L'IRM fonctionnelle optogénétiques

Summary

Ce protocole décrit les étapes et l’analyse des données nécessaires pour réaliser avec succès l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogénétique (IRMo). L’IRMf est une nouvelle technique qui combine la lecture de l’IRMf à haut champ avec la stimulation optogénétique, permettant une cartographie spécifique au type cellulaire des circuits neuronaux fonctionnels et de leur dynamique dans l’ensemble du cerveau vivant.

Abstract

L’étude de la connectivité fonctionnelle de circuits neuronaux précis dans l’ensemble du cerveau intact peut être réalisée grâce à l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogénétique (IRMo), qui est une nouvelle technique qui combine la résolution spatiale relativement élevée de l’IRMf à haut champ avec la précision de la stimulation optogénétique. Les fibres optiques qui permettent de délivrer des longueurs d’onde spécifiques de lumière profondément dans le cerveau in vivo sont implantées dans des régions d’intérêt afin de stimuler spécifiquement des types de cellules ciblées qui ont été génétiquement induites à exprimer des canaux de conductance transmembranaire sensibles à la lumière, appelés opsines. L’IRMf est utilisée pour fournir une méthode non invasive de détermination de la réponse dynamique globale du cerveau à la stimulation optogénétique de circuits neuronaux spécifiques par la mesure du signal dépendant du niveau d’oxygène dans le sang (BOLD), qui fournit une mesure indirecte de l’activité neuronale. Ce protocole décrit la construction d’implants à fibres optiques, les chirurgies d’implantation, l’imagerie avec photostimulation et l’analyse des données nécessaires à la réalisation réussie de l’IRM. En résumé, la stimulation précise et la capacité de surveillance de l’ensemble du cerveau de l’IRMf sont des facteurs cruciaux pour faire de l’IRM un outil puissant pour l’étude de la connectomique du cerveau dans les états sains et malades.

Introduction

L' imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogénétiques (ofMRI) est une nouvelle technique qui combine la résolution spatiale de haut champ IRMf avec la précision de la stimulation optogenetic ^1-11,38, permettant la cartographie spécifique de type cellulaire des circuits neuronaux fonctionnels et leur dynamique dans l'ensemble cerveau. Optogenetics permet de types cellulaires spécifiques à cibler pour la stimulation par l'introduction de canaux de conductance trans-membranaires, appelées opsins sensibles à la lumière. Les éléments spécifiques de circuits neuronaux sont génétiquement modifiées pour exprimer ces canaux, ce qui permet la milliseconde calendrier modulation de l' activité dans le cerveau intact ^1-15. IRMf fournit une méthode non-invasive de la détermination de la réponse dynamique globale du cerveau à la stimulation optogenetic des circuits neuronaux spécifiques grâce à la mesure du signal en oxygène du sang en fonction du niveau (BOLD) ^16-18, qui fournit une mesure indirecte de l' activité neuronale.

La combinaison de ces deux techniques, appelée imagerie par résonance magnétique fonctionnelle optogenetic (ofMRI), est avantageuse par rapport à d'autres méthodes de l'activité cérébrale d'enregistrement au cours de la stimulation tels que électrophysiologie, car il peut fournir une vue de l'ensemble du cerveau à une résolution spatiale relativement élevée. Ceci permet à la détection d' une activité neuronale en réponse à une stimulation ciblée sur de grandes distances à partir du site de stimulation sans qu'il soit nécessaire pour l' implantation d'électrodes d'enregistrement invasives ^1-11. ofMRI est avantageuse par rapport à la méthode plus traditionnelle d'effectuer la stimulation électrique pendant l' IRMf, qui peut recruter différents types de cellules à proximité de l'électrode et confondre l'influence causale de chaque population ¹⁹ ainsi. En outre, les électrodes utilisées pour la stimulation électrique et le courant généré peut produire des artefacts lors de l' IRM ^20. En effet, ofMRI permet l'observation de l'influence sur l'activité globale du cerveau de la modulati spécifiquesur une grande variété de types de cellules par l'utilisation de techniques de ciblage génétique avancées telles que le système Cre-Lox chez des animaux transgéniques ou bien l'utilisation de promoteurs. contrôle optique combinatoire avec une surveillance du cerveau entier est possible avec ofMRI par l'utilisation de deux NPHR pour inhiber CHR2 et pour exciter des types cellulaires spécifiques. La boîte à outils de optogenetic disponibles pour une utilisation dans ofMRI améliore aussi rapidement au fil du temps avec l'introduction de opsins avec sensibilité à la lumière accrue ou une cinétique améliorée, des stabilisées opsins fonction de l'étape (de SSFOs) ou de opsins rouge décalé qui peut annuler l'exigence de la fibre implantée optique, permettant une stimulation non-invasive lors de l' imagerie ^21. Ces possibilités ne sont pas disponibles avec la stimulation électrique.

