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Article de méthode

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l'évaluation de l'interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

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DOI :

10.3791/53408

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17 décembre 2015

 , 
1Philips Institute for Oral Health Research, Virginia Commonwealth University, 2Department of Microbiology and Immunology, Virginia Commonwealth University, 3Department of Biochemistry, Virginia Commonwealth University

Dans cet article

Résumé

Cet article présente deux protocoles : l’un pour mesurer les bactéries anaérobies qui peuvent envahir et survivre avec succès dans l’hôte, et l’autre pour visualiser les bactéries anaérobies interagissant avec les cellules hôtes. Cette étude peut être appliquée à n’importe quel anaérobie cultivable et à tout type de cellule eucaryote.

Résumé

Les bactéries anaérobies sont beaucoup plus nombreux aérobies dans de nombreuses niches humaines telles que l'intestin, de la bouche et le vagin. En outre, les infections anaérobies sont fréquents et souvent d'origine indigène. La capacité de certains agents pathogènes anaérobies à envahir les cellules humaines leur donne des mesures d'adaptation pour échapper à l'immunité innée, ainsi que pour moduler le comportement de la cellule hôte. Cependant, veiller à ce que les bactéries anaérobies sont en direct pendant l'enquête expérimentale des événements peuvent poser des problèmes. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif, est capable d'envahir une variété de cellules non-phagocytaires eucaryotes. Cet article décrit comment réussir à la culture et d'évaluer la capacité de P. gingivalis à envahir les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Deux protocoles ont été développés: de mesurer les bactéries qui peuvent survivre avec succès envahir et à l'intérieur de l'hôte, et l'autre pour visualiser les bactéries qui interagissent avec les cellules hôtes. Ces techniques nécessitent l'utilisation d'un anaechambre pour fournir P. Robic gingivalis avec un milieu anaérobie pour une croissance optimale.

Le premier protocole est basé sur le test de protection aux antibiotiques, qui est largement utilisé pour étudier l'invasion des cellules hôtes par des bactéries. Toutefois, l'essai de protection antibiotique est limité; seules les bactéries intracellulaires qui sont cultivables et après un traitement antibiotique de lyse de la cellule hôte sont mesurées. Pour évaluer toutes les bactéries interagissent avec les cellules hôtes, à la fois vivants et morts, nous avons développé un protocole qui utilise la microscopie à fluorescence pour examiner l'interaction hôte-pathogène. Les bactéries sont marquées par fluorescence avec la 2 ', 7'-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine acétoxyméthyl ester (BCECF-AM) et utilisé pour infecter des cellules eucaryotes dans des conditions anaérobies. Suite à la fixation avec du paraformaldehyde et perméabilisation avec 0,2% de Triton X-100, les cellules hôtes sont marqués avec DAPI et TRITC phalloïdine pour marquer le cytosquelette de la cellule et du noyau, respectivement. Multiple images prises à différents points focaux (Z-Stack) sont obtenus pour la visualisation spatio-temporelle des bactéries. Les méthodes utilisées dans cette étude peuvent être appliqués à n'importe quel anaérobie cultivable et n'importe quel type de cellule eucaryote.

Introduction

Les bactéries anaérobies colonisent presque toutes les surfaces du corps humain. Bien prédominant dans la flore intestinale des voies génito-urinaires et où les concentrations d'oxygène sont faibles, ils existent également à des niveaux élevés sur la peau, de la bouche, du nez et de la gorge 1. Les bactéries anaérobies sont une cause fréquente d'infections endogènes et sont fréquemment isolés à partir de sites malades. Toutefois, en raison de leur nature fastidieuse, anaérobies peuvent être difficiles à isoler et à la culture. Les études portant sur les bactéries anaérobies doivent être effectuées dans des conditions restreintes. Techniques anaérobie-culture moderne permettent aux chercheurs d'imiter les paramètres anaérobies nécessaires à l'étude de nombreuses souches de laboratoire anaérobie ou même des isolats cliniques 2,3.

Des bactéries anaérobies pathogènes ont développé une relation dynamique et co-évolution avec les cellules de l'hôte dans lequel ils résident. La plupart des bactéries anaérobies sont sensibles à la destruction par la réponse immunitaire de l'hôte avant d'atteindre infectiniveaux UO. Cependant, certaines bactéries pathogènes ont développé des mécanismes pour échapper à ou dénaturer la réponse immunitaire de l'hôte. Ils atteindre cet objectif par le biais de mécanismes tels que l'évasion de la reconnaissance immunitaire, neutralisation des médiateurs immunitaires, l'altération de l'immunité à médiation cellulaire, l'invasion des cellules hôtes, et la modification de la signalisation 4 immunitaire. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif impliquées à la fois orale et maladies, extra- est un exemple d'un agent pathogène bactérien très adapté capable de provoquer des changements pathogènes chez l'hôte 7.5.

