A Stroke Versatile modèle murin de Subcortical substance blanche pour l'étude de axonale Degeneration et blanc Matière Neurobiologie

Résumé

Nous présentons ici une méthodologie pour la production d’un coup focal dans la substance blanche murine par injection locale d’un inhibiteur endothélial irréversible de l’oxyde nitrique synthase (eNOS) (L-Nio). Deux variantes stéréotaxiques sont présentées, le traçage neuronal rétrograde et le marquage et la dissection de tissus frais, qui élargissent les applications potentielles de cette technique.

Résumé

Stroke affectant les comptes de la substance blanche jusqu'à 25% des présentations d'AVC cliniques, se produit en silence à des taux qui peuvent être 5-10 fois supérieure, et contribue de manière significative au développement de la démence vasculaire. Peu de modèles de focale course de matière blanche existent et ce manque de modèles appropriés a entravé la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la réponse des blessures et la réparation après ce type d'accident vasculaire cérébral. La principale limitation des autres modèles de course subcorticaux est qu'ils ne focalement restreignent pas l'infarctus à la matière blanche ou ont été principalement validées chez les espèces non-murins. Cela limite la capacité d'appliquer la grande variété d'outils de recherche murins pour étudier la neurobiologie du blanc coup de matière. Nous présentons ici une méthodologie pour la production fiable d'un accident vasculaire cérébral focal dans la matière blanche murin en utilisant une injection locale d'un inhibiteur de eNOS irréversible. Nous présentons également plusieurs variations sur le protocole général dont deux stéréotaxique uniquesvariations, traçage rétrograde neuronale, ainsi que l'étiquetage des tissus frais et dissection qui élargissent considérablement les applications potentielles de cette technique. Ces variations permettent de multiples approches pour analyser les effets neurobiologiques de cette forme commune et peu étudié d'accident vasculaire cérébral.

Introduction

L’AVC affectant la substance blanche sous-corticale est une entité clinique courante, représentant jusqu’à 25 % des AVC cliniques par an aux États-Unis ¹. Les lésions ischémiques de la substance blanche se produisent également silencieusement à un taux significativement plus élevé et contribuent au développement de la démence vasculaire ^2,3. À l’heure actuelle, les patients atteints de cette forme d’ischémie cérébrale ont peu ou pas de choix de traitement. Malgré l’importance clinique de cette maladie, il existe peu de modèles animaux cliniquement pertinents ^4,5.

L’objectif de ce protocole est de produire une lésion ischémique focale dans la substance blanche murine. Ce modèle murin de maladie humaine permet d’étudier spécifiquement la réponse des lésions axonales à l’AVC et la façon dont les éléments cellulaires de la substance blanche, à savoir les oligodendrocytes et les astrocytes ainsi que les axones, réagissent et se réparent après un AVC.

Des rapports précédents ont décrit un modèle d’AVC sous-cortical de la substance blanche utilisant l’endothéline-1 (ET-1) ⁶ qui est similaire à celui décrit ici. Plusieurs modifications clés ont été apportées au protocole expérimental, de sorte que les utilisations potentielles de ce modèle se sont étendues ^7,8. Ce protocole fournit une stratégie fiable et modifiable pour produire un trait focal dans la substance blanche du cerveau de la souris.

Les principaux avantages de ce modèle sont l’utilisation d’un inhibiteur chimique de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) N(5)-(1)-iminoéthyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ sans effets paracrines connus sur les éléments cellulaires de la substance blanche, ce qui était une complication des modèles utilisant l’endothéline-1 ¹⁰. De plus, le ciblage stéréotaxique de la substance blanche chez la souris permet l’utilisation de toute variété de souches transgéniques ou knock-out, élargissant considérablement les outils disponibles pour déterminer l’effet de l’AVC sur la substance blanche du cerveau. Ici, deux variantes de cette technique sont décrites et démontrent certaines des variations supplémentaires qui peuvent être utilisées pour améliorer la compréhension des lésions axonales et de la substance blanche et la réparation après un AVC.

Protocole

L'utilisation d'animaux dans ce protocole a été effectué conformément aux procédures approuvées par l'Université de Californie à Los Angeles Animal Care et utilisation Comité.

