminale du vaisseau la plus proche de l'objectif. Si nécessaire, profiter de la légère auto-fluorescence de l'endothélium pour définir le focus.
    REMARQUE: Chirurgie lors de la préparation de la souris souligne légèrement l'endothélium. Par conséquent, le produit laminé de neutrophiles et/ ou des monocytes peuvent être observés dans la première préparation suivante de 15 min de la souris.
  4. Enregistrer un premier film pendant 30 min dans des conditions d'état stable, une image toutes les 20 secondes.
    REMARQUE: Le logiciel acquiert chaque champ d'intérêt en 2.2 sec et la platine motorisée se déplace automatiquement d'un champ à l'autre. Elle remonte à la première position dans les 20 secondes pendant les 30 min de l'enregistrement du film.
  5. Pour lancer inflammation des vaisseaux sanguins, ajouter une goutte de 20 pi de PBS contenant 100 ug de TLR2 / TLR1 agoniste PAM3CSK4 12 directement sur ​​les vaisseaux imagées.
  6. Contrôler la mise au point pour chaque domaine d'intérêt.
    NOTE: Dans le cadre de l'acquisition, il ya toujours de légers changements de focalisation sur l'axe z. Malgré le 10-20 um z profondeur, ce qui peut entraîner une diminution de l'intensité de fluorescence. Par conséquent, recentrer manuellement chaque champ d'intérêt à la fin de chaque film, si nécessaire. Enregistrez des vidéos pendant 30 min-périodes et jusqu'à 3 h pourtal après l'initiation de l'inflammation.
  7. A la fin de l'expérience, les souris anesthésiée sacrifice par dislocation cervicale.

6. génération de fichiers vidéo et de suivi des leucocytes

REMARQUE: Le logiciel d'acquisition Nikon génère .nd2 fichiers, mais la procédure suivante serait similaire avec d'autres logiciels et les marques.

  1. Exportation de fichiers que la série TIFF.
  2. Accédez au logiciel ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importez la série de tiff. Chaque canal dans un fichier différent.
  3. Appliquer un filtre médian avec un rayon de 2.0 pixel pour les canaux vert et rouge pour réduire le bruit de fond (Processus> Filtres> médians ...).
  4. Convertir des fichiers en binaire (Processus> Binary> Faire binaire). Activer le logiciel pour calculer le seuil pour chaque image.
  5. Fusionner canaux dans un seul séries d'images (Image> Couleur> Fusionner les couches ...). Sélectionnez les monocytes dans le degrécanal n, les neutrophiles dans le canal rouge et la lumière transmise dans le canal gris.
  6. Convertir images empilées en couleurs RVB (Image> Couleur> pile pour RGB).
  7. Enregistrer le fichier .avi que
  8. Les données sont importées et compilées dans un logiciel Imaris (Bitplane). Mouvements de monocytes et les neutrophiles sont ensuite suivis à l'aide de l'Assistant Suivi Spot.

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Résultats

Le manuscrit décrit un protocole optimisé pour contrôler facilement le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques de souris anesthésiées en temps réel. L'utilisation d'une chambre de 37 ° C-thermostatée est impératif de maintenir la température de la souris et également en raison du mouvement des leucocytes dépendant de la température. Préparation de la souris est affiché sur la figure 1. La figure 2 montre l'ensemble de la zone vu au micros...

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Discussion

Les méthodes décrites dans ce manuscrit fournissent une approche cohérente pour étudier efficacement monocytes et le comportement des neutrophiles dans les veines mésentériques dans des conditions stables et inflammatoires.

L'étape cruciale de la préparation est l'immobilisation de l'intestin avec des tissus PBS-mouillées. Si effectué correctement, les vaisseaux mésentériques sont joliment exposés sur la lamelle pour l'acquisition d'image. Cela permet la sélection de plus...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’EMBO (à Y.E.), la Fondation Machaon (à Y.E.) et le FNS (à B.A.I.). Nous remercions la plateforme de bioimagerie pour la disponibilité du microscope Nikon A1r et l’assistance technique. Nous remercions Mme Clarissa Bartley pour la correction en anglais.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à fond rond en polystyrène de 5 ml  ;Beckton Dickinson352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45  ;   ; DT :4mm  ;Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT :1mm  ;Nikon
Cell Tracker Orange CMRA DyeLife TechnologiesC34551
EasySep AimantStem Cell Technologies18000
EasySep Souris Kit d’enrichissement des neutrophilesStem Cell Technologies19762
EDTASigma AldrichE6758
FCSPAAA15-042
Huile d’immersion Type ANikonn’importe quelle huile visqueuse  ;
Life Box Système de contrôle de la températureLife Imaging
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NH4ClSigma AldrichA9434
Microscope confocal Nikon A1RNikonA1R, platine x/y/z motorisée, logiciel NIS elements PBS
Life TechnologiesD8537
sans rouge de phénol DMEM/F12Life Technologies21041-025tout milieu sans rouge de phénol convient
PAM3CSK4Invivogentlrl-pmsreconstitue dans le
sérum de ratTechnologies de cellulesincluses dans EasySep Kit d’enrichissement des neutrophiles de souris Boîte de
culture tissulaire 100TPP93100
Microscope inversé PBS souches

Références

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
  3. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
  4. Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
  5. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
  6. Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
  7. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
  8. Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
  9. Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
  10. Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
  11. Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
  12. Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
  14. Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
  15. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
  16. Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
  17. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109(2011).

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