Des poches de la plaque de biofilm courus dans de profondes crevasses formées entre les dents et le tissu muqueux gingival peuvent abriter des bactéries anaérobies qui sont protégés de l'oxygène atmosphérique 8. Ces poches parodontales servir de niche de divers agents pathogènes anaérobies, telles que P. 9 gingivalis. P. gingivalis est un agent pathogène de la distorsion qui est capable de remodelering la communauté microbienne buccale de manière à promouvoir le développement et la progression des maladies parodontales 10. Elle produit un grand nombre de facteurs de virulence qui sont actifs contre un large spectre de protéines de l'hôte et fournit des mécanismes pour l'évasion de 11 défenses de l'hôte. Il est également capable d'envahir épithéliales, endothéliales, fibroblastes et les cellules du ligament parodontal in vitro et in vivo de 12 à 14 15. En envahissant efficacement les cellules de l'hôte, P. gingivalis peut échapper à l'immunité de l'hôte. Invasion efficace de cellules hôtes non seulement permet à la bactérie de se échapper défenses de l'hôte, mais sert également de réservoir pour l'avenir ré-infection ainsi que modifie la cellule hôte. Des études sur les mécanismes moléculaires impliqués dans l'adhésion et l'internalisation de la bactérie par des cellules hôtes sont nécessaires. Recherche dans plusieurs laboratoires se concentre sur la compréhension des événements moléculaires associés à l'internalisation de P. gingivalis par les cellules hôtesainsi que les mécanismes utilisés pour réprimer et détourner la réponse immunitaire et survivre aux mécanismes de défense de l'hôte hostiles.

Il existe de nombreux dosages capables d'identifier et de caractériser des agents pathogènes qui sont capables d'envahir les cellules hôtes. Cependant, des études in vitro avec des agents pathogènes anaérobies posent de nombreux problèmes expérimentaux pour le chercheur, principalement parce qu'il est difficile de réaliser des études qui reposent sur ​​des instruments encombrants en l'absence d'oxygène. Cette situation est aggravée par le fait que les cellules eucaryotes besoin d'oxygène pour se développer et doivent donc être préparés séparément dans des incubateurs de culture de tissus. Une façon d'éviter ces obstacles serait d'effectuer les études sous oxygène atmosphérique, mais ce serait faire de la croissance de bactéries anaérobies impossible. Une autre méthode serait d'utiliser des bactéries tuées par la chaleur à infecter et à étudier les interactions de la cellule hôte. Cependant, des différences existent entre les bactéries tuées par la chaleur et viables qui diminuent la pertinence de la interacti hôte-pathogènele 16. Il est central pour étudier les bactéries viables avec l'expression inchangé interagir avec des cellules hôtes; par conséquent, des procédés pour cultiver P. gingivalis dans un cadre anaérobie sont donnés. En outre, deux protocoles rentables simples sont démontrées pour évaluer la capacité de P. gingivalis à être internalisée par les cellules humaines ombilicales veineuses endothéliales (HUVEC). Le premier protocole est basé sur le dosage de protection populaire antibiotique. Bien que le test est simple, les considérations lors de l'utilisation de micro-organismes anaérobies sont donnés. Le deuxième protocole nécessite l'utilisation d'un microscope à fluorescence à balayage visualiser et interagir internalisé P. gingivalis. Chaque test a ses limites et avantages qui seront discutés de fournir au chercheur un aperçu pour l'étude de l'envahissement de bactéries anaérobies. Bien que le manuscrit en cours étudie P. gingivalis et HUVECs, ces protocoles peuvent être utilisés pour de nombreuses autres bactéries anaérobies ainsique pour les autres types de cellules hôtes.

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Protocole

Les protocoles suivants décrivent des procédés de mise en culture et l'étude de l'invasion par les espèces anaérobies, P. gingivalis; Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour un certain nombre d'agents pathogènes anaérobies. Bien HUVECs sont utilisés, ce protocole peut être utilisé pour d'autres cellules eucaryotes fois immunitaires et non immunitaires.

1. anaérobie Chambre utilisation et d'entretien

Remarque: P. gingivalis est un anaérobie sensibles à des niveaux normaux d'oxygène rencontrées dans l'air ambiant. Un environnement anaérobie contrôlé est essentiel pour la culture de P. gingivalis.