Remarque: Commencez par identifier la population murine cible. Dans des études antérieures, des souris de type sauvage uniquement mâles C57 / BL6 ont été utilisés, toutefois différentes souris transgéniques ou knock-out peuvent également être utilisés. Notez que les coordonnées stéréotaxiques sont basées sur C57 / BL6 anatomie. Il est recommandé que chaque utilisateur d'abord vérifier la localisation de la course à la substance blanche.

Induction de l'AVC 1. White Matter - Medial Approche coudé

1. Commencer par la préparation d' une pipette en verre tiré en utilisant un tube capillaire de 0,5 mm de telle sorte que le diamètre distal est compris entre 15 à 25 um ^11.
2. Préparer une aliquote stérile 10 ul de L-Nio (N (5) - HCl (1) -iminoethyl-L-ornithine) à 27,4 mg / ml (130 pM) dans stérile à 0,9% de solution saline normale.
3. Pré-remplir la pipette en verre tiréavec un petit volume de L-Nio (2-5 ul) en fixant la pipette en verre pour tube raccordé à une ligne de vide. Poser le plat de la pipette sur la paillasse et insérez l'extrémité tiré dans la solution de L-Nio.
   1. Appliquer le vide jusqu'à au moins 2 mm de la portion de 0,5 mm de la pipette est remplie. Éteignez l'aspirateur et retirer la pipette. Placez-le de côté jusqu'à l'étape 1.12.
4. Placer la souris dans une chambre d'induction et d' induire une anesthésie de la souris en utilisant le standard 32% d' isoflurane a coulé à travers un vaporiseur (5 L / min inhalée avec 5 L / min d' oxygène et de 0,5 L / min de _N2) pendant 1 minute ou jusqu'à profondément anesthésiés. Transfert de la souris à un appareil stéréotaxique équipé d'un microscope stéréotaxique. Fournir une anesthésie de maintenance en utilisant 32% d' isoflurane coulé à travers un vaporisateur (2 L / min inhalée avec 5 L / min d' oxygène et de 0,5 L / min _N2) et un cône de nez. Contrôler la profondeur de l'anesthésie avec une pincée d'orteil.
5. Régler le bras d'injection à 36 °.
6. Affixa tiré porte-pipette en verre à l'extrémité distale d'un système d'injection à basse pression de volume et l'attacher au bras d'injection de la configuration stéréotaxique.
7. Manteau de les moustaches de l'animal anesthésié avec de la gelée de pétrole et lieu artificiel larme pommade sur les deux yeux. Préparer un champ opératoire stérile en plaçant un champ stérile sur la tête de l'animal avec un 5-10 cm ouverture sur la tête. Préparer une surface chirurgicale aseptique en rasant la fourrure recouvrant le crâne. Nettoyer le cuir chevelu avec une alternance de bétadine et 70% des tampons d'alcool.
8. Faire un 1,5 cm du cuir chevelu midline incision avec des ciseaux fins stériles pour exposer la surface du crâne. Sécher le crâne avec un coton-tige stérile et en utilisant un microscope stéréotaxique à 1-3X grossissement, enlever tout le tissu du périoste recouvrant l'aide d'un outil de point de micro stérile.
9. Marquer le bregma comme point de référence à l'aide d'un marqueur à pointe fine.
10. Percez un craniotomie ellipitical 2 mm en utilisant une amende peu stérile de forage chirurgical stip0, en commençant à l'arrière du bregma et prolongeant en avant juste à gauche de la ligne médiane. Retirer des fragments d'os et des tissus mous recouvrant de telle sorte que le cortex cérébral peut être visualisé.
11. Gardez le champ opératoire et la surface corticale humide en appliquant de façon intermittente gouttes de solution saline stérile.
12. Fixer une pipette en verre tirée vers le bras d'injecteur de l'appareil stéréotaxique. Aligner l'extrémité distale de la pipette avec le bregma et remettre à zéro les coordonnées stéréotaxiques.
13. Avancer la pipette à la première antérieur / postérieur (A / P) et médial / latéral (M / L) des coordonnées fournies dans le tableau 1.
14. Faire avancer la pipette à la surface corticale et zéro dorsal / ventral (D / V) mesure.
15. Passer lentement la pipette dans le cerveau jusqu'à atteindre le premier D / V de coordonnées dans le tableau 1.
16. L'utilisation d'un système d'injection à basse pression de volume réglé à 20 psi pendant 20 impulsions msec, injecter 100 nl de L-Nio dans le cerveau et attendre 5 min pour empêcher le refluxla piste de la pipette.
    1. Utiliser un réticule étalonné dans l'oculaire du microscope stéréotactique et un grossissement de 3X.
    2. En conséquence, le déplacement d' un total de 0,100 mm ³ (0,5 mm de longueur dans une pipette de diamètre 0,5 mm, ce qui correspond à 100 nl) de la pipette de verre tiré pour chaque jeu de coordonnées. En utilisant un réticule, mesurer et normaliser puisque chaque mis en place varie en fonction de l'agrandissement et les échelles utilisées.
    3. Pour une mesure précise du volume lors de chaque injection, l'approche de la pipette coudée au microscope à partir du côté de telle sorte que le ménisque air-liquide a une vue sagittale. Le ménisque doit apparaître dans le même plan focal de la fois la paroi intérieure et extérieure de la pipette.
17. Retirez lentement la pipette et répétez les étapes 1.13-1.16.3 à la deuxième et troisième ensemble de coordonnées fournies dans le tableau 1.
18. Après la dernière injection, retirer la pipette et placez assez de cire d'os pour remplir le site de craniotomie. UNEpproximate les bords de la plaie du cuir chevelu et de se lier avec un adhésif cutané.
19. Injecter 0,1 ml de 0,5% Marcaine dans les bords de la plaie à l'aide d'une aiguille 30 G stérile pour éviter pour prévenir la douleur locale associée à l'incision du cuir chevelu.
20. Retour à l'animal de logement et de fourniture d'antibiotiques post-opératoire (0,48 mg / ml triméthoprime-sulfaméthoxazole, ou 0,5 mg / ml lévofloxacine) dans l'eau de boisson pendant 5 jours.

