Utilisation Sensillum simple enregistrement pour détecter les réponses olfactive Neuron des punaises de lit à écomones

Résumé

Les punaises de lit dépendent des neurones récepteurs olfactifs logés dans leur sensille olfactive antennaire pour détecter les substances sémiochimiques dans l’environnement. À l’aide de l’enregistrement d’un seul sensillum, nous démontrons une méthode pour évaluer la réponse des punaises de lit aux substances sémiochimiques et explorons le processus de codage impliqué.

Résumé

Le système olfactif d'insecte joue un rôle important dans la détection de substances sémiochimiques dans l'environnement. En particulier, le sensilla antennaire qui abritent les neurones simples ou multiples à l'intérieur, sont considérés comme de faire la contribution majeure dans la réponse aux stimuli chimiques. En enregistrant directement potentiel d'action dans le sensille olfactive après une exposition à des stimuli, enregistrement sensille simple (SSR) technique offre une approche puissante pour étudier les réponses de neurones d'insectes à des stimuli chimiques. Pour la punaise de lit, qui est un parasite humain notoire, plusieurs types de sensille olfactive ont été caractérisés. Dans cette étude, nous avons démontré réponses neurales de la punaise de lit sensilla olfactive à deux stimuli chimiques et les réponses dose-dépendante à l'un d'eux en utilisant la méthode SSR. Cette approche permet aux chercheurs de procéder à un dépistage précoce pour les stimuli chimiques individuels sur la punaise de lit olfactive sensilles, qui fourniraient des informations précieuses pour le develloppement de nouveaux attractifs de punaises de lit ou des répulsifs et des avantages du lit efforts de contrôle de bogue.

Introduction

La punaise de lit commun Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), comme ectoparasites temporaire, est un insecte suceur de sang obligatoire, ce qui signifie leur survie, le développement et la reproduction ont besoin de sources de sang provenant d'hôtes, y compris les humains et les animaux ^1,2. Bien que la transmission du virus a été rarement rapportée dues à C. lectularius, la nuisance due aux piqûres générée par une infestation affecte sérieusement hôtes à la fois physiquement et psychologiquement ^3. L'introduction et l'utilisation généralisée des insecticides chimiques, en particulier le DDT, abaissé le risque d'infestations et à la fin des années 1950, les infestations étaient à un niveau tellement bas qu'ils ne sont plus une préoccupation publique sérieuse. Cependant, un certain nombre de facteurs possibles ont conduit à la résurgence des populations de punaises de lit dans le monde entier, tels que l'utilisation réduite d'insecticides, une baisse de la sensibilisation du public, augmentation de l'activité voyager, et le développement de la résistance aux insecticides ^4-9.

Signaux chimiques dans l'environnement sont détectés et reconnus par des insectes à travers les organes olfactifs telles que des antennes et des palpes maxillaires. Le sensilles olfactives sur les antennes des insectes jouent un rôle crucial dans la détection de ces signaux chimiques. Les molécules chimiques entrent dans la cuticule des antennes à travers les pores sur la surface de la cuticule. Odorant protéines de liaison dans la lymphe bind antennaire à ces molécules chimiques et les transporter sur les récepteurs olfactifs ^10. Les récepteurs olfactifs et leur co-récepteur à partir du canal d'ions cationique non sélectif sur la membrane neuronale, qui sera dépolarisée une fois que ces molécules chimiques sont reconnus par les ¹¹ récepteurs olfactifs.

L'unité d'enregistrement sensille (RSS) a été développé pour détecter le changement extracellulaire dans le potentiel d'action provoqué par l'application de stimuli soit non chimiques ou chimiques. En insérant une électrode d'enregistrement dans la lymphe sensille et une électrode de référencedans une autre partie du corps d'insectes (habituellement soit les yeux composés ou l'abdomen), la cadence de tir des neurones en réponse à des stimuli ¹² peut être enregistré. Les changements dans le nombre de pointes représentent la sensibilité de l'insecte à des stimuli spécifiques. Stimuli chimiques des différentes identités et la concentration vont susciter différentes réactions de neurones, avec des taux de tir et structures temporelles, et peuvent donc être utilisées pour étudier le processus de codage de l'insecte à des produits chimiques spécifiques.