  1. Ici, maintenir une atmosphère artificielle désigné comme gaz anaérobie mixte (80% de N 2, 10% de H2, 10% CO 2) dans une chambre anaérobie de vinyle (figure 1A). Utiliser un sas (figure 1B) pour transférer des objets dans l'environnement du laboratoire de la chambre anaérobie. Le sas fonctionne manuellement, twpurge de la glace avec du gaz N 2 avant d'introduire le gaz anaérobie mixte.
  2. Utilisation d'une colonne d'élimination de sulfure d'hydrogène (Figure 1C) pour l'enlèvement d'entretien de l'hydrogène sulfuré indésirable. Placer un déshumidificateur dans la chambre pour éliminer H 2 O créé par le catalyseur et d'éviter les aérosols qui facilitent la propagation de la contamination.
    Remarque: Le sulfure d'hydrogène est un sous-produit métabolique naturel de nombreuses bactéries anaérobies et son accumulation est toxique pour les bactéries et peut entraîner des dommages à l'électronique et de diminuer la durée de vie d'un catalyseur.
  3. Utiliser une boîte de ventilateur pour faire circuler l'atmosphère de la chambre à travers un catalyseur au palladium, ce qui élimine l'oxygène en présence d'hydrogène (figure 1D).
    Remarque: Une atmosphérique (HEPA) faire recirculer l'air élimine les contaminants d'une taille de 0,22 pm ou plus.
  4. Culture bactéries anaérobies dans un incubateur à 37 ° qui se trouve à l'intérieur de l'anaérobiechambre. Utilisez des techniques aseptiques standards lorsque vous travaillez à l'intérieur de la chambre anaérobie.

figure-protocol-1
Figure 1. chambre anaérobie de vinyle et ses composants. (A) une chambre anaérobie de vinyle scellé complètement à partir de l'oxygène atmosphérique fournit espace de travail pour deux personnes à la fois (en 32 x 78 in). Il contient un incubateur réglé à 37 ° C (milieu du dos). (B) un sas est utilisé pour le transfert des objets dans l'environnement de laboratoire à la chambre anaérobie. Sur la photo, un sas automatique commandé par un contrôleur qui peut être programmé pour exécuter automatiquement les procédures de vide et de purge nécessaires pour créer un environnement anaérobie. (C) Un sulfure d'hydrogène colonne d'élimination fournit haute capacité élimination sans entretien des indésirables du sulfure d'hydrogène. (D) Deux boîtes de ventilateur de catalyseur sontplacé dans toute la chambre anaérobie pour faire circuler l'atmosphère de la chambre à travers un catalyseur au palladium, ce qui, en présence d'hydrogène, élimine l'oxygène. La chambre anaérobie est mis en place selon les instructions du fabricant. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Préparation des bactéries anaérobies

Remarque: P. gingivalis est aérotolérants et peut être stocké dans des conditions aérobies, mais il ne sera pas croître en présence d'oxygène à des niveaux plus élevés de 6% 17,18. Une chambre anaérobie est nécessaire pour la bonne culture de P. gingivalis et d'autres espèces anaérobies (figure 1). Une bonne formation et d'éducation sur l'utilisation de la chambre anaérobie est nécessaire avant de travailler avec microanaerobes 19.

  1. Equilibrer tous les milieux liquides et des plaques à condit anaérobieions pendant au moins 12 heures avant l'expérimentation pour éliminer l'oxygène résiduel.
  2. Transfert P. gingivalis de -80 ° C congélateur chambre anaérobie, laisser décongeler.
  3. Streak P. gingivalis sur des plaques de gélose au sang de soja trypticase (TSA II avec du sang de mouton à 5%). Enveloppez plaques en parafilm et conserver à 37 ° C dans un incubateur anaérobie pendant 4-7 jours.
  4. Inoculer P. gingivalis dans 3 perfusion cardiaque ml du cerveau (BHI) complétées par hémine et ménadione, un milieu liquide non-sélectifs enrichis pour l'isolement et la culture de micro-organismes anaérobies et fastidieux, en utilisant des boucles stériles.
    Remarque: Pour le stockage à long terme, mélanger les cultures bactériennes préparés BHI avec le glycérol ou DMSO (10-20% concentration finale) et placer dans un congélateur à -80 ° C.
  5. Préparer une culture de départ de P. gingivalis en faisant une dilution 1:10 et permet aux bactéries de croître jusqu'à la phase mid-log.