Induction de l'AVC 2. Blanc Matter - Postérieur Approche coudé

1. Effectuer les étapes 01.01 à 01.12 comme dans le protocole d'approche coudée médiane, à l'exception de régler le bras d'injection de la configuration stéréotaxique à 45 degrés orientés avant en arrière.
2. Avancer la pipette à la première A / P et M / L coordonnées fournies dans le tableau 2.
3. étapes restantes complètes 1.14-1.20 comme dans le protocole d'approche coudée latérale.

3. Retrograde Neuronal Étiquetage

1. Préparer un stérile 10aliquote ul de L-Nio à 54,8 mg / ml dans 0,9% de solution saline normale.
2. Préparer une aliquote stérile de 20% Fluororuby (ou 20% de dextran amine biotinylée ou 2% Fluorogold) dans 0,9% de solution saline normale.
3. Diluer ensemble 1: 1 à des concentrations finales de 27,4 mg / ml de L-NiO et de 10% Fluororuby.
4. Effectuer le protocole de course comme ci-dessus dans les étapes 1.3-1.23.
5. Visualisez le traceur fluorescent natif dans la section de tissu par fixation de perfusion, cryosectioning et microscopie comme décrit précédemment ^8.

4. Traitement des tissus pour immunofluorescence

1. A un intervalle post-AVC approprié allant de 3 heures à 14 jours après la course, euthanasier les souris par overdose isoflurane ou IACUC procédure locale approuvés.
2. Ouvrez la cavité thoracique à l'aide de ciseaux à angle et insérer une aiguille G 23 papillon dans le ventricule gauche.
3. Placer une petite incision dans l'oreillette droite à l'aide de ciseaux fins pour permettre une voie d'écoulement du fluide de perfusion.
4. Perfuser transcardiaque avec 30 à 40 ml de solution saline tamponnée au phosphate froid, suivi par 30 à 40 ml de paraformaldéhyde 4% à froid à un débit de 10 ml / min à la température ambiante.
5. Décapitez la souris et retirez le cerveau en utilisant des ciseaux stériles pour ouvrir le crâne arrière, puis retirez délicatement le crâne recouvrant avec une spatule, placez le cerveau en froid 4% PFA pendant 24 heures, puis transfert à 30% de saccharose dans du PBS pendant 48 heures .
6. Préparer quarante sections micron flottantes en utilisant un cryostat et effectuer un traitement d'anticorps comme décrit précédemment ^6-8. Dans cette étude, en utilisant les anticorps suivants: anticorps de lapin anti-neurofilament 200 (dilution 1: 500); de lapin anti-vimentine (1: 500); chèvre anti-GFAP (1: 500); lapin anti-Iba-1 (1: 1000).

