Intensification des Perles dans le développement d'embryons de poulet Limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur l'expression des gènes

Résumé

En greffant des billes imbibées de facteurs de croissance ou d’inhibiteurs spécifiques des voies de signalisation dans les embryons en développement, il est possible de tester directement leurs effets in vivo. Dans ce protocole, des billes sont greffées dans le bourgeon du membre pour déterminer les effets de ces molécules sur l’expression des gènes et la transduction du signal.

Résumé

Utilisation des embryons de poulet, il est possible de tester directement les effets soit de facteurs de croissance ou des inhibiteurs spécifiques de voies sur l'expression des gènes et l'activation des voies de transduction de signaux de signalisation. Cette technique permet la livraison de molécules à des stades de développement définis avec précision pour des moments précis de signalisation. Après cela, les embryons peuvent être récoltées et l'expression des gènes examinés, par exemple par hybridation in situ, ou l'activation des voies de transduction de signaux observées par immunocoloration.

Dans cette vidéo, perles d'héparine trempés dans FGF18 ou AG perles 1-X2 trempés dans U0126, un inhibiteur de MEK, sont greffés dans le bourgeon de membre in ovo. Cela montre que FGF18 induit l'expression de MyoD et la phosphorylation de ERK et d'expression à la fois endogène et FGF18 induite MyoD est inhibée par U0126. Perles trempés dans un antagoniste de l'acide rétinoïque peuvent potentialiser prématurée MyoD induction par le FGF18.

Cette approche peut être noused avec un large éventail de facteurs différents et les inhibiteurs de croissance et est facilement adaptée à d'autres tissus de l'embryon en développement.

Introduction

Embryons aviaires ont fourni un outil puissant pour l'étude du développement depuis de nombreuses années ^1. Un de leurs caractéristiques les plus utiles est qu'ils sont relativement faciles à manipuler. Développement externe permet d'ouvrir l'œuf pour accéder à l'embryon et effectuer diverses micromanipulations y compris des exemples tels que le système de chimère caille-poulet classique pour étudier le destin des cellules ^2,3, l'injection de rétrovirus pour surexpression dans des tissus spécifiques au cours du développement ^4,5 et explant pour identifier les sources de signalisation de développement ^6. Plus récemment chimères généré entre les hôtes non étiquetés avec greffes provenant d'une lignée de poulet transgénique exprimant la GFP a montré que la combinaison de greffage classique et modification génétique peut fournir des informations importantes sur le développement ^7,8.

La facilité avec laquelle l'embryon aviaire peut être manipulé en a fait un excellent modèle pour l'étude de branche⁹ développement. Application des facteurs de croissance spécifiques aux membres en développement in vivo a joué un rôle dans l'identification des facteurs qui modifient branche structuration ^10,11 et continue de fournir des indications sur ce processus ^12. Cette approche a également été utilisée pour étudier les facteurs qui régulent le développement musculaire et a découvert de nombreux rôles pour les signaux tels que Wnts ^13, HGF PGB ^{14 et 15.}

Récemment, cette technique a été utilisée pour étudier les signaux contrôlant l'expression du gène myogénique dans le bourgeon de membre et a montré que les interactions entre FGF18 et l'acide rétinoïque peuvent contrôler le moment de l'expression de MyoD ^16. En utilisant une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules qui peuvent être chargés sur des billes puis greffées directement dans les tissus spécifiques à des stades de développement définis donne la possibilité d'intervenir à presque tout moment et la région au cours du développement. Cela a été utilisé pour investigate de nombreux processus, y compris la structuration ^17,18 somites, la spécification de neurones ^19, la migration de la crête neurale ²⁰ et l'extension de l'axe ^21.

Nous décrivons ici un procédé de greffage des perles trempées dans soit des facteurs de croissance ou des inhibiteurs dans le développement des membres de poulet. Cela a été utilisé pour déterminer les effets de ces signaux sur la myogenèse par l'analyse de l'expression génique spécifique du muscle avec une hybridation in situ. Nous décrivons des greffons en utilisant soit des perles trempées héparine, qui sont utilisés pour des facteurs de croissance, ou des perles AG 1-X2 pour les petites molécules hydrophobes tels que l'acide rétinoïque ou de petites molécules inhibitrices de voies de signalisation spécifiques. Cependant, d'autres perles sont également disponibles qui ont été utilisées pour fournir à la fois FGF ^{22 et 23} Shh.

