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Article de méthode

Préparation et Photoacoustique Analyse des véhicules cellulaires contenant de l'or nanorods

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DOI :

10.3791/53328

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2 mai 2016

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1Institute of Applied Physics, Italian National Research Council, 2Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences, University of Florence, Firenze, 3Department of Physics and Astronomy, University of Florence, Sesto Fiorentino, 4Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna

Dans cet article

Résumé

Nous montrons la préparation et abordons la faisabilité de véhicules cellulaires contenant des nanotiges d’or pour l’imagerie photoacoustique du cancer.

Résumé

nanotiges d'or sont attrayants pour une gamme d'applications biomédicales telles que l'ablation photothermique et l'imagerie photoacoustique du cancer, grâce à leur absorbance optique intense dans la fenêtre proche infrarouge, une faible cytotoxicité et le potentiel de la maison dans les tumeurs. Cependant, leur livraison à des tumeurs reste encore un problème. Une approche innovante consiste en l'exploitation du tropisme des macrophages associés aux tumeurs qui peut être chargé avec nanotiges d'or in vitro. Ici, nous décrivons la préparation et l'inspection photoacoustique des véhicules cellulaires contenant nanotiges d'or. PEGylés nanotiges d'or sont modifiées avec des composés d'ammonium quaternaire, afin d'obtenir un profil cationique. En cas de contact avec les macrophages murins dans des boîtes de Petri ordinaires, ces particules se trouvent à subir une utilisation massive dans des vésicules d'endocytose. Ensuite, ces cellules sont noyés dans des hydrogels biopolymères, qui sont utilisés pour vérifier que la stabilité de la conversion photoacoustiquedes particules est retenue dans leur inclusion dans des véhicules cellulaires. Nous sommes convaincus que ces résultats peuvent fournir une nouvelle source d'inspiration pour le développement de nouvelles stratégies pour délivrer des particules plasmoniques à des tumeurs.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, diverses particules plasmoniques telles que nanotiges d'or, nanobilles et nanocages, ont reçu une attention considérable pour les applications en optique biomédicale 1, 2, 3, 4. En contradiction avec les nanosphères d'or standard, ces particules nouvelles résonnent dans la fenêtre proche infrarouge (NIR) qui prévoit la plus profonde pénétration optique à travers le corps et le plus haut contraste optique sur les composants endogènes 1. Cette fonction a suscité un intérêt pour des applications innovantes, telles que la photoacoustique (PA) imagerie et l'ablation photothermique du cancer. Cependant, plusieurs problèmes freinent la pénétration clinique de ces particules. Par exemple, leur activation optique tend à induire leur surchauffe et de modifier leurs formes fonctionnelles vers des profils plus sphériques, qui entraîne un photoinstabilité 5, 6, 7, 8 sup>, 9. Une autre question qui domine le débat scientifique est leur administration systémique dans les tumeurs. En particulier, nanotiges d'or combinent tailles qui sont idéales pour imprégner les tumeurs qui présentent une perméabilité accrue et la rétention et la facilité de conjugaison avec des sondes spécifiques de marqueurs malignes. Par conséquent, leur préparation pour une injection directe dans la circulation sanguine est perçue comme un système réalisable 10, 11, 12, 13. Cependant, cette voie reste problématique, avec la plupart des particules devenant capturées par le système phagocytaire mononucléaire 10, 11, 12. En outre, un autre problème réside dans la stabilité optique et biochimique des particules après circulation à travers le corps 14. Lorsque les particules perdent leur stabilité et de l' agrégat colloïdale, leurs caractéristiques plasmon et la dynamique du transfert de chaleur peuvent souffrir de couplage plasmonique 15, 16, 17 et contre-surchauffe 18.