5. Le traitement des tissus pour la protéine ou l'analyse de l'ARN

1. A un intervalle post-AVC approprié allant de 3 heures à 14 jours après la course, euthanasier par overdose isoflurane ou IACUC locale procédure approuvée.
2. Décapitez lasouris et retirer le cerveau à l'aide de ciseaux stériles pour ouvrir le crâne arrière, puis retirez délicatement le crâne sus-jacente avec une spatule.
3. Insérer une spatule stérile de 4 mm à l'avant du cerveau pour couper le bulbe olfactif et les nerfs optiques. Soulevez doucement le cerveau de la calotte crânienne et la placer dans la dissection tampon glacée (solution saline équilibrée de 1x Hank, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, glucose 35 mM, du bicarbonate de sodium à 4 mM, et 0,01 mg / ml cyclohexamide).
4. L'utilisation d'un bloc de cerveau et de nouvelles lames de rasoir stériles, préparer 2-3 dalles mm contenant la course et la place dans le tampon de dissection froide.
5. Sous un microscope de dissection, identifier la substance blanche sous-jacente du cortex moteur dans l'hémisphère injecté. À des intervalles plus longs post-AVC, la région peut être identifié visuellement par une nécrose focale et la myéline pâleur.
   Remarque: A des intervalles précédents post-AVC, l'injection de L-Nio mélangé avec 1 ul de 10% Fast Green peut permettre l'identification visuelle de la course ( La figure 4A).
6. Sous la direction d'un microscope à dissection et en utilisant un nouveau scalpel, disséquer soigneusement la région de la matière blanche contenant la course, soit identifiée par l'étiquetage vert rapide ou la perte de tissu. Retirer le cortex sus-jacent et le striatum sous-jacente comme souhaité.

Résultats

En utilisant le modèle présenté, la substance blanche sous-jacente forelimb cortex sensorimoteur peut sûrement être ciblé. Ce modèle de course induite chimiquement produit axonale focal et la perte de myéline, astrocytosis et microgliose (Figure 1), comme cela est généralement vu dans Infarctus lacunaires humaines. En utilisant trois injections, un modèle cliniquement utile est établie avec une altération précoce sur les tâches à moteur forelimb ⁷ et une petit...

Discussion

Un certain nombre de modèles antérieurs de l' AVC subcortical ont été décrites , y compris les injections focales de l' endothéline-1 dans la capsule interne, la substance blanche sous - corticale et striatum dans le ^6,15 rat ^12-14 et de la souris. Des modèles plus récents de petits coups focaux ont utilisé l' injection de micro - emboles de cholestérol dans l'artère carotide ¹⁶ et de l' occlusion photothrombotique d'un seul artériole pénétrant ^17. Chac...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
L-N5-(1-Iminoéthyl)ornithine, dichlorhydrate	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Tubes capillaires	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Configuration stéréotaxique	Kent Scientific	KSC51725
Extracteur de pipettes	KOPF	Modèle 720
Stéréomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Ciseaux fins	Outils scientifiques fins	14084-08
Pince	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Pince courbe	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Outil de dissection émoussée	Fine Scientific Tools	10066-15
Perceuse	Dremel	8220-1/28
Forets	Fine Outils scientifiques	19007-05
Vetbond	3M	1469SB  ;
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Triméthoprime-Sulfaméthaxole	STI Pharmacie	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30 mg
Paraformaldéhyde	Fisher	O4042-500
Saccharose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S
Lames en verre	Fisher	12-544-7
Fast Green  ;	Sigma	F7252-5G
Microscope de dissection	Nikon	SMZ1500
23 G Aiguille papillon	Fisher	14-840-35
10x Hank’s Balanced Salt Solution Life	Technologies	14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7,4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Bicarbonate de sodium	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810