Protocole

Déclaration éthique: Toutes ces expériences suivent le soin des animaux et les directives éthiques de l'Université de Nottingham.

1. Préparation des billes d'héparine pour le greffage

1. Lavez perles d'héparine soigneusement dans du PBS avant de l'utiliser. Remarque: Les billes peuvent être conservées à 4 ° C sous forme de suspension dans du PBS.
   1. Choisir des perles pour le greffage en les retirant du stock avec une pipette de 20 pi en une baisse de 1 ml de PBS. Ensuite, utilisez une micropipette réglé à 2 pi de transférer des perles dans une goutte de 20 pi de PBS dans une boîte de Pétri de 3 cm. Choisissez perles basées sur la taille et, en utilisant une chaîne stéréo microscope de dissection, transférer perles sélectionnées avec une pointe de pipette P2; ceux autour de 100 um de diamètre sont idéales.
2. Retirez le PBS à partir des perles. Retirer la plupart du liquide avec une pipette de 20 et le liquide résiduel par capillarité avec des horlogers pince fine. Remarque: Il est important d'éliminer autant que possible de sorte que la croissance factoR ne soit pas dilué quand il est ajouté aux billes.
3. Pipeter le facteur de croissance directement sur les billes. Pour FGF18 ajouter 0,5 ul de FGF18 recombinant reconstitué à 0,5 mg / ml dans 0,1% de BSA dans du PBS. Placez plusieurs gouttes d'eau sur les bords de la cuvette pour empêcher le liquide de l'évaporation.
4. Incuber les perles pendant 1 heure à température ambiante. Retirez les gouttes d'eau dans le plat avec une pipette Pasteur et le placer sur la glace prête pour la greffe.
5. Si nécessaire (pour perles transparentes) transfert 4-5 perles à 2% de phénol rouge avant la greffe pour aider les visualiser. Rincer dans du PBS avant de les transférer à l'embryon.

2. Préparation de Perles AG 1-X2 pour le greffage

1. Avant d'utiliser dériver perles avec 0,2 N de l'acide formique.
   1. Pour ce faire, utilisez une spatule pour transférer des perles à un tube de 1,5 ml. Ajouter 1 ml d'acide formique 0,2 N et lavis sur une plate-forme agitation pendant 1 h.
   2. Ensuite, retirez le acide formique avec une pipette P1000 et le remplacer par 1ml d'eau. Laver pendant 1 heure et répéter six fois pour évacuer le reste de l'acide formique.
   3. Retirer le liquide restant avec une pipette P1000 et stocker les perles à 4 ° C. Remarque: Il est pas nécessaire de retirer toute l'eau résiduelle à ce stade.
2. Retirer une petite pastille de perles d'environ 5-10 volume ul du stock à l'aide d'une petite spatule dans une boîte de Pétri de 3 cm et ajouter 1 ml de DMSO (ou tout autre solvant, le médicament est dissous dans). Note: Ceci doit fournir plusieurs centaines de perles partir de laquelle sélectionner ceux de la bonne taille.
3. Ensuite, utilisez une pipette de P2 réglé à 2 pi de transférer perles d'environ 100 um de diamètre à une baisse de 20 pi de solvant dans une autre boîte de Pétri de 3 cm.
4. Retirer le solvant avec une pipette 20 ul et tout solvant résiduel avec une pipette de 2 ul. Remplacer avec 20 ul de médicament à appliquer.
   Remarque: Pour la cohérence dissoudre le médicament à une concentration de 100 uM dans du DMSO (ou qui jamais solvant est utilisé),aliquote dans 20 pi et conserver à -80 ° C que certains inhibiteurs de petites molécules sont instables et il est préférable d'éviter de répéter congélation-décongélation. Si nécessaire puis diluer le médicament à la concentration souhaitée avant trempage des billes. Peuvent avoir besoin d'être déterminée empiriquement pour chaque médicament concentrations efficaces.
5. Incuber pendant 1 heure. Protéger de la lumière le plus grand nombre de ces molécules sont sensibles à la lumière.
6. Avant transfert greffage 4-5 perles avec une pipette de p2 fixé à 2 ul dans 20 ul de 2% de rouge de phénol dissous dans l'eau. Effectuez cette étape en utilisant un microscope à dissection stéréo pour visualiser les perles. Retirer une seule bille avec des horlogers pince fine ou une boucle de fil et rincer dans du PBS avant de les transférer à l'embryon. Ne laissez pas des perles dans 2% de phénol rouge pour plus de 15 minutes avant de l'utiliser, car cela peut entraîner une perte d'activité.

3. Préparer tungstène Aiguilles

1. Couper le fil de tungstène fine dans 3-4 cm de longueur. Insérer une pièce de fil dans l'extrémité deune pipette Pasteur en verre et faire fondre dans un brûleur Bunsen pour fixer en position. Préparer jusqu'à 10 aiguilles pour assurer qu'il ya des pièces de rechange si elles sont endommagées lors de l'utilisation.
2. Placez l'extrémité du fil dans une flamme chalumeau et l'y maintenir jusqu'à ce que le tungstène est blanc et la pointe est forte (environ 2-3 min). Remarque: Lors de l'utilisation de l'aiguille peut être nettoyé et ré-aiguisé dans le chalumeau au besoin.
   NOTE: Ces aiguilles peuvent également être utilisés pour faire des boucles pour le transfert de perles. Toucher doucement l'aiguille sur le banc et il se plie pour former une boucle.

4. Préparer les embryons perles greffes

1. Incuber les oeufs avec l'extrémité émoussée jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade désiré (3-5 jours pour la plupart des manipulations branche bourgeon). En utilisant une pince émoussée tap sur l'extrémité émoussée à casser la coquille, puis utiliser les forceps pour retirer la coque et d'exposer l'embryon. Assurer la membrane coquille est également supprimé.
   REMARQUE: 1-2 ml de PBS peut être ajouté avec une pipette Pasteur pour aider àsi cette colle à la membrane du jaune. Pipette doucement le PBS sur la surface du jaune, saisir la membrane avec la pince, en prenant soin de ne pas endommager le jaune, et tirez délicatement de l'œuf.
2. Retirer jusqu'à 5 ml d'albumine de l'œuf avec une seringue de 10 ml et d'une aiguille G 19. Prenez seulement autant que nécessaire pour assurer l'embryon ne fait pas de contact avec la bande utilisée pour sceller l'œuf que la suppression de volumes plus importants peuvent réduire les taux de survie des embryons.
3. Pour visualiser l'embryon ajoutez 5-6 gouttes d'artistes encre de chine à 15 ml de PBS contenant 100 U de pénicilline et de la streptomycine 0,1 mg / ml. Injecter 0,5 à 1 ml, directement sous l'embryon avec une seringue de 1 ml et une aiguille 25 G.
4. Ajouter 2-3 ml de PBS avec 1% de sérum de veau foetal et 100 UI de pénicilline et de streptomycine 0,1 mg / ml dans l'œuf afin d'assurer l'embryon ne pas se déshydrater. Utilisation aiguisés horlogers pince retirer la membrane vitelline et ouvrez l'amnios sur les bourgeons de membres en développement. Assurez l'embryon ne se dessèche pas et, Si nécessaire, ajouter plus de PBS / FCS.
   REMARQUE: Les bourgeons des membres peuvent être clairement considérés comme des excroissances appariés sur le flanc de l'embryon. À ces stades de l'embryon se révélera comme le côté droit est normalement supérieure. En conséquence, il est normalement plus facile de greffer des perles dans les membres droits et d'utiliser ceux de gauche que les contrôles controlatéral.
5. Utilisez un fil de tungstène aiguisé de faire une incision dans le bourgeon de membre où le cordon sera implanté. Évitez de couper tout le chemin à travers le bourgeon de membre, si possible, bien qu'à jeunes stades, cela est difficile.
   NOTE: Dans les embryons âgés (stade HH 22 et ci-dessus), il est possible de sélectionner des régions spécifiques du bourgeon de membre pour le greffage mais jeunes stades cela est plus difficile que le bourgeon de membre lui-même est petite. Il est également important de se rappeler que le bourgeon de membre va croître delà du cordon greffé sorte, surtout au jeunes stades, la perle restera dans la branche proximale.
6. Procurez-vous un cordon soit du facteur de croissance ou de la drogue en utilisant soit wa extra-finetchmakers forceps ou une boucle faite à partir d'une aiguille de tungstène. Si le cordon a été trempé dans du DMSO soit ou rouge de phénol, rincer dans du PBS avant de l'appliquer à l'embryon. Transférer le bourrelet à l'embryon à la pince / boucle de fil. Ensuite, utilisez le fil de tungstène affûtée pour insérer le cordon dans l'incision.
7. Ajouter 1-2 ml de PBS / FCS à l'œuf veiller à ce que l'embryon est maintenu hydraté, mais éviter d'appliquer directement sur l'embryon lui-même car cela peut endommager les embryons et provoquer le bourrelet à être délogé. Sceller l'œuf avec du ruban adhésif et revenir à l'incubateur.