Plus récemment, la notion d'exploiter le tropisme des macrophages associés aux tumeurs est apparue comme une solution de rechange à puce 19, 20, 21. Ces cellules détiennent une capacité innée à détecter et infiltrer les tumeurs avec une grande spécificité. Par conséquent, un point de vue peut être d'isoler ces cellules d'un patient, de les charger avec nanorods or in vitro, puis de les injecter dans le patient, avec l'intention de les utiliser comme véhicules cellulaires en charge de la livraison. Un autre avantage serait de gagner plus de contrôle sur la stabilité optique et biochimique des particules, en raison de leur interface biologique serait construit in vitro. Pourtant, les performances de ces véhicules cellulaires comme agents de contraste optiques ont besoin d'une analyse critique.

Dans ce travail, nous décrivons la préparation et les questions critiques de Cellulvéhicules ar contenant nanotiges d'or pour l'imagerie PA du cancer. PEGylés nanotiges d'or sont modifiées avec des composés d'ammonium quaternaire 22, afin d'obtenir un profil cationique qui devrait favoriser leurs interactions avec les membranes plasmatiques 23, 24. Ces particules subissent l'absorption efficace et non spécifique de la plupart des types cellulaires, nous l'espérons, sans interférer beaucoup avec leurs fonctions biologiques. macrophages murins sont chargés avec jusqu'à moins de 200, 000 nanotiges d'or cationiques par cellule, qui deviennent confinées dans les vésicules d'endocytose serrés. Cette configuration devrait se poser problème, en raison de la menace de couplage plasmonique et le contre-surchauffe à l'intérieur de ces vésicules. Par conséquent, les macrophages sont noyés dans des hydrogels biopolymères qui imitent les tissus biologiques, afin de vérifier que la majeure partie de la stabilité de la conversion PA des particules est retenue dans le transfert du milieu de croissance des vésicules d'endocytose. effectivles critères de mesure de e sont élaborés afin de mesurer la stabilité de la conversion PA dans des conditions d'intérêt immédiat pour l'imagerie PA. Un seuil remodelage est réglé au début même de l'instabilité optique après un train de 50 impulsions laser avec le taux de répétition typique de 10 Hz.

Nous sommes convaincus que ces résultats peuvent donner une impulsion pour le développement de nouvelles stratégies pour délivrer des particules plasmoniques à des tumeurs.

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Protocole

Note: Toutes les concentrations de nanotiges d'or sont exprimés en termes de nominal Au molarités. A titre de comparaison avec d'autres œuvres, notez que 1 M Au correspond à peu près à 20 uM nanotiges d'or, dans notre cas.

1. Préparation de Cationic Or nanorods

Remarque: La méthode commence avec la synthèse du bromure de cétrimonium (CTAB) -capped nanotiges d'or par réduction autocatalytique de HAuCl 4 avec de l' acide ascorbique, selon le protocole présenté par Nikoobakht et al 25 , et adapté en fonction des Ratto et al 26... Ensuite , ces nanotiges or sont modifiées afin d'obtenir plus de biocompatibilité et de l' affinité pour les membranes plasmatiques, par la combinaison de polyéthylène - glycol brins 10, 11, 27, 28 et des composés d'ammonium quaternaire 22.

  1. Purifier 24 ml nanorods or CTAB-plafonnés à un Concentration de 450 uM Au par deux cycles de centrifugation (12 000 xg, 30 min) et décantation. Assurez-vous que le rapport du volume mort au volume initial est d'environ 1/200 ou plus bas pour toutes les étapes de centrifugation dans ce protocole. Utiliser CTAB 500 um aqueuse comme une solution de lavage et enfin transférer les particules dans 6 ml de tampon acétate 100 mM à pH 5 contenant 500 uM de CTAB et 0,005% (v / v) de polysorbate 20.
  2. Ajouter 30 pi 10 mM aqueux alpha-méthoxy-oméga-mercapto-poly (éthylène glycol) (MW ~ 5000) et laisser réagir pendant 30 min à 37 ° C.
  3. Ajouter 30 ul de 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N bromure de triméthylammonium dans du diméthylsulfoxyde et de laisser au repos pendant 24 heures à 37 ° C.
  4. Ensuite, ajouter 18 ml de 0,005% (v / v) de polysorbate 20 dans de l'eau et on purifie ces particules par quatre cycles de centrifugation (12 000 xg, 30 min) et décantation. Utiliser 0,005% (v / v) de polysorbate 20 dans l'eau comme solution de lavage et enfin transférer les particules dans du PBS stérile 2,4 ml à un pH7.4. La concentration nominale finale de l'or est de 4,5 mM.