Cependant, les artefacts de signal résultant de l' échauffement des tissus en raison de la livraison de la lumière dans le cerveau ont été rapportés ^22, où a été montré la modification des temps de relaxation induite par la température pour produire pseufaire activation. Les chercheurs du spectacle ofMRI doivent donc être conscients de ce potentiel confondre. Avec la mise en place et des contrôles adéquats, le problème peut être résolu. Par ailleurs, relativement faible résolution temporelle consistant à mesurer la réponse hémodynamique à IRMf peut être un facteur limitant pour certaines applications de cette technique.

Ce protocole décrit tout d' abord la construction des implants de fibres optiques qui permet de fournir des longueurs d' onde spécifiques de la lumière profondément dans le cerveau in vivo. Le protocole décrit ensuite la livraison du vecteur viral opsin codant pour une région du cerveau précise en utilisant la chirurgie stéréotaxique. Suivant le protocole décrit le processus de l'ensemble du cerveau IRM fonctionnelle lors de la stimulation lumineuse simultanée. Enfin, le protocole décrit l'analyse des données de base des données acquises.

À noter, l'optogénétique décrit ici nécessite un implant chronique pour la livraison de la lumière. Cependant, les implants à fibres optiques sont stables et biocompatible, permettant le balayage longitudinal et l' investigation des circuits neuronaux sur une période de mois ^23,24.

En résumé, la stimulation précise et la capacité de surveillance du cerveau entier de ofMRI sont des facteurs cruciaux pour faire ofMRI un outil puissant pour l'étude des connectomique du cerveau. En outre, il peut fournir un nouvel aperçu sur les mécanismes de maladies neurologiques ²⁵ lorsqu'il est associé aux différents modèles animaux. En effet, ofMRI a été utilisé pour élucider l'activité de réseau de sous - régions de l' hippocampe distincts associés à des saisies ^8. Par conséquent, les laboratoires intéressés à répondre aux questions des neurosciences au niveau des systèmes trouveront cette technique d'importance.

Protocol

Déclaration d'éthique: Les procédures expérimentales ici ont été approuvés par l'Institutional soin et l'utilisation des animaux Comité l'Université de Stanford (IACUC).

1. Préparation des câbles de raccordement et viroles Implants

Remarque: Bien que les câbles de raccordement et les implants de virole sont disponibles dans le commerce, la production de ces permet en interne des dessins de spécialité et coûtera moins cher.