Pour la punaise de lit commun, les deux formes sexuelles partagent le même modèle de sensilles olfactives sur les antennes: neuf rainurée sensilla cheville C, 29 cheveux comme E (E1 et E2) sensilles, et une paire chacun des Dα, Dß, Dγ lisse cheville sensilla ^13,14. Comme plusieurs neurones ont été identifiés dans chaque type de sensille, il est pas facile de distinguer les potentiels de différents neurones logés dans le même sensille d'action, donc pour cette expérience, la totanuméros de L de potentiels d'action ont été comptabilisés hors ligne pour une période de 500 ms avant et après stimulation. Le nombre de potentiels d'action après stimulation a ensuite été soustrait du nombre de potentiels d'action avant la stimulation et multiplié par deux afin de quantifier les changements dans le taux d'allumage de chaque individu dans sensille pointes par seconde ^15.

Protocole

1. Préparation des instruments, Solutions stimuli, et les punaises de lit

1. Préparer une solution de KNO ₂ à 50% (p / v) dans un flacon de 20 ml.
2. Aiguiser deux microélectrodes de tungstène dans une solution de KNO ₂ à 5 V par immersion répétée des électrodes en tungstène dans et hors de la solution.
   1. Environ aiguiser le fil de tungstène par immersion d'environ 10 mm du fil de tungstène dans et hors de la solution de KNO ₂ à la vitesse de 2 trempettes / sec pendant environ 5 min, ce qui peut consommer beaucoup de l'extrémité avant du fil de tungstène.
   2. Délicatement aiguiser l'électrode par trempage d'environ 1 mm de l'extrémité du fil dans et hors de la solution à la vitesse de 2 trempettes / sec pendant au moins 1 min afin de faire un point de l'électrode fine et forte. Vérifier le diamètre de pointe de l'électrode sous le microscope fréquemment jusqu'à ce qu'il atteigne 0,2-0,5 um, qui devrait être assez fine pour perforer la cuticule des punaises de lit sensille olfactif.
      Note: Bien que forte manuellementcement de l'électrode, la vitesse d'immersion du fil de tungstène dans la solution de KNO _{2 ne soit pas} constante tout le temps. Avec plus de pratique, il est beaucoup plus facile de garder une vitesse relativement constante dans aiguiser l'électrode. Le temps d'affûtage est également incertaine en fonction de la finesse de l'électrode devrait être. Ici, une pointe d'électrode avec le diamètre de ~ 0,2 um est suffisant pour percer à travers le sensille olfactif.
3. Diluer chacune des stimuli chimiques dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à partir du composé pur à une concentration initiale de 1:10 v / v comme solution de stock. Créer une série de dilutions décimal selon le nombre de doses nécessaires à l'essai, de nouveau avec du DMSO, à partir de chacune des solutions mères de chacun des produits chimiques. Ici, utiliser 10% (+) - β-pinène et l'eucalyptol.
4. Placez les jours à jeun ou sept post-alimentation punaises de lit adultes (hommes ou femmes) de la Ft. Dix colonie (un don du Dr Haynes dans Université du Kentucky) pour être utilisé dans til expérimenter dans une boîte de Pétri.
   Remarque: Il n'y a pas le nombre exact pour les punaises placés dans la boîte de Pétri. Il peut être un peu ou beaucoup.