2. Chargement des macrophages murins avec or nanorods

  1. Utiliser la lignée cellulaire de monocytes / macrophages J774A.1 et du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 1 mM de glutamine, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine en tant que milieu de culture. Plate 5 x 10 5 cellules dans quatre boîtes de Pétri de 60 mm de diamètre et leur permettre de se développer pendant 24 heures, de manière à être subconfluent au moment du détachement (voir étape 2.2).
    1. Tout au long du protocole, de maintenir les cellules dans des conditions standard de culture (37 ° C, 5% de CO2, 95% d' air et 100% d' humidité relative). Utilisez une hotte à flux laminaire et de l'équipement de protection individuelle approprié pour manipuler les cellules.
  2. Après 24 h, charger les cellules avec cationiques nanotiges d'or et les préparer à être intégré dans des films de chitosane:
    1. Afin de permettre aux particules d'être absorbées par les cellules, ajouter une portion aliquote de 4,5mM Au nanotiges d'or cationique dans PBS dans chaque boîte de Pétri, de manière à parvenir à une concentration finale de 100 uM Au. Laissez les boîtes de Pétri en incubation pendant 24 heures.
    2. Ensuite, observer les cellules sous un microscope optique pour confirmer leurs bonnes conditions et le téléchargement. Les cellules doivent présenter leur morphologie normale et un certain nombre de vésicules intracellulaires sombres. Détacher les cellules par un racleur, fusionner ceux de deux boîtes de Petri, afin d'obtenir une quantité appropriée de cellules pour les étapes suivantes (au moins 2 x 10 6 cellules) et centrifuger les (120 x g, 6 min) pour éliminer toute excès de nanotiges d'or cationiques. Le culot cellulaire devrait ressembler presque noir.
    3. Suspension le culot dans 2 ml de PBS et compter les cellules par l'utilisation d'une chambre Bürker. Centrifuger une suspension contenant 2 x 10 6 cellules (120 xg, 6 min) et fixe leur culot dans 2 ml de 3,6% (p / v) de formaldehyde dans du PBS pendant dix minutes à la température ambiante. Enfin, lavez cette pastille à trois reprises par centrifugation (120 xg, 6 min) afin d'éliminer le fixateur. En utilisant du PBS comme solution de lavage.

3. Embedment de Macrophages en chitosane Films

Remarque: Les propriétés particulières de chitosane 26, 27, 28, 29 sont exploités pour produire des fantômes biomimétiques contenant des macrophages colorés avec nanotiges d'or cationiques. En ce qui concerne d' autres hydrogels tels que l' agarose, le chitosane permet des films qui sont beaucoup plus forts et plus mince, ce qui est essentiel pour la microscopie PA 6. La fabrication de ces fantômes est effectuée selon des protocoles antérieurs 29, 30, 31 , avec quelques modifications imposées par les 30 suivants.

  1. Préparer un acidifiée (pH 4,5, obtenu par addition d'acide acétique) et visqueux à 3% (p / v) de chitosan de faible poids moléculaire (poids moléculaire moyen de 120 kDa), la solution, bien mélanger etlaisser homogénéiser pendant 24 heures à 40 ° C.
  2. Ensuite, mélanger les macrophages murins contenant nanotiges d'or cationique (2 x 10 6 cellules) avec 500 pi de solution de chitosane.
  3. Afin d'obtenir ~ 50 um d' épaisseur fantômes, verser 250 mg du mélange dans 1,91 cm 2 moules en polystyrène et les laisser sous un courant d'azote pendant 24 heures. Par la suite, le traitement de ces échantillons avec 500 ul de NaOH 1 M, afin d'induire la réticulation, et les rincer avec 10 ml d'eau ultrapure.

4. Contrôle de la stabilité de la conversion Photoacoustique

Remarque: La stabilité de conversion PA est étudiée au moyen d'expériences PA avec la configuration fait maison qui est décrite dans la référence 6.