1. Pour préparer un câble de raccordement de fibres pour délivrer la lumière du laser à l'implant dans le cerveau, la première cliver la fibre optique à la longueur désirée.
   1. L'utilisation d'un fendoir de fibre, mettre fin à la fibre optique pour produire une extrémité plate au point de terminaison. Si la fibre est revêtue d'une veste, dénuder la gaine avec un outil de fibres de décapage préalable.
   2. Cliver l'autre extrémité de la fibre optique pour produire de la longueur souhaitée du câble, en veillant à ce que le câble est suffisamment long pour s'étendre à partir de la source de lumière vers l'animal à l'intérieur de l'alésagele scanner.
2. Mélanger une petite quantité de colle époxy dans un rapport 1: 1 sur une feuille de papier d'aluminium peu avant l'étape suivante, comme la colle époxy devient trop visqueux pour une utilisation 5 minutes après le mélange.
3. En utilisant un petit bâton en bois, appliquer doucement la colle époxy à la partie de la fibre qui sera placée à l'intérieur du côté concave de la virole en céramique, puis appliquer une petite goutte sur la surface du côté plat de la virole. Après l'avoir inséré dans l'embout, en sorte qu'une petite longueur de fibre (<0,5 mm) fait saillie à partir du côté plat de la bague en céramique. Laissez la colle époxy pour durcir O / N pour des résultats optimaux.
4. Sur le côté du câble de raccordement à fibre optique qui se connecte à la source de lumière laser, appliquer doucement la colle époxy à la partie de la fibre qui sera placée à l'intérieur du côté concave de la virole du / connecteur PC FC puis appliquez une petite déposer sur la surface du côté plat de la virole. Après avoir inséré dans la virole, assurerqu'une petite longueur de fibre (<0,5 mm) fait saillie à partir du côté plat de la virole. Laissez la colle époxy pour durcir O / N pour des résultats optimaux.
5. Polonais l'extrémité plate des viroles pour les deux côtés du câble à l'aide d'un disque de polissage en utilisant des pinces pour appliquer une pression vers le bas en douceur sur la virole tout en faisant des rotations figure-8 sur des feuilles d'oxyde d'aluminium de rodage (de 3 pm à 1 pm à 0,3 pm grain ).
6. Examiner l'extrémité plate de la virole avec un microscope à grossissement 100X. Faire en sorte que la surface de l'extrémité plane, y compris la surface de la fibre optique elle-même, est exempte de colle époxy; poursuivre le polissage si la colle époxy reste sur la surface. Assurez-vous que la surface de la fibre optique n'a pas cassé ou ébréché.
   ATTENTION: Veiller à ce personnel suivent des cours de formation de sécurité laser appropriés et porter des lunettes de sécurité laser avant de manipuler l'équipement laser.
7. Branchez le câble de raccordement de fibre optique à la source de lumière laser à travers le / connecteur PC FC et aligner le fpointe iber au point focal du coupleur. Mesurer la puissance de transmission de lumière de la fibre avec un mesureur de puissance pour assurer une sortie de lumière appropriée.
   Remarque: Les étapes suivantes sont pour la préparation de bagues en céramique avec des fibres optiques pour l'implantation chronique dans le cerveau; viroles en céramique sont creux au centre et transportent la fibre optique pour fournir de la lumière à partir d'un câble de raccordement à une région d'intérêt (ROI) dans le cerveau.
8. L'utilisation d'un fendoir de fibre, mettre fin à la fibre optique pour produire une extrémité plate au point de terminaison. Si la fibre est revêtue d'une veste, dénuder la gaine avec un outil de fibres de décapage préalable.
9. Cliver l'autre extrémité de la fibre optique pour produire la longueur souhaitée pour une implantation dans le cerveau. Déterminer la longueur de la fibre à l'aide d'un atlas stéréotaxiques pour cibler le retour sur investissement dans le cerveau.
   1. Par exemple, pour cibler hippocampe dorsal chez le rat, qui est de 3,5 mm sous le bregma, en sorte que la longueur de la fibre faisant saillie à partir de la ferrule est de 3,5 mm + 0,25 mm, ce qui représente l'épaisseur du crâne et permettant une marge d'erreur. Par conséquent, vérifiez que la dernière longueur de la fibre est de 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (longueur de la virole) = 14,25 mm.
10. Mélanger une petite quantité de colle époxy dans un rapport 1: 1 sur une feuille de papier d'aluminium, peu avant l'étape suivante (la colle époxy devient trop visqueux pour une utilisation 5 min après le mélange).
11. En utilisant un petit bâton en bois, appliquer doucement la colle époxy à la partie de la fibre qui sera placée à l'intérieur du côté concave de la virole en céramique, puis appliquer une petite goutte sur la surface du côté plat de la virole. Après l'avoir inséré dans l'embout, en sorte qu'une petite longueur de fibre (<0,5 mm) fait saillie à partir du côté plat de la bague en céramique. Laissez la colle époxy pour durcir O / N pour des résultats optimaux.
12. Polonais l'extrémité plate de la virole en utilisant un disque de polissage à l'aide d'une pince à épiler pour appliquer une pression vers le bas en douceur sur la virole tout en faisant figure de 8 rotations sur des feuilles d'oxyde de clapotis d'aluminium (de 3 pm à 1 pm à 0,3 pm grain).
13. Examiner l'extrémité plate de la virole avec un microscope à grossissement 100X. Faire en sorte que la surface de l'extrémité plane, y compris la surface de la fibre optique elle-même, est exempte de colle époxy; poursuivre le polissage si la colle époxy reste sur la surface. Assurez-vous que la surface de la fibre optique n'a pas cassé ou ébréché.
14. Couple la virole polie à un câble de raccordement de fibre optique avec un manchon de virole et connecter le câble de raccordement à une source de lumière laser. Mesurer la puissance de transmission de la lumière à la pointe de la fibre avec un mesureur de puissance pour assurer une efficacité suffisante.
15. Tenir un journal de la puissance requise de la virole du câble de raccordement pour chaque implant virole pour sortir le niveau de puissance souhaité à l'extrémité de la fibre optique (2,5 mW dans ce protocole). Jeter viroles avec un taux de plus de 50% d'atténuation et avec motif de sortie non circulaire.

2. stéréotaxique ImpChirurgie lantation et Virus Injection

1. Veiller à ce que toutes les procédures expérimentales impliquant l'utilisation d'animaux sont approuvés par le IACUC local. Maintenir des conditions aseptiques pendant les chirurgies de survie en suivant les procédures aseptiques, y compris en utilisant des gants stériles, des masques stériles, champs opératoires stériles et des instruments chirurgicaux stérilisés.
   ATTENTION: Veiller à ce que les chirurgiens portent un équipement approprié de protection individuelle (EPI), y compris des lunettes de sécurité avant de commencer la procédure. Suivez les procédures de biosécurité standards lorsque vous travaillez avec un vecteur adéno-associé (AAV), en prenant soin d'éviter les éclaboussures. Éliminer les déchets de AAV dans un container prévu.
2. Chargez une seringue microlitre avec assez AAV pour l'injection dans l'animal et un peu plus pour tenir compte des pertes de volume potentiels (total de 4 pi par animal), en gardant la seringue sur la glace avant utilisation. Dans ce protocole, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP à un titre de 4x10 ¹² vg / ml est utilisé. Placer l'animal sous isofluranee anesthésie avec une chambre d'aspiration reliée à une précision isoflurane vaporiseur ensemble de 3 - 4% avec une source d'oxygène gazeux.
3. Raser la tête avec un rasoir électrique et d'effectuer un lavage chirurgical triple sur la peau à l'aide de la bétadine et un rinçage à l'éthanol à 70%.
4. Une fois que l'animal est en anesthésie profonde (vérifier orteil réflexe et le taux de respiration), immobiliser le crâne de l'animal dans un appareil stéréotaxique avec des plots de positionnement intra-auriculaires et barre de dent.
   Remarque: L'ensemble de la procédure prendra 1 - 2 h, de l'induction d'anesthésie à la récupération.
5. Réglez l'anesthésie à un niveau approprié (1 - 3% d'isoflurane sur le vaporisateur) et continuellement surveiller les signes vitaux de l'animal, en ajustant l'anesthésie que nécessaire pour maintenir un taux de ~ 40 respirations / min respiration. Administrera pommade ophtalmique sur les yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
6. Faire un 15-20 mm incision médiane du cuir chevelu avec un scalpel et se rétracter le cuir chevelu à l'aide d'un hémostatiques chirurgicauxttached au périoste. Référence lambda et bregma pour positionner le foret sur les coordonnées pour le retour sur investissement.
7. Percez un petit craniotomie (2 - 3 mm) sur le retour sur investissement avec une perceuse dentaire, en prenant soin de ne pas percer le cerveau. Introduire lentement l'aiguille fixée à la seringue microlitre par la craniotomie pour la ROI du cerveau.
8. Avec un contrôleur de pompe à microseringue, injecter 2 pl de la solution de vecteur dans le ROI. Utiliser un débit de 150 nl / min flux pour éviter des dommages aux tissus. Après l'injection est terminée, attendre 10 minutes avant d'enlever la seringue lentement, à une vitesse de 0,5 mm / min.
9. Après l'injection, on sèche la surface du crâne. Référence lambda et bregma pour confirmer les coordonnées puis insérer l'implant de virole à la profondeur cible (par exemple: 3,5 mm au-dessous bregma pour hippocampe dorsal) à un taux d'environ 0,5 mm / min. Monter l'implant de la virole sur le crâne à l'aide de ciment dentaire. Après que le ciment dentaire est solidifié, sceller l'incision avec des sutures (size 5-0 pour les rats) autour du bouchon de ciment dentaire.
10. Après la chirurgie, placer l'animal dans sa cage individuellement logé avec la moitié de la cage au-dessus d'un dispositif de chauffage pour la récupération de l'anesthésie. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne pas placer l'animal dans la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré.
11. Pour la gestion post-chirurgicale de la douleur, administrer la buprénorphine sous-cutanée toutes les 12 heures à une dose de 0,05 mg / kg pendant 24 heures. Administrer poudre antibiotique par jour sur le site d'incision pendant 3 jours.
12. Retirer les sutures environ deux semaines après la chirurgie pour prévenir scabbing.
13. Attendre 4 - 6 semaines après l'injection de virus pour une expression suffisante de gènes optogénétiques avant d'effectuer des expériences.

3. L'IRM fonctionnelle optogénétiques

ATTENTION: Faites attention à travers le champ magnétique permanent d'un scanner IRM. équipem sécuriséent, y compris le générateur de fonction, source de lumière, ventilateur, réservoirs de capnographe et de gaz, suffisamment éloigné (au moins au-delà de la limite de 5 Gauss).

1. Placez l'animal sous anesthésie au gaz avec une chambre d'induction, relié à une précision isoflurane vaporisateur fixé à 5% avec une source d'oxygène gazeux.
2. Une fois que l'animal est en anesthésie profonde (contrôle orteil réflexe et le taux de respiration), intuber l'animal selon le protocole détaillé dans Rivard et al. (2006) pour permettre la surveillance du dioxyde de carbone par capnographie ^26. Note: intubation est essentiel dans le maintien des niveaux appropriés de CO ₂ expiratoire lors de l' imagerie.
3. Fixer l'animal dans le berceau du scanner.
   Note: Dans ce protocole, le berceau a été produit sur mesure, mais ces berceaux sont également disponibles dans le commerce. Les fonctions de berceau de rat pour fixer l'animal dans le scanner pour la livraison de l'anesthésie, l'air chauffé et de la restriction de mouvement.
4. Livrer un mélange d'isoflurane (Ranging 1,2 à 1,5%) dans environ 60% d'oxyde d'azote et 40% d'oxygène par un tube à travers le berceau. Assurez-vous que la tête de l'animal est solidement fixé afin d'éviter les artefacts de mouvement.
5. Fournir de l'air chauffé à travers un tube dans le berceau et insérez un thermomètre rectal avec un lubrifiant pour surveiller la température du corps. Administrera pommade ophtalmique sur les yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
6. Branchez le câble de raccordement de fibre optique à une source de lumière laser et mesurer la sortie à la pointe de l'embout du câble de raccordement avec un compteur de puissance.
7. Réglez le niveau de puissance approprié (déterminé précédemment à l'étape 1.15) pour produire la sortie désirée (2,5 mW dans ce protocole) à la pointe de la fibre optique implanté à l'intérieur du cerveau. Comme la puissance excessive sortie de la fibre optique peut potentiellement causer des dommages aux tissus à l'intérieur du cerveau ou de provoquer un échauffement des tissus qui va produire des artefacts de signal, ne pas augmenter de manière significative la puissance de sortie du laserau-delà de la sortie prévue.
8. Empêcher les fuites de lumière à partir de l'implant avec un cône de ruban électrique noir et couvrir les yeux de l'animal. Coupler le câble à fibres optiques de l'implant de la virole sur l'animal avec un manchon de virole.
9. Placez la bobine sur la tête de l'animal. Insérez le berceau avec un animal dans l'alésage du scanner.
   Remarque: Dans ce protocole, l'unique boucle d'émission-réception bobine a été produit sur mesure et pré-réglé pour recevoir la fréquence radio optimale du tissu cérébral.
10. Contrôler la vitesse et la température du corps respirer tout au long de ce processus, le réglage du ventilateur artificiel et le chauffage nécessaire pour maintenir des valeurs physiologiques dans les limites (veiller à ce que CO expiratoire ₂ est 3 - 4% en tournant les boutons sur le ventilateur pour régler la fréquence et le volume AVC et que la température est de 37 ° C en cliquant sur les flèches pour le réglage de la température).
11. Sélectionnez une séquence de positionnement à l'image l'emplacement de la tête de l'animal. Si le bla pluie ne sont pas à l'iso-centre, ajuster la position de tête d'animal et répéter l'analyse de positionnement jusqu'à ce que le cerveau est à l'iso-centre. Sélectionnez une séquence de calage linéaire et cliquez sur charge dans la fenêtre de sélection de séquence. Ensuite, cliquez sur Démarrer pour réduire les inhomogénéités du champ magnétique.
    Remarque: Calage est une étape critique qui influencera directement l'intégrité des données IRMf.
12. Sélectionnez une séquence pondérée en T2 et cliquez charge dans la fenêtre de sélection de séquence. Ensuite, cliquez sur Démarrer pour acquérir des images haute résolution anatomiques coronales T2 avant IRMf pour vérifier l'intégrité de l'ensemble du cerveau et de confirmer l'emplacement de l'implant de fibre optique.
    Note: Ces images peuvent être utilisées comme des superpositions d'anatomie pour la série de balayage ofMRI.
13. Connecter les câbles BNC à partir du port de déclenchement du scanner IRM pour le générateur de fonction de telle sorte que la source de lumière laser est entraîné selon un paradigme expérimental de stimulation.
    Note: Dans ce protocole, la stimulation pAradigm est de 30 secondes de la ligne de base suivie par 20 secondes sur / 40 sec éteint pendant six minutes.
14. Sélectionnez un multi-coupes gradient rappelé (GRE) séquence d'écho et cliquez sur charge dans la fenêtre de sélection de séquence. Ensuite, cliquez sur Démarrer pour acquérir 35 mm x 35 mm (2D FOV) dans le plan coupes coronales avec 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm de résolution spatiale.
    Note: La séquence GRE utilisé ici a un temps de répétition (TR) et le temps d'écho (TE) du TR / TE = 750/12 msec et un angle de basculement de 30 °.
15. A l'issue de l'analyse, retirer l'animal du scanner et de surveiller jusqu'à ce qu'il ait réveillé de l'anesthésie et peut maintenir décubitus sternale.

4. ofMRI Analyse des données

Remarque: Les étapes suivantes sont effectuées dans MATLAB comme décrit dans une publication sur haut débit ofMRI ^27.

1. Une fois les données scan brut a été transféré à l'ordinateur utilisé pour l'analyse, utilisez la reconstruction de glissement de la fenêtre pour mettre à jour l'image tous les TR, avecune lecture en spirale à quatre interleave, 750 TR msec et 12 msec temps d'écho pour acquérir 23 tranches par série de balayage. Au lieu de reconstruction classique où de nouvelles images IRMf sont reconstruites seulement après que tous les interleaves sont acquises pour chaque tranche, la méthode de reconstruction de fenêtre coulissante recompose images après l'acquisition de chaque intercalaire ^27.
2. Traiter les données brutes pour la reconstruction en deux dimensions mailler, correction de mouvement, et le calcul des séries chronologiques comme décrit précédemment ^27.
3. Utiliser une méthode seuil de cohérence pour déterminer les voxels activés par calcul de la modulation pour cent du signal BOLD de chaque voxel par rapport à la période de référence ont été recueillies avant la stimulation tel que décrit précédemment ^27. Calculer les valeurs de cohérence lorsque l'amplitude de la transformée de Fourier à la fréquence de cycles de stimulation répétées divisé par les carrés de somme de toutes les composantes de fréquence ^8.
4. En utilisant les données de séries chronologiques pour chaque vOxel, images animées corrigées moyennes qui appartiennent à des analyses du même paradigme de stimulation consécutives premiers. Ensuite , aligner les images 4D moyen d'un système de coordonnées commun avec une transformation à six degrés de liberté corps rigide , plus isotrope échelle de comparaison à l' intérieur et entre les animaux tels que décrits précédemment ^27.

Results

Les figures 1 et 2 montrent des données représentatives résultant de 20 Hz (15 ms de largeur d'impulsion, 473 nm, le rapport cyclique de 30%) , la stimulation optogenetic du cortex moteur. Un paradigme de stimulation de 30 secondes de référence suivie par 20 secondes sur / 40 sec éteint pendant six minutes a été utilisé. Des études antérieures ont montré que ce modèle de signal produit solide GRASSE de ^1,8 optogenetic stimulation. La figure 1 montre les voxels activés détectée à la fois sur le site local de la stimulation (cortex moteur) et dans le thalamus, en raison de la longue portée des connexions synaptiques entre ces régions. la figure 2 montre que l' information temporelle peut être glanée à partir HRF, car la réponse est retardée thalamique (pente initiale plus faible) par rapport à la réponse du cortex moteur après stimulation optogenetic.

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Figure 1. Activation Plan de BOLD Signal induite par optogénétiques Stimulation de CaMKIIa exprimant des cellules dans Motor Cortex. Valeurs de cohérence des voxels actifs, identifiés comme étant ceux de manière significative synchronisée aux stimulations répétées, sont montrées superposées sur une tranche coronale anatomique pondérée en T2. Les données recueillies sur un six min, 30 période de sec (initial de référence de 30 secondes et six stimulation cycles de 20 sec sur / 40 sec au large avec 473 nm de lumière, 20 Hz, 15 msec largeur d'impulsion) sont condensés en une seule carte d'activation. Tranches séquentielles sont de 0,5 mm de distance et l'emplacement de l'implant à fibre optique est désignée par le triangle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Mouvement du sujet lors de l'imagerie est une source importante d'artefact qui peut conduire à la corruption de données. assurer de manière appropriée l'animal sur le berceau d'imagerie peut minimiser ces artefacts comme on le maintien des niveaux d'anesthésie appropriés. Ici, nous avons utilisé l'isoflurane, mais anesthésiques alternatifs, tels que la médétomidine ou la kétamine et xylazine, devraient également être considérés. Cependant, les niveaux et les choix d'anesthésique peuvent influencer de nombreux paramètres dans le cerveau, y compris la réponse GRASSE ^28. L' isoflurane peut provoquer des changements dans l' excitabilité neuronale ^29. D' autres anesthésiques peuvent également affecter GABA inhibition synaptique ^30. Ainsi, le choix de l'anesthésie est important lors de l'exécution ofMRI compte tenu de sa capacité d'influer sur l'activité neuronale. ofMRI en l'absence d'anesthésie est possible, mais peut être difficile à une augmentation de mouvement de l'animal, qui peut être réduit si l'animal est habitué; ces études se réveillent ofMRI ont déjà été réalisées unnd éviterait l'effet confusionnel de l' anesthésie sur le cerveau ^9,10. Post-traitement des algorithmes de correction de mouvement peuvent être utilisés pour atténuer fortement les effets du mouvement. Plusieurs de ces méthodes existent, y compris l'inverse algorithme de Gauss-Newton employé dans ce protocole, ce qui minimise la somme des carrés fonction des coûts de l'image de référence et de l'image sous-correction. L'algorithme est utile car elle permet une correction de mouvement rapide et robuste, en utilisant une conception de plate - forme parallèle du GPU pour réduire les délais de traitement ^27.

Pour la reconstruction de données dans ce protocole, le logiciel personnalisé écrit dans un environnement MATLAB a été utilisé pour la reconstruction du maillage en deux dimensions, où les échantillons en spirale sont reconstruits dans l' espace k en images quadrillées ^31-33. les données de séries temporelles ont été générées en calculant le pour cent modulation du signal BOLD de chaque voxel par rapport à la période de référence ont été recueillies avant la stimulation. Voxels dont les séries chronologiques ont été synchronisée à des blocs de stimulation optogenetic d'une valeur de cohérence de 0,35 ou plus ont été définis comme des voxels activés; cette valeur de cohérence correspond à une valeur inférieure à 10 ^-9 P ^8. Les valeurs de cohérence ont été calculées à l'amplitude de la transformée de Fourier à la fréquence de cycles de stimulation répétées divisé par les carrés de somme de toutes les composantes de fréquence ^8,27. erreur de l'peut être contrôlé à l'aide de la correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples. D'autres méthodes d'analyse peuvent être utilisés, y compris les tests statistiques paramétriques tels que les modèles linéaires généraux (MLG). La méthode de cohérence exige une connaissance moins avant du FRH par rapport au modèle linéaire général classique. Par conséquent, il est avantageux lors de l'exploration des données en utilisant ofMRI. Cependant, la méthode de cohérence ne peut être utilisé pour les données avec des dessins de blocs ou sélectionné des dessins liés à l'événement avec un fixe interstimulus intervalle et ne peuvent être utilisées dans les données ofMRI avec d'autres événements related conçoit ou dessins mixtes. Par la suite, la modélisation dynamique de causalité (DCM) peut être utilisé pour analyser les interactions entre les régions cérébrales identifiées par ofMRI. DCM est une technique statistique bayésienne développé pour l' analyse de la connectivité fonctionnelle des réponses du système aux entrées expérimentales pendant IRMf ^34.

préoccupations techniques supplémentaires pour les ofMRI sont discutés ici. Les implants peuvent être endommagés ou tombent, ce qui conduit à l'élimination de l'animal atteint de l'étude. chirurgies Re-implantation ne sont pas recommandés en raison de l'incertitude supplémentaire de cibler le même retour sur investissement dans la chirurgie d'implantation originale et en raison de problèmes de protection des animaux. En raison de la quantité importante de temps et les ressources investis dans chaque sujet animal, l'examen de la résistance du matériau est une préoccupation importante lors du choix d'un ciment dentaire adapté pour une utilisation dans les études ofMRI. La chirurgie d'implantation est un facteur critique pour maximiser la longévité du IMPLANt et sujet animal. Par exemple, faire en sorte que le crâne est sec avant d'appliquer le ciment dentaire et en plaçant une quantité suffisante de ciment autour de l'implant de virole en céramique peut assurer sur la stabilité de long mois potentiel chronologie de l'animal pendant l'étude. En outre, les conceptions de cages alternatives peuvent être explorées et discutées avec le centre de protection des animaux pour éviter des cages avec des sommets de fil de maintien de la nourriture et de l'eau qui dépassent souvent dans la cage et offrir des possibilités pour l'animal d'endommager l'implant. Fait important, le ciment dentaire doit être choisi avec soin pour réduire les artefacts d'imagerie et qui affectent les ciments alternatifs peuvent être testés par application sur un fantôme et l'imagerie dans un scanner avant de les utiliser dans des expériences sur des animaux. Essai et erreur avec divers ciments dentaires a montré que le ciment utilisé dans ce protocole donne relativement peu d'artefacts. Un autre défi technique dans l'exécution de ofMRI est la précision du placement de la fibre optique au ROI prévu, compte tenu de l'extremely faibles distances qui peuvent exister entre les noyaux ³⁵ dans le cerveau. Après avoir terminé les chirurgies d'implantation, les analyses anatomiques T2 peuvent être utilisés pour déterminer le placement correct en superposant sur un atlas du cerveau. La compétence du chirurgien et de la pratique d'effectuer ces chirurgies peut améliorer les taux de placement corrects. La spécificité et l'expression du opsin au ROI prévu peuvent être vérifiées à l'issue de l'étude de perfuser l'animal et fixant le cerveau, en utilisant l'immunohistochimie ou la fluorescence endogène d'une protéine rapporteur marqué à l'opsine pour la visualisation. Ces protéines rapporteuses peuvent également être colocalisées avec d' autres protéines pour assurer que le opsine est exprimé dans les types de cellules neurales souhaitées ^1,8,15,25. Comme mentionné précédemment, les artefacts peuvent survenir lors de l' exécution ofMRI en raison de l' échauffement des tissus de la livraison de lumière ^22. Le chauffage des tissus provoque une modification des temps de relaxation, résultant en faux signal BOLD. Pour veiller à ce que cativation résultant de la stimulation lumineuse pendant ofMRI est pas due à cet artefact, les contrôles opsin négatifs doivent être effectués dans laquelle une solution saline injectée animaux ou des animaux injectés avec des vecteurs de contrôle fluorophores (comme AAV-CaMKIIa-EYFP) subissent ofMRI. En outre, la fibre seulement bien construit implants optiques avec une bonne efficacité de transmission de la lumière devraient être utilisés pour éliminer la nécessité d'utiliser des puissances laser élevées. Des études ont été réalisées ofMRI dans lequel fausse activation due à l' échauffement des tissus n'a pas été un problème ^1,6-8,10,11.

En ce qui concerne le choix du vecteur pour introduire les gènes optogénétiques requis dans les neurones pour l'expression, les AAV ne sont pas connus pour provoquer des maladies chez l'homme et sont donc une option pratique, compte tenu du niveau de biosécurité inférieur requis pour utiliser ces agents (BSL-1). En outre, une multitude de noyaux de vecteurs AAV transporter emballés avec divers gènes optogénétiques en stock et avec plusieurs sérotypes. Le sérotype de AAV doit être choisi belon sur la cible de la population de cellules destinées à assurer des niveaux d'expression optimaux ^36,37. Les lentivirus peuvent également être utilisés, mais exigent un niveau plus élevé de biosécurité. La période de temps requise pour une expression suffisante des gènes optogénétiques est variable en fonction du modèle animal spécifique utilisé, de l'AAV particulier utilisé et sur le paradigme expérimental spécifique. Dans ce protocole, les rats Sprague Dawley à l'âge de 11 semaines sont utilisées et les études optogénétiques commencent quatre à six semaines après l'injection de virus. Des souris transgéniques peuvent également être utilisées dans des études optogénétiques. Il est nécessaire d'effectuer des expériences pilotes pour déterminer la quantité de temps spécifique requis pour une expression suffisante des opsins. paradigmes de stimulation peut varier en fonction de l'opsine spécifique utilisé. Dans ce protocole, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP est utilisé et le paradigme de stimulation est de 20 sec sur / 40 sec off. Si vous utilisez un SSFO, le paradigme de stimulation varie parce que le SSFO exige seulement une brève impulsion de lumière pour être actionné puis une brève impulsion de lumière à une autre longueur d'onde pour mettre fin.

Une préoccupation essentielle supplémentaire lors de l'exécution ofMRI empêche les fuites de lumière à partir de l'interface de l'implant de la virole avec le câble de raccordement de fibre optique lors de la stimulation optogenetic pour empêcher un signal du cerveau de confusion provenant de la stimulation visuelle, même lorsque l'animal est anesthésié. Cônes de ruban électrique noir peuvent être utilisés pour bloquer la lumière des viroles et pour couvrir les yeux de l'animal. Fait important, les valeurs physiologiques , y compris expiratoire CO ₂ et la température du corps du sujet doivent être bien entretenus pendant toute la durée de l'imagerie. CO expiratoire ₂ doit être maintenue entre 3 - 4% et la température du corps à 37 ° C. En outre, les séquences de calage afin de réduire autant que possible l'inhomogénéité du champ magnétique avant le démarrage ofMRI balaye fortement détermine la qualité des données résultantes BOLD. Le contrôle de ces facteursest essentiel dans la production de données fiables ofMRI. Dans ce protocole, les lasers à SSAD sont utilisés comme source de lumière pour la stimulation optogenetic. Parce que la lumière laser est cohérente, plus qu'assez de puissance peut être facilement fournie par la fibre optique. sources de lumière LED couplées à la fibre optique sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux, mais présentent l'inconvénient d'une diminution de la puissance de transmission de la lumière. La source de lumière laser nécessite l'alignement à chaque câble de raccordement de fibre optique particulier, mais avec la pratique, l'alignement peut être réalisé en quelques secondes à quelques minutes.

Les applications futures de ofMRI comprennent l'utilisation de opsins prochaine génération tels que opsins rouge décalée pour permettre la stimulation non-invasive lors de l'imagerie. En outre, l'implantation de l'EEG compatible avec l'IRM ou des électrodes d'enregistrement semblables le long de l'implant à fibre optique pourrait permettre l'acquisition de données à haute résolution temporelle, en plus des données à haute résolution spatiale de l'IRM. ofMRI avec electrophysiolenregistrement ogi pourrait fournir des informations détaillées sur la connectivité fonctionnelle du cerveau. En résumé, la puissance de ofMRI pour surveiller l'ensemble du cerveau en réponse à la stimulation des populations de cellules spécifiques définies par l'identité génétique ou anatomique fait ofMRI un outil essentiel à utiliser dans l'étude des maladies neurologiques et des connectomique du cerveau en bonne santé.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scanner 7 Tesla	Agilent Technologies	Discovery MR901 Système
Sprague Dawley rats	Charles River	Crl :SD	11 semaines
couperet à fibre optique	Fujikura	CT-05
optique multimode	Thor Labs	AFS105/125Y
décapant de fibre  ;   ;	Thor Labs	T08S13
manchon fendu en céramique	Precision Fiber Products	SM-CS1140S
colle époxy	Labs	G14250
applicateurs à embout en coton	Stoelting Co.	50975
viroles en céramique multimode en zircone	Precision Fiber Products	MM-FER2002
connecteur multimode FC / PC	Thor Labs	30128C3
disque de polissage de fibre optique	Precision Fiber Products	M1-80754
feuille de rodage en oxyde d’aluminium, 0.3 & micro ; m	Thor Labs	LFG03P
feuille de rodage en oxyde d’aluminium, 1 & micro ; m	Thor Labs	LFG1P
feuille de rodage en oxyde d’aluminium, 3 & micro ; m	Thor Labs	LFG3P
microscope biologique binoculaire 40X-1,000X	Amscope	B100
lunettes de sécurité laser	Kentek	KXL-62W01
473 nm DPSS laser	Laserglow	LRS-0473
594 nm DPSS laser	Laserglow	LRS-0594
Allen jeu			de clés hexagonales2,0 mm (5/64") pour l’alignement de la pointe de la fibre sur le point focal du coupleur dans le wattmètre laser
, capteur Si, 400-1 100 nm	Thor Labs	PM121D
Isoflurane (Isothesia)	Henry Schein²nbsp ;	50033
vaporisateur d’isoflurane avec chambre à induction	VetEquip	901806
NanoFil 100 µ ; l seringue	World Precision Instruments	NANOFIL-100
UltraMicroPump avec contrôleur SYS-Micro4	World Precision Instruments	UMP3-1
générateur de fonction	A.M.P.I.  ;	Master-8
stéréotaxe pour petits animaux	David Kopf Instruments	Modèle 940  ;
Modèle 683 ventilateur pour petits animaux  ;	Harvard Apparatus	550000
Type 340 capnographe  ;	Harvard Apparatus	733809
foret dentaire (kit de micromoteur rotatif)	Foredom Electric Co.	K.1070
pommade ophtalmique (larmes artificielles)	Rugby	00536-6550-91
stérilisateur d’instrument	CellPoint Scientific	Germinator 500	stérilisateur à billes
de verre antibiotique en poudre	Pfizer	NEO-PREDEF sulfate de	néomycine, acétate d’isofluprédone et chlorhydrate de tétracaïne
buprénorphine analgésique	Hospira	NDC:0409-2012	substance contrôlée de l’annexe III, 0,3 mg/ml stock