Résultats

A l'étape 21 HH MyoD est pas exprimée dans le développement des membres myoblastes bien que la coloration peut être vu dans le myotome des somites en développement (Figure 1A). La figure 1B montre l'hybridation in situ pour MyoD six heures suivant une greffe de talon FGF18. MyoD est induite dans les myoblastes à proximité de la bille tandis que il n'y a aucune expression dans le membre contralateral. Co-greffage d'un bourrelet trempé dans U0126, un inhibiteur spécifique de la M...

Discussion

L'utilisation de greffons de perles appliquées directement au développement des tissus in ovo est un outil puissant pour disséquer le rôle de la signalisation du facteur de croissance au cours du développement donnant un contrôle inégalé sur le stade de développement à laquelle ils sont appliqués et la durée d'exposition.

Le choix du bourrelet pour chaque type de molécule est importante. Les petites molécules hydrophobes, tels que les inhibiteurs décrits ici et l'acide rétinoïque...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Perles acryliques héparine	Sigma	H5263	Les perles acrylique-héparine utilisées ont été abandonnées. Cependant, un produit de remplacement est disponible, des billes d’héparine d’agarose, cat no H6508. Ceux-ci sont transparents, donc plus difficiles à travailler, mais peuvent être colorés au rouge de phénol de la même manière que les billes AG 1-X2,
les billes AG 1-X2	Bio-Rad	140-1231
Les perles bleues Affi Gel	Bio-Rad	153-7301 ; 153-7302	Ces billes ont été utilisées avec une gamme de facteurs de croissance, y compris Shh et FGF et peuvent être utilisées pour remplacer les billes d’héparine
FGF18	Peprotech	100-28	Remettre en suspension dans du PBS avec 0/1 % de BSA, préparer des aliquotes à usage unique de 0,5 à 1 ul et les conserver à -80 °C. Les lots et les fournisseurs peuvent varier, de sorte que différentes concentrations doivent être testées pour déterminer une dose efficace.
U0126	Signalisation cellulaire	9903	Fabriquer à 20 mM stocker dans du DMSO et stocker dans des aliquotes à usage unique à -80° ;C. Protéger de la lumière.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Remettre en suspension dans le DMSO et stocker dans des aliquotes à usage unique à -80° ;C. Protéger de la lumière.
Encre noire de	Chine Windsor et Newton	5012572003384 (30 ml)	Bien qu’il existe des alternatives à ce produit, il faut faire attention car certaines encres sont toxiques pour les embryons
Fil de tungstène, 0,1 mm de diamètre 99,95 %	Alfa Aesar	10404
Pénicilline / streptomycine	Sigma	P0781	Diluer 100X dans PBS/encre et PBS/FCS