2. Bed Bug Antennes Préparation

1. Anesthésier les punaises de lit sur la glace (2-3 min).
2. Fixer à la fois les antennes et les corps de l'insecte sur une lamelle de microscope avec du ruban adhésif double face et retirer les jambes avec des ciseaux fins.
3. Utilisez une petite épingle à toucher doucement les antennes afin de les coller sur la bande de façon constante.
4. Reste la lamelle contre une petite boule (~ 1 cm de diamètre) de cire dentaire pour faciliter la manipulation et de l'ajuster à un angle approprié (~ 90 °) pour l'électrode d'enregistrement (Figure 1).
5. Une fois fixé, placez la punaise de lit sous un microscope stéréo, allumer la source de lumière froide et d'ajuster l'intensité de l'éclairage jusqu'à ce que l'antenne est présenté clairement, et de se concentrer le microscope sur la deuxième flagelle de l'antenne de punaises de lit à fort grossissement (720X) .
   Note: L'intensité de l'éclairage utilisé dans l'expérience est quantifiée pas, qui dépend de la façon dont vraiment les yeux de l'expérimentateur sentent l'intensité d'éclairement.

3. Sensillum simple enregistrement

1. Connecter le préamplificateur (10X) avec le dispositif de commande d'acquisition de signaux, qui est relié à l'ordinateur pour l'enregistrement et la visualisation du signal. Allumez l'ordinateur et lancer le logiciel, par exemple, AutoSpike32 et cliquez sur le mode "Record" dans la barre de menu. Ensuite, choisissez la «vague» de manière à commencer à enregistrer les signaux d'ondes.
   Remarque: Une ligne plate allant de la gauche vers la droite de l'écran à plusieurs reprises devrait maintenant être visible. Ici, la fenêtre d'enregistrement dure 40 secondes. L'enregistrement d'onde max est de 10 sec. Taux d'échantillonnage choisi est 96000 et le taux d'échantillonnage numérique est 240. Il est compensée 0% et aucun filtrage, aucune rectification pour les signaux d'enregistrement. Tous ces paramètres dans le logiciel peuvent être modifiés selon les besoins.
2. Activer le haut-parleur relié au préamplificateur, qui est utilisé pour présenter le mode de tonification pour les réponses neuronales de sensille antennaire.
3. Insérez l'électrode de référence dans l'abdomen de la punaise de lit stabilisé.
   Remarque: L'électrode de référence a été tenu par un support en métal magnétique attaché à l'air-table.
4. Après l'électrode de référence a été connecté à l'abdomen de la punaise de lit, de déplacer l'électrode d'enregistrement, qui est connecté au préamplificateur et manipulée par un micromanipulateur, vers l'extrémité postérieure de l'antenne de la punaise.
5. Lorsque l'électrode d'enregistrement est en contact avec l'extrémité droite de l'antenne, mettez sur le microscope et de localiser l'électrode à faible grossissement.
6. Ajuster l'électrode d'enregistrement alors que le grossissement augmente progressivement jusqu'à ce que à la fois l'électrode et la sensille antennaire sont dans le même plan et clairement visible sous le microscope.
   Remarque: En ce moment, le microscope est d'habitudeLy au plus fort grossissement.
7. Insérez l'électrode d'enregistrement dans l'arbre de l'sensille utilisant le micromanipulateur et aller un peu plus loin si le bruit de fond est élevé par rapport au potentiel d'action.
8. Une fois que les potentiels d'action claires sont observées à partir de la sensille enregistré, remplir une micropipette avec 10% (+) - β-pinène. Utiliser la micropipette pour déposer 10 ul aliquote de 10% (+) - β-pinène sur une bande de papier filtrant (~ 3 x 15 mm) placé à l'intérieur d'une pipette Pasteur en verre.
   1. Branchez la pipette chargée à la sortie du tube d'écoulement d'impulsion du contrôleur de relance et de placer la pointe de la pipette dans le petit trou dans le tube orientée vers l'antenne.
9. Lorsque toutes ces connexions se sont stabilisés, appuyer sur la pédale du contrôleur de relance pour offrir une bouffée de 0,5 secondes de relance (0,5 L / min) dans le flux d'air humidifié continue. L'enregistrement des potentiels d'action sera lancé simultanément lorsque le footswitch est déprimé. Le processus d'enregistrement sera la dernière pendant 10 secondes à partir du 1 sec avant la stimulation.
10. Comptez le nombre de potentiels d'action hors ligne pendant deux périodes de 500 ms, un avant et un après la stimulation. Soustraire tout changement dans le taux de pic au cours de la 500 ms après la stimulation de l'activité spontanée enregistrée au cours des 500 msec précédentes et de convertir les chiffres dans l'échelle conventionnelle de pointes / s en les multipliant par 2.

