Neuronal Tracing dans des explants de cerveau à guidage laser

Summary

Nous décrivons une technique d'étiqueter les neurones et leurs processus via antérograde ou rétrograde traceurs injections dans les noyaux du cerveau en utilisant une préparation in vitro. Nous avons modifié une méthode existante de i n vitro traceur électroporation en profitant de marqué par fluorescence mutants de souris et de l'équipement optique de base afin d'augmenter la précision de l'étiquetage.

Abstract

Nous présentons une technique qui combine un protocole vitro traceur dans d'injection, qui utilise une série d'impulsions électriques et de pression pour augmenter l'absorption du colorant par électroporation dans des explants de cerveau avec un éclairage laser ciblée et correspondant à des lunettes filtrantes pendant la procédure. La technique décrite de l'électroporation in vitro par lui-même des rendements relativement bon contrôle visuel pour ciblant certaines zones du cerveau. En combinant avec excitation laser de marqueurs génétiques fluorescentes et leur lecture à travers des lunettes de filtre bande-passe, qui peut ramasser les émissions des cellules / noyaux génétiquement marqués et le colorant de traçage fluorescent, un chercheur peut augmenter considérablement la précision des injections en trouvant la zone d'intérêt et contrôle de la propagation de colorant / absorption dans la zone d'injection beaucoup plus efficacement. En outre, la technique d'éclairage au laser permet d'étudier la fonctionnalité d'une neurocircuit donnée par provIding informations sur le type de neurones se projetant dans une certaine zone dans les cas où l'expression de la GFP est liée au type d'émetteur exprimé par un sous-population de neurones.

Introduction

Afin de définir un certain neuronale (micro) circuit, il faut commencer par trouver les différents acteurs de ce circuit, et leur mode de connexion. Depuis la publication de Waller propos neurofiber traçage travers lesioning ¹ une grande variété de techniques de traçage neuroanatomiques a été établi. Certaines de ces techniques peuvent être appliquées dans les tissus post-mortem ^2-4 fixe, d'autres comptent sur ​​le transport actif du colorant dans les neurones vivants, comme l'a découvert en 1971 ^5-6. Celui-ci peuvent être subdivisés en deux groupes de discrimination entre les méthodes qui prennent avantage de rétrograde activ....

Protocol

1. Génotypage optique

1. optique génotypage des chiots souris

1. Arrivée à l'expression du marqueur fluorescent respectif au moyen d'un pointeur laser de la longueur d'onde d'excitation appropriée (405 nm dans les expériences décrites ici) et des lunettes de filtre de blocage de la longueur d'onde d'excitation correspondant, mais en passant la longueur d'onde d'émission (450 - 700 nm dans les expériences décrites ici) . Dirigez le pointeur laser à l'arrière de la tête ou de la moelle épinière du chiot de la souris (voir la figure 1). Évitez de diriger le laser dans les yeux et une ....

Results

Figures 1 et 2 montrent comment le pointeur laser et lunettes laser peuvent être utilisés pour le génotypage rapide et peu coûteuse GFP animaux positifs d'une portée. Dans les cas de jeunes souriceaux, la technique peut être utilisée pour identifier de manière non invasive l'étiquette de la GFP dans le cerveau de l'animal à travers le crâne et la peau sus-jacente (figure 1A - D). Fluorescence émise peut être vu à travers la peau et le crâne des souriceaux au moins jusqu'au jour postnata.......

Discussion

A force générale in vitro traceur électroporation, par opposition aux études in vivo de traçage, est qu'il donne aux chercheurs un meilleur accès à la zone du cerveau d'intérêt et, par conséquent, ne comporte pas stéréotaxique coûteuse (et souvent électrophysiologique) équipement. En outre, la période de survie requis pour les explants de cerveau couvre seulement quelques heures (1 - 4) au lieu des jours, voire des semaines dans le cas d'in vivo injections de traceurs (voir un exam.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich	S7653	Tous les produits chimiques proviennent de Sigma-Aldrich, sauf indication contraire.
Chlorure de potassium  ;		P9333
Phosphate de potassium monobasique		P5655
Phosphate dibasique		de sodium S907
Chlorure		M2670
Chlorure		C5080
Glucose		G7528
Bicarbonate		S6297
Acide		A4544
Myo-inositol		I5125
Pyruvate		P2256
Albumine		A2153	en option, pour une (immuno)histochimie supplémentaire
Triton-X-100		X100 en	option, pour une (immuno)histochimie supplémentaire
Poly(éthylène glycol), 8000 MW		P2139	en option, pour le nettoyage du cerveau
Formamide	Fisher Scientific	F84	en option, pour le nettoyage du cerveau
Sous-unité de cholératoxine-b	Sondes moléculaires	C-34776 (Alexa 555)  ;
Sondes moléculaires	de dextrane tétraméthyl-rhodamine	D-7162 (Alexa 555)
Nissl	Invitrogen	fluorescent N-21479 (bleu)
facultatif Paraformaldéhyde	Fisher Scientific	SF93
Agarose	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus  ;
Filaments de verre borosilicaté	Harvard Apparatus	G150F-10
Extracteur de pipette	Zeitz Instruments, Allemagne	DMZ Universal Puller
Configuration de perfusion	Pointeur laser sur
;	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
Filtre/lunettes de sécurité	Dragon Lasers, Chine	LSG09 (passe-bande 450-700 nm)
Microscope bionoculaire  ;	Wild Heerbrugg, Suisse	Wild M3	Équipé d’un illuminateur de haute intensité (MI-150 ; Dolan-Jenner Inc.)  ;
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC avec logiciel MC Stimulus installé	Systèmes multicanaux, Allemagne (logiciel)
Stimulateur 2 canaux	Systèmes multicanaux, Allemagne	STG-1002
Unité d’isolation de stimulation	A.M.P.I., Israël	Micromanipulateur Iso-Flex
	Narishige, Japon	YOU-1
Vibratome	Leica, Allemagne	VT1000S