  1. Suspendre un film de chitosan contenant les macrophages dans l'eau déminéralisée, par exemple par l'utilisation d'un support en plastique immergé dans une boîte de Petri, de manière à garder une distance d'environ 5 mm du fond de la plaque. Mettez cette plaque sur un étage XY micrométriqueafin de contrôler la position de l'échantillon.
  2. Focaliser un faisceau laser avec ~ 5 durée nsec d'impulsion en résonance avec la bande plasmonique longitudinale des nanotiges d'or (par exemple, provenant d' un oscillateur paramétrique optique pompé par la troisième harmonique d'un laser Nd Q-switché: YAG laser avec une longueur d'onde de 400 - 2500 durée nm et impulsion de 5 nanosecondes) perpendiculaire à la surface du film avec un diamètre de spot ~ 300 um.
    1. Placer un atténuateur en face de la sortie du laser pour régler la fluence du laser et en utilisant un diviseur de faisceau pour focaliser une partie du faisceau laser à un compteur d'énergie (par exemple, un détecteur pyroélectrique) , et surveiller les variations de fluence. Maintenir la fluence optique en dessous de ~ 1 mJ / cm 2 par impulsion pendant l'alignement. Porter des lunettes de sécurité laser appropriée chaque fois que le laser est activé.
  3. Trempez un transducteur à ultrasons (plage de fréquence de 1 - 20 MHz) dans la boîte de Pétri ~ 2 mm hors de la surface du film et ajuster sa position en utilisant les traductions micrométriqueset les étapes de rotation pour maximiser le signal émis PA à partir du film.
  4. Déterminer une fluence de la sonde F LO qui ne porte pas atteinte à l'échantillon 6:
    1. Irradier un point de l'échantillon aléatoire à une fluence environ 1 mJ / cm 2 par impulsion pour au moins 500 impulsions. Pour chaque impulsion, PA acquérir le signal correspondant à partir du transducteur à ultrasons et la fluence laser provenant du compteur d'énergie à un oscilloscope. Nom de la fluence moyenne comme essai F LO.
    2. Calculer l'intensité du signal PA en tant que son amplitude crête à crête en fonction du nombre d'impulsions. Afin de contrepoids aux fluctuations d'intensité du laser, de normaliser l'amplitude de chaque signal PA au rapport de sa propre fluence procès F LO. Analyser l'évolution de l'intensité normalisée PA en fonction du nombre d'impulsions et de vérifier sa stabilité dans le temps.
    3. Dans le cas d'instabilité, répétez les étapes 4.4.1 à 4.4.3 avec une valeur inférieure de F LO procès. Dans le cas de la stabilité, répétez - les avec une valeur de procès F LO supérieur de ~ 10%, jusqu'à ce qu'une perte de stabilité se pose. Réglez la sonde fluence F LO que la deuxième valeur la plus élevée de l' épreuve F LO qui assure la stabilité.
  5. Mesurer un seuil fluence remodelant:
    1. Choisir un autre point de l'échantillon aléatoire et sonder une intensité moyenne PA (I LO a) plus de 500 impulsions à F LO.
    2. Définir une fluence nominale supérieure à F LO et de fournir 50 impulsions. Nom de leur fluence moyenne comme F exc.
    3. Sonde à nouveau une intensité moyenne PA (I LO b) de plus de 500 impulsions à F LO. Calculer le ratio R = I LO b / I LO a. Une valeur de R inférieure à l'unité donne la preuve d'un changement irréversible des propriétés optiques de l'échantillon.
    4. Utilisez la scène XY micrométrique pour déplacer le film et changer le point de l'échantillon au hasard. Répétez les étapes 4.5.1 à 4.5.4 avec différentes valeurs de F exc, de manière à prendre quelques valeurs de R ci - dessous, autour et au-dessus de l' unité. 15 points sont raisonnables.
    5. Parcelle R en fonction de F exc et identifier le seuil de reprofilage fluence F th en tant que valeur lorsque R commence à varier d'une au - delà de l' incertitude statistique. 6

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Résultats

Ici, la faisabilité des véhicules cellulaires contenant nanotiges d'or pour l'imagerie PA du cancer est montré ainsi que les résultats typiques du protocole.

