Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Résumé

Ce protocole décrit l'utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR) pour détecter l'ARNm spécifique de cellules tumorales représentant métastase dans le tissu pulmonaire de souris.

Résumé

La maladie métastatique est la propagation des cellules tumorales malignes du site primaire du cancer à un organe éloigné et est la cause principale du cancer du décès associés ^1. Des sites communs de dissémination métastatique comprennent poumons, ganglions lymphatiques, le cerveau et la moelle ^2. Les mécanismes qui conduisent les métastases sont des zones intenses de recherche sur le cancer. Par conséquent, les dosages efficaces pour mesurer la charge métastatique dans des sites éloignés de métastases sont essentiels pour la recherche sur le cancer. Évaluation des métastases pulmonaires dans des modèles de tumeurs mammaires est généralement effectuée par l'observation qualitative brute de tissu pulmonaire après dissection. Les méthodes quantitatives d'évaluation des métastases sont actuellement limités à ex vivo et des techniques d'imagerie in vivo en fonction nécessitant des paramètres définis par l'utilisateur. Un grand nombre de ces techniques sont au niveau de l'organisme entier plutôt qu'au niveau cellulaire ^6.3. Bien que les nouvelles méthodes d'imagerie utilisant la microscopie multi-photons sont en mesure d'évaluer metasTASIS au niveau cellulaire ^7, ces procédures très élégantes sont plus adaptés à l'évaluation des mécanismes de diffusion plutôt que l'évaluation quantitative de la charge métastatique. Ici, une méthode in vitro simple d'évaluer quantitativement la métastase est présenté. Utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR), de l'ARNm spécifique de cellules tumorales peut être détecté dans le tissu pulmonaire de souris.

Introduction

Analyse QRT-PCR est proposée comme méthode d'évaluation de la métastase tumorale. Cette méthode est proposé comme une alternative pour les utilisateurs qui sont intéressés à évaluer les métastases, mais peuvent ne pas avoir accès à des équipements spécifiques tels que les équipements d'imagerie in vivo ou un stéréoscope capable de fluorescence. Une discussion des méthodes couramment utilisées est présenté suivi d'une démonstration de la façon dont l'analyse QRT-PCR peut être utilisée soit comme distinct ou comme une méthode complémentaire pour évaluer les métastases. Cette procédure a le potentiel de fournir une analyse quantitative de la cha....

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices et les normes de protection des animaux de l'Université médicale de Caroline du Sud (MUSC) et son institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC).

1. Lung Dissection

1. Dissection de la tumeur mammaire (en option selon les objectifs de l'étude et si l'analyse de la tumeur primaire ou veine de la queue injection a été effectuée).
   1. Euthanasier la souris en utilisant une dose létale de l'isoflurane selon IACUC et la réglementation de l'université. Confirmez euthanasie par dislocation chirurgicale.
   2. Le panneau de mousse, broches avec broches de disse....

Résultats

Au-delà du temps nécessaire pour effectuer l'inoculation initiale des cellules tumorales dans l'animal expérimental et si la scène, primaire dans l'analyse de tumeur in vivo, la récolte des tissus, l'isolement de l'ARN et l'analyse QRT-PCR est un procédé de 1-2 jours (Figure 1) .

Un exemple d'analyse est l'imagerie bioluminescente brut pour évaluer les cellules.......

Discussion

Ce protocole décrit l'utilisation de QRT-PCR pour évaluer mammaire métastatique des cellules tumorales dans le poumon en utilisant un modèle de xénogreffe de souris. Il est reconnu que d'autres techniques, y compris l'imagerie bioluminescente, sont disponibles et sont également efficaces pour détecter les métastases malgré leurs propres valeurs et limites. Les données présentées suggèrent que QRT-PCR fournit une mesure efficace de la détection de l'ARNm d'origine tumorale dans le tissu pulmonaire pou.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-mercaptoéthanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet Kit d’isolement de l’ARN	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix pour QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix  ;	Bio-Rad	172-5121  ;
Essai vert PrimePCR SYBR : ERBB2, Humain  ;	Bio-Rad	100-25636  ;
Modèle PrimePCR pour le test SYBR Green : ERBB2, Human  ;	Bio-Rad	100-25716  ;
gapdh séquence d’amorces			pour-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG