Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

Résumé

L’attachement bactérien aux cellules hôtes est une étape clé lors de la colonisation et de l’infection de l’hôte. Ce protocole décrit la génération d’adhésines recombinantes couplées à des polymères en tant que matériaux biomimétiques qui permettent d’analyser la contribution des adhésines individuelles à ces processus, indépendamment d’autres facteurs bactériens.

Résumé

L’attachement bactérien aux cellules hôtes est l’un des événements les plus précoces de la colonisation bactérienne des tissus hôtes et donc une étape clé de l’infection. La caractérisation biochimique et fonctionnelle des adhésines médiant ces interactions initiales entre les bactéries et l’hôte est souvent compromise par la présence d’autres facteurs bactériens, tels que des composants de la paroi cellulaire ou des molécules sécrétées, qui interfèrent avec l’analyse. Ce protocole décrit la production et l’utilisation de matériaux biomimétiques, constitués d’adhésines recombinantes pures couplées chimiquement à des billes de polystyrène fonctionnalisées disponibles dans le commerce, qui ont été utilisées avec succès pour disséquer les interactions biochimiques et fonctionnelles entre les adhésines bactériennes individuelles et les récepteurs des cellules hôtes. Des protocoles pour différentes chimies de couplage, permettant l’immobilisation directionnelle des adhésines recombinantes sur des échafaudages polymères, et pour l’évaluation de l’efficacité de couplage des matériaux « bactériomimétiques » résultants sont également discutés. Nous décrivons plus en détail comment ces matériaux peuvent être utilisés comme outil pour inhiber la cytotoxicité médiée par les agents pathogènes et discutons de la portée, des limites et des applications ultérieures de cette approche dans l’étude des interactions bactéries-hôtes.

Introduction

La dissection des interactions entre les adhésines bactériennes et les récepteurs de surface de l’hôte à l’interface hôte-pathogène est une étape essentielle vers notre compréhension des mécanismes sous-jacents à l’origine de l’adhésion bactérienne. En fin de compte, cela nous aidera à identifier des stratégies pour interférer avec ces processus pendant les infections. En menant de telles études, nous sommes souvent confrontés à un dilemme : l’analyse biochimique et biophysique des mécanismes moléculaires de liaison de l’adhésine nécessite leur séparation des autres composants de la paroi cellulaire, qui peuvent interférer avec les événements d’adhésion. D’autre part, l’utilisation de protéines solubles recombinantes simplifie à l’excès l’événement d’adhésion, en ne tenant pas compte de l’ancrage des protéines dans la paroi cellulaire bactérienne et de la multivalence de liaison obtenue par l’affichage de la surface bactérienne. De même, du point de vue de la cellule hôte, la rencontre et la liaison à des molécules d’adhésine uniques n’ont pas toujours le même impact en termes d’organisation de la membrane plasmique, de fluidité de la membrane et de regroupement de récepteurs¹, ce qui, en fin de compte, rend difficile l’évaluation de l’impact de l’adhésion sur la signalisation cellulaire de l’hôte et le résultat des interactions bactérie-hôte.

Récemment, une méthode a été mise au point, dans laquelle des adhésines purifiées recombinantes ou des fragments d’adhésine sont couplés de manière directionnelle et covalente à des particules de polymère de taille similaire à celle des bactéries, imitant ainsi l’affichage de la surface bactérienne. Cette approche a été utilisée sur une gamme d’adhésines différentes, des molécules d’adhésion multivalentes (MAMs) à Gram négatif2^{, 3}, aux adhésines à Gram positif, y compris la protéine de liaison à la fibronectine de Staphylococcus aureus (FnBPA)^{4, 5} et Streptococcus pyogenes F1^{, 6, 7}. Cette méthode a permis de dissection de fragments d’adhésine importants pour la liaison de la cellule hôte, l’identification des récepteurs de surface de l’hôte et la détermination de leur comportement à la surface de la cellule hôte, tout en tenant compte à la fois de l’affinité de liaison et de l’avidité ^{1, 8}. De plus, cette approche a été utilisée pour étudier l’efficacité des adhésines immobilisées et de leurs dérivés en tant qu’inhibiteurs des interactions hôte-pathogène ^{8, 9}. Il a été démontré que les dérivés couplés en surface de la molécule d’adhésion multivalente (MAM) 7 de Vibrio parahaemolyticus peuvent être utilisés pour atténuer une gamme d’infections bactériennes in vitro, y compris celles causées par des agents pathogènes multirésistants tels que Acinetobacter baumannii et S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) ^{7, 9}.

Ici, nous décrivons différentes chimies qui peuvent être utilisées pour immobiliser les adhésines aux particules de polystyrène fonctionnalisées disponibles dans le commerce. En raison du large éventail de fonctionnalités de surface disponibles, d’étiquettes et de tailles de particules, il s’agit d’un échafaudage utile pour la production de matériaux bactériomimétiques afin d’étudier les interactions adhésine-hôte. Nous décrivons en outre des méthodes pour la caractérisation initiale de la réaction de couplage et pour le calcul des propriétés importantes des matériaux résultants. Enfin, l’utilisation d’adhésines couplées à des billes comme inhibiteurs compétitifs des infections bactériennes in vitro est discutée à titre d’exemple de leur application, ainsi que la portée et les limites futures de cette approche.

Protocole

1. chimique Couplage de protéines à des billes de polymère

1. Couplage directionnel thiol-amine
   Remarque: Ce protocole est adapté pour coupler des protéines à cysteine ​​contenant à fonction amine perles de polymère, en utilisant sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butyrate (SMPB Sulfo-) comme agent de réticulation (Figure 1).
   
   Figure 1. réticulation stratégie utilisée pour directionnelle couplage thiol-amine de protéines à des billes de polymère. Billes de polystyrène Amine modifiés sont activés avec Sulfo-SMPB. Le maléimide réagit avec cystéines libres à directionnellement protéines couple à billes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
   1. Préparation des réactifs:
      1. Préparer PBS (phosphate de sodium 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) et autoclave.
      Préparer un stock 100x (0,5 M ou 287 mg / ml dans PBS) du PTCE (tris (2-carboxyéthyl) phosphine) immédiatement avant utilisation.
   2. Préparer un 5x stock (10 mM ou 4,58 mg / ml dans dH _{2 O)} de Sulfo-SMPB immédiatement avant l'utilisation.
   3. Préparer un 10x stock (500 mM ou 88 mg / ml dans du PBS, pH 7,0) de la cystéine, immédiatement avant utilisation.
2. Activation Perle:
   1. Mélanger la suspension de billes en retournant doucement et transférer la quantité requise de la suspension de billes (par exemple, 12 ml) dans un tube stérile de 1,5 ml contenant 1 ml de PBS stérile, pH 7,0.
   2. Pipette doucement monter et descendre pour laver les perles et culot par centrifugation dans une microcentrifugeuse (2 min à 16 000 xg).
   3. Retirer délicatement le surnageant avec une pipette et défausse. Reprendre le culot de billes dans 1 ml de PBS stérile frais et répéter l'étape de lavage. Reprendre le culot de billes dans 0,8 ml de PBS.
   4. Ajouter 200 ml de 10 mM fraîchement préparée Sulfo-SMPB, pour donner une concent finaleration de 2 mM.
   5. Incuber la suspension de billes pendant 1 heure à 25 ° C sur une roue en rotation.
3. La réduction de la protéine:
   1. Au cours de la période d'incubation de l'étape d'activation, pour préparer la protéine de l'étape de couplage suivante de sorte qu'il peut être immédiatement ajouté aux billes activées.
      Remarque: Bien que cette étape de réduction est pas toujours nécessaire pour GST (Glutathion S-transférase) des protéines de fusion, il est recommandé d'assurer une efficacité élevée de couplage.
      1. Vérifier la concentration en protéines, et de l'ajuster à la concentration finale requise pour la réaction de couplage. Remarque: 6 mM de protéine dans du PBS et un volume de 1 ml sont généralement utilisés.
      2. Ajouter PTCE mère pour donner une concentration finale de 5 mM. Incuber la solution pendant 30 min à température ambiante.
         Remarque: Le mélange de réaction peut être directement utilisé pour la réaction de couplage suivante.
      3. Maintenir une petite quantité (quelques ml) de la solution de protéine pour la détermination de la pro concentration protéine et le calcul du rendement de couplage (voir la section 2).
4. Protéine accouplement étape:
   1. Pellet les billes activées par centrifugation (2 min, 16 000 x g dans une microcentrifugeuse), et laver le culot une fois dans 1 ml de PBS stérile frais.
   2. Reprendre le culot dans la solution de protéine préparée (par exemple, 1 ml), pour donner la concentration en protéines souhaitée.
      Remarque: La concentration de la protéine pendant l'étape de couplage dépendra de l'efficacité de couplage moyenne (voir la section 2 pour la détermination de l'efficacité de couplage) et de la densité de couplage désiré (tel que calculé à 1.1.4.3). Le rendement est d'environ 85%, et la concentration finale souhaitée dans le 5 mM 10x suspension de billes, de sorte que la concentration en protéines au cours de l'étape de couplage doit être d'environ 6 mM.
   3. Calculer la densité de couplage selon la formule suivante:
      jpg "/> où
      _c ρ densité de couplage [nombre de molécules de protéines / nm ^2],
      protéine concentration de protéine de conc [mg / ml],
      protéine M _w poids moléculaire de protéine [Da],
      conc concentration bourrelet de talon [numéro de billes / L],
      diamètre d des billes [nm ^2]
      Le nombre d'Avogadro
   4. Utilisez la densité de couplage pour calculer la distance de ligand moyenne:
      
   5. Incuber la suspension de protéine-billes pendant 2 heures à 25 ° C sur une roue en rotation.
      Remarque: Certainsprotéines ne peuvent pas être stable à température ambiante. Dans ces cas, la réaction peut être effectuée à 4 ° CO / N.
   6. Désactiver restants groupes activés sur les billes en ajoutant cystéine actions à une concentration finale de 50 mM et incuber la suspension pendant 30 min à 25 ° C sur une roue en rotation. Pellet les billes par centrifugation (2 min, 16 000 x g dans une microcentrifugeuse).
   7. Gardez le surnageant pour déterminer la concentration de protéines et de calcul du rendement de couplage (voir la section 2).
   8. Laver le culot de billes deux fois avec 1 ml de PBS et remettre en suspension dans 1 ml de PBS frais pour donner le produit final.
      Remarque: Le protocole ci-dessus sera généralement donner 1 ml de protéine couplée, à une concentration finale de protéines 5 mm, ce qui peut être utilisé comme un stock 10x pour des expériences ultérieures (voir section 3).
   9. Pour procéder à l'article 3 du protocole, travailler avec 100 ml / ml de perles de stock, ou à une concentration finale de 500 nM de protéines. Remarque: Un bon point de départ pour cette procedure est de 2 × 10 ¹² / ml de perles, résultant en une densité de couplage de 3 x moyenne 10 ^-4 protéines / nm ² ou un espacement moyen de 57 nm sur un cordon de 2 mm de diamètre.

Couplage directionnel thiol-carboxy
Remarque: Ce protocole est adapté pour coupler des protéines à cysteine ​​contenant des billes de polystyrène carboxyle fonctionnalisé. Le fragment carboxyle est d'abord activé à l'aide de 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) / N-hydroxysuccinimide (NHS), l'aminé modifié et ensuite réticulé en utilisant Sulfo-SMPB (figure 2).

Figure 2. réticulation stratégie utilisée pour directionnelle couplage thiol-carboxyle de protéines à des billes de polymère. Billes de polystyrène carboxylées sont d'abord activés avec EDC et modifiés avec NHS pour former un ester de NHS semi-stable. Après amine couplage de éthylènedirésultats amine dans un groupe amine libre qui réagit avec Sulfo-SMPB. Maléimide activé billes peuvent alors réagir avec cystéines libres à directionnellement protéines couple à billes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. Préparation des réactifs:
   1. Préparer PBS (phosphate de sodium 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) et autoclave.
   2. Préparer un stock 100x (0,5 M ou 287 mg / ml dans du PBS,) du PTCE immédiatement avant utilisation.
   3. Préparer un stock 10x (20 mm ou 4 mg / ml dans PBS) d'EDC (1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide) immédiatement avant utilisation.
   4. Préparer un stock 10x (50 mM, ou 6 mg / ml dans PBS) du NHS (N-hydroxysuccinimide) immédiatement avant l'utilisation.
   5. Préparer un 5x stock (10 mM ou 4,58 mg / ml dans dH _{2 O)} de Sulfo-SMPB immédiatement avant l'utilisation.
   6. Préparer un 10x stock (500 mM ou 88 mg / ml dans du PBS, pH 7,0) de la cystéine immédiatement bl'utilisation de vant.
2. Activation Perle:
   1. Mélanger la suspension de billes en retournant doucement et transférer la quantité requise de billes en suspension (par exemple, 12 ml) dans un tube de 1,5 ml stérile contenant 1 ml de PBS stérile, pH 7,0.
   2. Pipette doucement monter et descendre pour laver les perles et culot par centrifugation dans une microcentrifugeuse (2 min à 16 000 xg).
   3. Retirer délicatement le surnageant avec une pipette et défausse.
   4. Reprendre le culot de billes dans 1 ml de PBS stérile frais et répéter l'étape de lavage.
   5. Reprendre le culot de billes dans 0,8 ml de PBS.
   6. Ajouter 100 ml de 10x EDC actions (2 mM concentration finale) et immédiatement 100 ml d'10x NHS solution stock (5 mM de concentration finale) de la suspension de billes.
   7. Incuber la suspension de billes pendant 30 minutes à 25 ° C sur une roue rotative.
   8. Lavez perles une fois dans 1 ml de PBS et remettre en suspension dans 0,8 ml de PBS stérile frais.
   9. Ajouter 200 ml d'éthylènediamine, et incUbate la suspension de billes pendant 1 heure à 25 ° C sur une roue en rotation.
   10. Lavez perles une fois avec 1 ml de PBS et remettre en suspension les perles dans 0,8 ml de PBS frais.
   11. Procédez de la section 1.1.2.4 (activation de perle avec Sulfo-SMPB) comme décrit dans la section 1.1.2 et suivez le reste du protocole décrit dans la section 1.1 (couplage directionnel thiol-amine). Effectuer préparation de protéine et étapes de couplage de la protéine dans des conditions strictement identiques à celles décrites dans la section 1.1.
       Remarque: Le rendement de couplage typique utilisant ce protocole est légèrement inférieure par rapport à la section 1.1, donc régler la concentration de la protéine initiale en conséquence pour obtenir la même densité de couplage (à 75%.).

2. Détermination du rendement de couplage

Remarque: Pour déterminer la concentration de protéines, utiliser Bradford Réactif ^{10 et} essais colorimétriques comme suit:

1. Retourner doucement Bradford réactif à l'e eiller homogénéité du réactif.
2. Utilisation d'un / ml de solution de BSA 10 mg, d'élaborer des normes de protéines couvrant concentrations entre 0,1 et 1,5 mg / ml de BSA dans un tampon.
3. Ajouter 250 ml de réactif de Bradford à des puits d'une plaque à 96 puits. Préparer suffisamment de puits pour tous les échantillons, les normes de protéines et des contrôles négatifs (tampon seulement).
4. Ajouter 5 ml d'échantillon de protéine (étalons de protéine ou tampon, pour le témoin négatif) pour le réactif dans la plaque à 96 puits.
5. Incuber la plaque sur un agitateur orbital à température ambiante pendant 10 min.
6. Mesurer l'absorbance à 595 nm en utilisant un lecteur de plaque.
7. Générer une courbe standard de concentration BSA par rapport A595 nm et l'utiliser pour déterminer les concentrations de protéines dans les échantillons initiaux et un surnageant.
8. Calculer la concentration de protéine couplée comme suit:
   
9. Calculer le rendement de couplage en tant que:
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3. Utilisation de Perle couplé adhésines en concurrence dosages

1. Préparation:
   1. Graine de 1 ml par puits de cellules HeLa à une concentration de 150.000 cellules / ml dans une plaque de 24 puits la veille de l'essai de compétition, pour permettre aux cellules d'atteindre environ 80% de confluence avant de commencer l'expérience.
   2. Mettre en place chaque condition expérimentale en trois exemplaires. Inclure des puits pour les contrôles négatifs (pas de bactéries ajoutées au cours des essais de compétition), les contrôles positifs (perles de commande couplée à la fusion-tag seulement ajouté au cours des essais de compétition) et les contrôles de lyse (pour les expériences de cytotoxicité).
   3. Inoculer un LB (MLB) culture de 5 ml de marine avec une nouvelle colonie de V. parahaemolyticus et grandir O / N à 30 ° C, en secouant.
   4. Préparer MAM de perles couplé suffisante, comme décrit dans la section 1. (Coupling). Autoriser pour 100 ml de 10x perles de stock par puits.
2. Analyse de la concurrence:
   1. Le jour de la competitexpérience d'ions, de mesurer l'OD ₆₀₀ de la culture bactérienne.
   2. Préparer les médias de l'infection par dilution des cultures bactériennes dans DMEM incolore, sans additifs, pré-chauffé à 37 ° C, contenant 10% v / v la suspension de billes (soit adhésine couplé perles ou des perles de contrôle), pour donner une MOI de 10. Préparer 1 ml / puits et 10-20% volume excédentaire par échantillon. Note: Pour les conditions mentionnées ci-dessus (plaque de 24 puits, V. parahaemolyticus, MOI 10), le volume nécessaire de culture O / N être ajoutés par puits (ml / ml) est calculé comme 3 / OD ₆₀₀ de la culture. Par exemple, 1 ml de milieu d'infection contiendra typiquement 100 ml suspension de billes, quelques ml de la culture bactérienne et être faite jusqu'à 1 ml avec incolore, DMEM non complété.
   3. Retirer ancien milieu des puits et laver les cellules HeLa cultivées en ajoutant 1 ml de PBS stérile préchauffée à 37 ° C pour chaque puits.
   4. Retirer du PBS et ajouter 1 ml de milieu d'infection par puits. Également mis en place des contrôles, en ajoutant des solutions suiteaining perles et les bactéries (contrôle positif) ou perles d'adhésine et aucune bactérie (contrôles négatifs), ou contrôle DMEM contenant 0,1% de Triton X-100 (contrôle, seulement nécessaire pour les mesures de cytotoxicité lyse).
   5. Incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu à 37 ° C pendant la durée souhaitée (par exemple de 4 heures pour des mesures de cytotoxicité ou 1 h pour les mesures d'adhérence).
      Note: les deux adhésion bactérienne et la cytotoxicité sur les cellules hôtes peuvent être utilisés comme-outs lire pour l'efficacité de l'inhibition. Si les points de temps de cytotoxicité et d'adhérence mesures coïncident, les deux dosages peuvent être réalisés en utilisant des échantillons à partir de la même source, étant donné que la cytotoxicité est déterminée en utilisant le surnageant de culture et de fixation des dosages utilisent des échantillons provenant de la couche de cellules restants.
3. Des mesures de cytotoxicité:
   1. Aux points de temps indiquée (par exemple, post-infection de 4 heures), retirer trois fois 200 ml de chaque 24 puits et transfert àune plaque de 96 puits.
   2. Spin plaques à 96 puits à 1500 xg, 5 min et de transfert de 100 ml de chaque puits dans une plaque de 96 puits fraîche. Ajouter 100 ml de médias utilisés lors de l'infection expériences aux puits fraîches de la plaque de 96 puits en trois exemplaires (ceux-ci seront utilisés comme des blancs).
   3. Effectuer le test déshydrogénase (LDH) de libération de lactate en utilisant un kit de détection de cytotoxicité LDH et en suivant les instructions du fabricant.
      1. Brièvement, calculer la quantité de réactif nécessaire par incréments de 25 (par exemple, si 62 échantillons doivent être mesurés, faire assez mélange de réactifs pour 75 etc.).
      2. Par exemple, pour 100 échantillons, mélanger 11,25 ml de réactif A avec 250 pi de réactif B. Inverser, ne pas vortexer afin d'éviter la formation de mousse.
      3. Placez le mélange dans un réservoir pour être en mesure de pipeter avec une pipette à canaux multiples. Ajouter 100 ul de mélange de réactifs à chaque échantillon.
      4. Incuber la plaque à température ambiante et de lire l'absorbance à 490 nm sur un lecteur de plaque à 10, 20, 30 min.
      Analyser l'ensemble de données pour lequel l'absorbance de l'échantillon de contrôle de lyse est élevé, mais toujours dans la gamme linéaire du lecteur de plaque (typiquement, 2-3 unités d'absorbance).
   4. Exprimer les résultats en% cytotoxicité, en utilisant la formule suivante pour la conversion:
      

Mesure de l'adhésion bactérienne:

1. Aux points de temps indiquée (par exemple, post-infection de 1 h), retirer le support de la couche cellulaire.
2. Bien laver la couche cellulaire avec stérile, PBS préchauffé (au moins 3-4 lavages de 1 ml de PBS chacun) pour éliminer toutes les cellules de l'ONU-joint.
3. Lyse des cellules hôtes par l'ajout de 1 ml d'une solution stérile 1% v / v de Triton X-100 solution dans du PBS par puits. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 min.
4. Introduire à la pipette chaque échantillon monter et descendre plusieurs fois avant de transférer le contenu de chaque puits pour séparer tubes de 1,5 ml. Préparer 10 fois des dilutions en série d'échantillonsdans PBS stérile (par exemple, utiliser 100 ml d'échantillon et 900 ml de PBS).
5. Plaque 100 ml de chaque échantillon sur gélose MLB et la propagation à l'aide d'un épandeur de cellule. Optimiser qui dilutions à l'assiette en fonction des souches bactériennes et point de temps. Remarque: Pour le montage expérimental décrit, 10 ⁵ ou 10 ⁶ dilutions de pliage donnent un nombre approprié de CFU.
6. Incuber les plaques à 37 ° CO / N et dénombrer les bactéries par comptage de colonies.

Résultats

Le V. parahaemolyticus adhésine MAM7 contient sept tandem entrée de cellule de mammifère (MCE) des domaines impliqués dans la reconnaissance des récepteurs de surface de l'hôte. Nous avons utilisé des billes de polystyrène couplés aux recombinant, soit des fragments purifiés englobant tous les domaines de sept tandem (MCE MAM7) ou seulement le premier domaine de MCE (MAM1) pour tester la capacité de ces matériaux à rivaliser avec V. parahaemolyticus cellule hôte pour la liaison et l'efficacité résultant de ces matériaux en tant qu'inhibiteurs d'adhérence. Cellules HeLa ont été infectées avec V. souche parahaemolyticus POR1, et la cytotoxicité résultant de l'infection in vitro a été évaluée après 4 heures (Figure 3). Le traitement des cellules HeLa avec 0,1% de Triton X-100 (contrôle de lyse positive) a donné lieu à une lyse complète des cellules, les cellules non infectées affichent de très faibles niveaux de cytotoxicité. Infection in vitro de cellules non traitées avec POR1 conduit à des niveaux très élevés de lyse cellulaire, et ce a été inhibée par co-MAM7perles upled mais pas MAM1 couplés ou des billes de GST-commande couplé (figure 3).

Figure 3. Caractérisation de la cytotoxicité induite Vibrio parahaemolyticus dans les cellules epitheliales au cours des essais de compétition. Les cellules ont été traitées avec V. parahaemolyticus (Vp), indiqués par (+), ou pas de bactéries (-) en présence de différentes entités concurrentes (. comp) comme indiqué. Ceux-ci inclus soit pas comp. (-), Perles MAM7 (MAM7), perles MAM1 (MAM1) ou des perles de contrôle de TPS (TPS). A titre de témoins, des cellules ont été traitées soit avec du Triton X-100 (Triton, le contrôle de lyse), ou laissées non infecté (uninf). LDH presse après 4 heures a été mesurée comme décrit dans l'article 3, et les résultats des contrôles normalisé à Triton (100%) et blancs (0%) comme décrit ci-dessus. Les résultats équivalent à ± SEM à partir d'expériences en triple. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Énumération de V. parahaemolyticus attaché à soit des cellules HeLa non traitées, ou des cellules incubées avec MAM7-, MAM1-, ou des billes de contrôle de la TPS, a révélé que MAM7-perles, mais pas MAM1- ou des billes de contrôle GST outcompete V. parahaemolyticus pour la fixation à l'hôte récepteurs de surface cellulaire (Figure 4).

Figure 4. Caractérisation de la fixation des bactéries au cours des expériences de compétition. Cellules HeLa ont été infectées avec V. POR2 parahaemolyticus (Vp +), en l'absence (-) ou en présence d'entités concurrentes comme suit: perles de MAM7 (MAM7), des billes (MAM1 MAM1) ou de billes de contrôle de la GST (GST) (comp.). Adhérence bactérienne a été mesurée après 1 h, comme décrit dans la section 3. Les résultats sont les moyennes ± SEM d'expériences en triple. Moyens (FLTR en UFC / ml) sont 2,3010 ^{6, 5} 1,5310, 2,0510 ^6, 2,1210 ^6. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Adhésines couplés à des billes marquées fluorophores se traduisent par la génération de matériaux qui imitent l'adhérence bactérienne à des cellules hôtes et sont de puissants outils pour l'imagerie cellulaire (figure 5). Utilisation de perles bleues fluorescentes MAM7 couplés, nous avons caractérisé le processus d'attachement MAM7 médiation aux cellules épithéliales. Fixation de MAM7 à des cellules hôtes a abouti à des réarrangements actine et la formation de fibres de stress, qui étaient co-visualisées en utilisant la rhodamine-phalloïdine pour colorer F-actine (figure 5B).

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Figure 5. Préparation et utilisation de fluorophores marqués perles biomimétiques à des fins d'imagerie. (A) la suspension de perles biomimétiques bleus fluorescents (tube droit, 10x stock) et le tampon de contrôle (tube gauche). (B) Fixation des perles MAM7 couplés à Hela cellules résultats dans réarrangements actine et la formation de fibres de stress. Fixation des perles bleues fluorescentes et le stress d'actine résultant fibres (rouges, colorées avec de la rhodamine-phalloïdine) ont été imagées par microscopie. Bar, 10 um. Images dans la partie B ont été adaptés de Lim et al. ¹ et reproduites sous la licence Creative Commons Paternité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous décrivons ici deux protocoles, qui peuvent être utilisés à des protéines contenant des thiols pour un couple amine ou carboxylate billes de polystyrène modifié, respectivement. En raison de la facilité de la procédure, le couplage thiol-amine est préférable, mais en fonction de la spécification du bourrelet souhaité (diamètre, les propriétés de fluorescence), l'utilisation de billes d'aminé fonctionnalisé peut ne pas être possible et nous avons donc inclus un protocole qui permet de convertir le carboxylate - dans un fragment amine pour donner le chercheur de la plus grande flexibilité possible dans le choix des échafaud. Bien que les deux thiol-amine et un groupe thiol carboxyle travail de couplage pour toute cysteine ​​contenant des protéines, le couplage directionnel (par exemple, l'immobilisation de la protéine par son extrémité N-terminale, imitant affichage de surface) exige une protéine sans résidus de cysteine, qui est produit en tant que fusion GST protéine, ou qui contient un seul résidu de cysteine ​​terminale introduit par mutagenèse dirigée. Si plusieurs cysteines réactifs sont contenusau sein de la protéine, ce qui conduira à l'immobilisation aléatoire qui peut entraver la fonction des protéines. Beaucoup adhésines bactériennes ne contiennent pas de résidus cystéine naturellement. Pour d'autres, ceux-ci peuvent être éliminés par mutagenèse dirigée, mais cela nécessiterait de nombreuses analyses pour assurer la structure et la fonction native sont retenues dans le mutant. Pour les protéines de fusion TPS, TPS-tag purifiée couplée à des billes peut être utilisé comme un contrôle négatif approprié. Utilisant des billes couplées comme un contrôle doit être évitée, car ceux-ci ont souvent une plus forte tendance à agglutiner ou adhérer aux cellules non spécifiquement. Une version simplifiée du protocole 1.2., En utilisant uniquement EDC, peut être utilisée pour coupler des protéines à des billes de polymère fonctionnalisé carboxyle, toutefois dans ce cas de couplage a lieu par l'intermédiaire d'amines primaires de la protéine et par conséquent ne garantit pas le couplage directionnel.

TCEP comme agent réducteur ne doit pas être remplacé par d'autres agents réducteurs disponibles dans le commerce et couramment utilisés, tels que dithiothreitol (DTT) ou le 2-mercaptoéthanol (BME), comme les thiols qu'ils contiennent seront en compétition avec couplage de la protéine dans l'étape de couplage thiol-maléimide. PBS peut être remplacé par d'autres tampons, mais avec les éléments suivants: tampons peuvent pas contenir des amines primaires (donc tampons Tris contenant ne sont pas appropriés). L'utilisation de tampons contenant (<10 mm) de très faibles concentrations de sel conduit à perler et l'agglutination doit également être évitée. La pureté des protéines est également un facteur important à considérer lors de cette procédure, et pour obtenir des données de haute qualité, les protéines doivent être utilisés purs. Nous purifions régulièrement protéines en plusieurs étapes, y compris au moins une étape de purification par affinité et de filtration sur gel, mais dans certains cas chromatographie échangeuse d'ions se fait comme une troisième étape. En conséquence, la pureté des protéines utilisées pour le couplage est généralement de 90% ou plus, de la manière jugée par SDS-PAGE.

Il est recommandé pour déterminer les concentrations en protéines à la fois dans le mélange réactionnel initial et de the surnageant après achèvement de la réaction. Cela aidera à déterminer la concentration de protéine apparent des billes couplées, et donc la densité de couplage. Détermination de deux valeurs permet également le calcul de l'efficacité de couplage. Ceci peut être pris en compte lors de la préparation de la solution de protéine initiale dans des réactions ultérieures, pour obtenir la densité souhaitée de la concentration et le couplage final. Réactif de Bradford est particulièrement adapté pour la détermination de la concentration en protéine avant et après la réaction de couplage, comme aucune des substances dans la réaction interfère avec la formation d'un complexe colorant aux concentrations utilisées. Si les concentrations de protéine plus faibles doivent être utilisées, ce procédé peut avoir à être remplacé par un procédé de détection plus sensible toutefois l'attention doit être accordée au fait qu'il doit être compatible avec les substances contenues dans la réaction de couplage. Il est également recommandé d'utiliser des réactifs fraîchement préparés et de gérer des réactifs en poudre avec des soins (par exemple, magasindans un récipient hermétique et utiliser des billes de silice, pour éviter que la qualité de réactifs vont influencer l'efficacité du couplage des réactifs dessin humidité). Si l'efficacité de couplage est plus faible que prévu, les remèdes possibles comprennent l'augmentation des concentrations initiales de perles et de protéines. Si des concentrations plus élevées sont utilisées, la concentration de réactifs de couplage doit être augmentée proportionnellement à assurer un excès molaire suffisant. Modification concentrations billes / protéines est généralement une meilleure étape vers l'optimisation plutôt que d'augmenter les temps de réaction. Étant donné que les protocoles de couplage de talon sont longues, on prépare généralement une grande quantité de matière. Des aliquotes de la suspension peuvent être enfichable congelés dans l'azote liquide et conservés à -20 ° C pendant plusieurs mois. Aliquotes décongelés doivent pas être recongelés et doivent être conservés à 4 ° C et utilisés dans 1-2 jours. Cependant, cela peut varier avec la nature et la stabilité de la protéine utilisée comme cela devrait être testé sur un petit lot initialement.

adhésines Bead-couplées peut être utilisé pour de nombreuses applications, comme discuté ci-dessous. Ce protocole décrit un essai qui est couramment utilisé pour mesurer l'inhibition de la cytotoxicité de liaison et des agents pathogènes à médiation bactérienne sur les cellules hôtes. Le dosage est généralement effectuée pour mesurer la capacité de MMA propres de billes couplées à inhiber de manière compétitive l'infection des cellules épithéliales HeLa avec la mer-alimentaire agent pathogène d'origine Vibrio parahaemolyticus, en utilisant soit une diminution de la fixation des bactéries aux cellules hôtes ou réduit la cytotoxicité comme une lecture . Dans les deux cas, la préparation et la concurrence des essais suivent le même protocole. En fonction de la lecture, les différentes souches de V. parahaemolyticus sont utilisés: la souche cytotoxique POR1 est utilisé pour les mesures de cytotoxicité, tandis que la souche non-cytotoxique POR2 est utilisé pour mesurer l'adhésion bactérienne, depuis la mort cellulaire et le détachement des cellules compromet la procédure pour quantifier les bactéries fixées.

Initialement, compéexpériences de concur- été mis en place en tant que protocole par étapes, où les cellules hôtes sont d'abord pré-incubées avec des billes avant l'addition de bactéries. Pour V. parahaemolyticus et les spécifications de perles utilisées (2 um perles couplées à MAM7), deux des perles et des bactéries peuvent être ajoutés en même temps, sans changements dans la cytotoxicité résultant. Ie, dans ce dispositif expérimental, perles supplanter les bactéries pour la liaison cellule hôte. En fonction de l'espèce bactérienne et de perle géométrie utilisée, il peut y avoir de bonnes raisons de maintien de l'adhérence du bourrelet et une infection bactérienne comme deux étapes distinctes. Par exemple, pour infecter les cellules avec les bactéries non-motiles, les plaques sont centrifugées communément après l'addition du milieu de l'infection. Cependant, la centrifugation de suspensions contenant des plaques de talon doit être évitée, car cela conduit à une répartition très inégale des perles sur la couche de cellules. Si la taille des particules plus petites sont utilisées, perles prendront plus de temps à régler sur la surface de la cellule, dans ce cas, suFFICIENT temps devrait être autorisée pour bourrelet de fixation avant l'infection. Lorsque l'adhérence bactérienne est utilisé comme lire, les échantillons doivent être prises à des moments où les cellules hôtes ne sont pas significativement endommagés par la souche infectante, comme le détachement des cellules et la lyse peut compromettre la quantification des bactéries fixées.

Au lieu d'énumérer adhésion bactérienne par dilution et étalement, des échantillons peuvent également être traitées pour l'imagerie (Figure 5). Dans ce cas, les cellules de culture de tissus devraient être ensemencées sur des lamelles de verre, plutôt que directement dans les puits. En outre, des perles et des bactéries fluorescentes exprimant une protéine fluorescente peuvent être utilisés, ainsi que des marqueurs de cellules hôtes spécifiques à l'infection. Par exemple, des expériences de compétition sont généralement visualisés en utilisant la rhodamine fluorescente rouge-phalloïdine pour colorer le cytosquelette d'actine des cellules hôtes et évaluer les changements morphologiques résultant d'une infection, ainsi que des billes fluorescentes et fluorescentes bleuesverte (GFP exprimant ou SYTO18 teinté) bactéries.

Une gamme de adhésines de perles couplés, y compris le Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD et Vibrio parahaemolyticus MAM, ont été utilisés comme matériaux biomimétiques pour étudier l'adhérence, l'inhibition de l'adhérence et de la contribution de l'adhésion à un agent pathogène cytotoxicité à médiation ^{1, 7, 8.} L'un des avantages de l'utilisation de cette approche est la facilité de visualisation des événements de fixation, étant donné que les billes de polymère utilisés comme échafaudages sont disponibles dans une large gamme de couleurs (par exemple, bleue, rouge fluorescent, bleu, vert, orange). Ainsi, l'étiquetage directe des protéines, ce qui peut interférer avec la fonction, peut être évitée. En outre, la surface imite l'affichage de couplage multivalent de adhésines sur la surface bactérienne, traduisant ainsi une conformation plus physiologiquement pertinent par rapport aux protéines solubles.

Par rapport à des études utilisant des bactéries intactes ou bactérimutants al, l'approche de perles contourne les problèmes associés à la croissance bactérienne. Par exemple, à plus long terme (par exemple, O / N) les études sur l'adhérence bactérienne à des cellules hôtes à l'aide de bactéries intactes sont souvent compromis par les phénomènes qui accompagnent la croissance bactérienne - acidification du milieu de croissance et l'épuisement des nutriments affecter négativement les cellules hôtes, et la replication bactérienne finalement compromet la qualité de l'imagerie.

Plus récemment, l'utilisation de adhésines de perles couplé a été étendu pour inclure leur utilisation comme outils de purifications d'affinité de l'hôte cellulaire facteurs impliqués dans les processus aval de la fixation des bactéries de signalisation. V. parahaemolyticus MAM7, par l'intermédiaire de la liaison à des acides phosphatidiques dans la membrane de la cellule hôte, déclenche l'activation de RhoA et des réarrangements ^de l'actine ^{1, 3.} billes de MAM couplage sont utilisés pour purifier et d'identifier des protéines impliquées dans les plates-formes de signalisation montés à la suite de cellule MAM-hôte obligatoire. Depuis perles peuventfacilement être séparé du surnageant par une étape de centrifugation courte, et la protéine d'intérêt est couplé de manière covalente, ceci est une bonne méthode pour réaliser la séparation des protéines contaminantes et enrichir des complexes de protéines pertinentes, qui peut être utilisé pour les applications en aval, tels que la protéomique ou Western buvard.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)	Sigma	646547	Danger ; corrosif peut être acheté sous forme de solution ou fraîchement préparé
Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)	Fisher		PN22317 Danger ; toxique
L-cystéine	Sigma	30089	Danger ; toxique
Perles de latex, polystyrène modifié aux amines, bleu fluorescent - suspension aqueuse, 2,0 &mu ; m taille moyenne des particules	Sigma	L0280	nocif ; une gamme de tailles et de couleurs de particules alternatives est disponible
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)	Thermo scientific	22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo scientific	24500
Billes de polystyrène modifiées au carboxylate	Sigma	CLB9	nocives ; une gamme de tailles et de couleurs alternatives de particules est disponible
Ethylenediamine	Sigma	E26266	Danger ; inflammable, corrosif, toxique, sensibilisant
Albumine sérique bovine (BSA)	Promega	W3841
Bradford réactif	Sigma	B6916	Danger ; corrosif et toxique
Dulbecco' s Aigle modifié' s Glucose moyen - élevé - Avec 4 500 mg/L de glucose et de bicarbonate de sodium, sans  ; L-glutamine, pyruvate de sodium et rouge de phénol, liquides, filtrés stérilement, adaptés à la culture cellulaire	Sigma	D1145	pour les expériences d’infection
DMEM	Sigma	D6429	pour l’entretien des cellules hôtes cultivées
Sérum de veau fœtal, supplément	Sigma	F9665	pour milieu
de culture tissulairePénicilline-Streptomycine - Solution stabilisée, avec 10 000 unités de pénicilline et 10 ; mg streptomycine/mL, stérile-filtré, BioReagent, adapté à la culture cellulaire	Sigma	F9665	complément pour milieu de culture tissulaire
PBS	Sigma	D8537
LDH Kit de détection de cytotoxicité	Takara	MK401
Réservoirs de réactifs
	Greiner	662160
Plaques à 96 puits	Greiner	655182
Équipement
: hémocytomètre
lecteur
de microcentrifugation
, installations de culture tissulaire
Pipette