Les images TEM dans la figure 1 montrent l'aspect habituel des particules après l' étape 1 et de leurs véhicules cellulaires après l' étape 2. La préparation des particules et des cellules pour l' imagerie TEM est décrit ailleurs <...

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Discussion

La notion de cibler les macrophages associés aux tumeurs est en train de devenir un concept puissant pour lutter contre le cancer 34, 35, 36. Ici, au lieu de leur destruction, ces cellules sont recrutés en tant que véhicules cellulaires pour apporter nanotiges d'or dans une tumeur, par l'exploitation de leur tropisme. Cette perspective exige une conception réfléchie des particules, leur intégration dans les cellules et leur caractérisation. Nous avons consta...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Ce travail a été partiellement financé par Regione Toscana et de la Communauté européenne dans le cadre de la BUBBLE ERANET + Projects LUS et BI-TRE.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bromure d’hexadécyltriméthylammoniumSigma-AldrichH6269Pour synthétiser des nanotiges d’or Chlorure
d’or(III) trihydratéSigma-Aldrich520918Pour synthétiser des nanotiges d’or
Nitrate d’argent Sigma-AldrichS6506Pour synthétiser des nanotiges d’or
Acide L-ascorbiqueSigma-AldrichA5960Pour synthétiser des nanotiges d’or
Borohydrure de sodiumSigma-AldrichPour synthétiser des nanograines d’or
MeO-PEG-SHIris BiotechPEG1171Pour pégyler des nanotiges d’or. Poids moléculaire environ 5 000 Da.
Acide acétiqueSigma-Aldrich320099Pour pégyler des nanotiges d’or et solubiliser du chitosane
Acétatede sodium Sigma-AldrichS8750Pour PEGyler des nanotiges d’or
(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-bromure de triméthylammoniumSigma-Aldrich733305Pour modifier des nanotiges d’or avec des composés d’ammonium quaternaire
DiméthylsulfoxydeSigma-Aldrich276855Pour solubiliser (11-mercaptoundécyl)-N,N,N-bromure de triméthylammonium
Polysorbate 20Sigma-AldrichP2287Pour centrifuger les nanotiges d’or pégylées
PBSLonzaBE17-516FPour suspendre les nanotiges d’or avant l’incubation avec des cellules et pour traiter les pastilles de cellules
J774a.1ATCCTIB-67Lignée cellulaire murine monocyte/macrophage
DMEMLonzaBE12-707FMilieu de culture cellulaire
FBSLonzaDE14-801FÀ ajouter au milieu de culture cellulaire
L-glutamineLonzaBE17-605EÀ ajouter au milieu de culture cellulaire
Pénicilline/streptomycineLonzaDE17-602EÀ ajouter au milieu de culture cellulaire
Boîte de PétriNEST705001Culture cellulaire Racleur
de cellulesEuroCloneES7018Pour détacher les cellules
FormaldéhydeFluka47630Pour fixer les cellules
Chitosane, de faible poids moléculaireSigma-Aldrich448869désacétylé à 75-85 %. Poids moléculaire environ 120 000 Da.
Hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich306576Pour insolubiliser le chitosane et générer l’hydrogel
Plaques de culture cellulaire en polystyrèneNEST702011Utilisé comme moule pour fabriquer des hydrogels de chitosane
Oscillateur paramétrique optique pompé par la troisième harmonique d’un laser Nd :YAG Q-switchedContinuum, Santa Clara, USASurelite OPO plusSource d’excitation optique pour les tests photoacoustiques
Détecteur pyroélectrique  ;Gentec, Québec, CanadaQE8SPPour surveiller la fluence optique pour les tests photoacoustiques
Hydrophone à aiguille pré-amplifiéPrecision Acoustic, Dorset, Royaume-UniModèle avec diamètre de capteur de 1 mm et gamme de fréquences de 1 à 20 MHzPour mesurer les signaux photoacoustiques

Références

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