4. Remplacement de stimulation dans la SSR

1. Une fois que la pédale de commande a été déclenchée, 10% fournir la (+) - β-pinène à la pipette sur le lit bug antennes et enregistrer la réponse à cette substance odorante spécifique pendant 10 s, après quoi la pipette est retirée.
2. Étiqueter une autre nouvelle pipette avec le 0,001% eucalyptol à tester. Placer un petit morceau de papier filtre sur lequel 10 pl de la relance a été appliqué, dans la nouvelle pipette.
3. Attendez 2-5 min jusqu'à ce que le stimulus est complètement VAPORIzed dans la pipette de verre. Attacher la pipette sur la sortie du tube d'écoulement par impulsions.
4. Insérer la pointe de la pipette dans le petit trou du tube orientée vers l'antenne. Appuyer sur la pédale et commencer l'enregistrement de 10 secondes.
5. Débrancher la pipette et préparer une autre pipette avec 0,01% de l'eucalyptol.
6. Testez tout le reste des doses de l'eucalyptol (de 0,001% à 10%) sur le sensilla antennaire d'observer les réponses dose-dépendante. Test depuis le plus dilué aux doses les moins diluer.

Résultats

Simple enregistrement sensille est une technique d'enquête puissant utilisé dans les études sur les insectes écologie chimique et de la physiologie neuronale. Enquêter sur les réponses de neurones d'insectes à différents composés volatils, en particulier ceux pensé pour être écologique liée à la survie et au développement des insectes, non seulement nous donne de précieuses indications sur le processus de l'olfaction des insectes, mais ouvre également de nouvelles voies prometteuses qui ...

Discussion

La technique Sensillum simple enregistrement a été largement utilisé dans le test des réponses neuronales des insectes tels que les mouches des fruits, les moustiques et les punaises de lit à différents stimuli chimiques dans l'environnement. Ces stimuli chimiques sont souvent dissous et dilués dans un solvant commun, afin de préparer différentes doses de traitements. Cependant, différents solvants peuvent produire assez différentes vitesses de libération pour les stimuli. Des études antérieures sur certains insecte...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fil de tungstène	A-M SYSTEMS	#716500	Utilisé pour la préparation de l’électrode
KNO2	Sigma	#310484	Utilisé pour l’affûtage du fil de tungstène
Alimentation AC	BK Precision	1653A	Fourniture de la tension dans l’affûtage du fil de tungstène
Leica Z6 APO Microscope	Leica	10447424	Utilisé pour l’observation de la sensille sur les antennes
Contrôleur Simulus	Syntech	CS-55	Utilisé pour le contrôle de l’application de stimulus
Contrôleur d’acquisition USB 4 canaux	Syntech	IDAC-4	Affichage en temps réel à l’écran de tous les signaux avant et pendant l’enregistrement
Source lumineuse	SCHOTT	A20500	Fourniture de sources lumineuses pour l’observation
Micromanupulateur	Leica	115378	Utilisé pour les petits mouvements de électrode
Haut-parleur	Juster	95a	Connecté avec le contrôleur d’acquisition IDAC-4 et fournissant le son pour le signal
Support magnétique	Narishige	GJ-1	Utilisé pour maintenir l’électrode de référence, la punaise de lit stabilisée et le tube de distribution de stimulus
TMC Table d’isolation des vibrations	TMC	63-500	Utilisé pour isoler les vibrations des équipements
Coverslip	Tedpella	2225-1	Utilisé pour tenir la punaise de lit
Ruban adhésif double face	3M	XT6110	Utilisé pour stabiliser la punaise de lit sur le clip de couverture
Cire dentaire	Dentakit	DK-R012	Utilisé pour soutenir le clip de couverture où la punaise de lit est stabilisée  ;