Note: La densité optique du bacsuspension TÉRIAU est déterminé et la concentration pour chaque souche bactérienne à examiner est ajustée. Pour P. gingivalis une suspension à DO 660 de 0,7 correspond à la phase mi-log et ~ 7 x 10 8 cellules / ml. Les conditions de croissance décrites dans le protocole ci-dessus sont spécifiques de P. gingivalis et peuvent avoir besoin d'être adapté pour d'autres souches bactériennes.

3. cellules endothéliales Culture

Remarque: Achat regroupé HUVECs primaires et de la culture en milieu de base contenant des facteurs de croissance endothéliaux vasculaires (VEGF) à 37 ° C dans 5% de CO 2 selon les instructions du fabricant.

  1. HUVECs de semences en flacons T-75 à 2,5 x 10 5 cellules / flacon dans 15 ml médias VEGF.
    Remarque: Vérifiez la viabilité par une dilution 1: 1 avec 4,0% de bleu trypan. Les cellules avec une membrane compromis conservera bleu trypan, les cellules saines avec des membranes intactes apparaîtront blanches lorsqu'elles sont visualisées sous un microscope optique binoculaire. ConT 100 cellules, en sorte que plus de 80% des cellules sont viables 20.
  2. Remplacez le support tous les 2 jours avec les médias préchauffé VEGF fraîche jusqu'à ce que les cellules atteignent ~ 80% de confluence.
  3. Laver les cellules une fois avec PBS préchauffé. Libérer les cellules de la fiole T75 par incubation avec 2 ml de trypsine-EDTA (0,25%) pendant 5 min, suivie de neutralisation par une solution de 2 ml de trypsine.
  4. Recueillir HUVEC en suspension dans un tube conique de 50 ml. Laver toutes les cellules supplémentaires à partir de flacons T-75 avec du PBS et 50 ml de transférer des tubes coniques.
  5. Centrifuger les cellules à 200 g pendant 10 min.
  6. Retirer le surnageant, suspendre culot cellulaire dans 10 ml de médias de VEGF préchauffé.
  7. Déterminer la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre ou similaire dispositif de comptage cellulaire.
  8. Calcul du montant de la suspension cellulaire à ajouter à soit plaque de 6 puits (400 000 / puits) ou une plaque de 12 puits avec des lamelles (50 000 / puits). HUVECs sera prêt pour l'expérimentation le lendemain.

4. Essai de survie Invasion / Interaction(Placage)

Remarque: Lorsque vous effectuez ce test, préparer deux plaques de cellules endothéliales ensemencées à 400.000 cellules / puits 6 puits. Une plaque sera utilisée pour évaluer bactéries fixées à internalisés et par des cellules hôtes. L'autre plaque représentera pour les bactéries intracellulaires. La plaque de 6 puits permet en triple de deux échantillons à être effectuées en une seule expérience. Pour un aperçu de ce protocole s'il vous plaît se référer à l'analyse de la survie organigramme (Figure 2).

  1. Préparer des bactéries anaérobies comme décrit ci-dessus (voir la section 1) jusqu'à ce qu'ils atteignent la croissance mi-log (OD 660 0,5-0,7).
  2. Bactéries centrifuger à 5000 g pendant 10 min.
    Remarque: Si la centrifugeuse est en dehors de la chambre anaérobie, porter échantillons bactériens dans un tube de 15 ml hermétiquement fermés, enveloppez le bouchon avec du parafilm pour éviter les fuites d'oxygène.
  3. Placez granulés P. gingivalis retour dans la chambre, éliminer le surnageant. Laver avec du PBS, les bactéries de granulés de nouveau avant remise en suspension dans VEGF-moidia. Préparer des suspensions pour toutes les souches bactériennes à tester à une DO 660 de 0,7 qui correspond à la phase mi-log (environ 7 x 10 8 cellules / ml). Les bactéries sont maintenant prêts pour l'infection.
  4. Transfert des plaques à 6 puits contenant des cellules HUVEC à partir de tissu en culture incubateur. Chambre anaérobie Retirez le support et laver trois fois avec PBS anaérobie. Ajouter 2 ml de milieu de VEGF anaérobie dans chaque puits et placer les plaques à 37 ° C dans l'incubateur anaérobie pendant 20 minutes pour équilibrer la température de l'infection.
    Remarque: les bactéries de plaque sur des plaques d'agar de sang pour assurer ceux utilisés pour l'infection sont homogènes et non contaminés lors de l'infection.
  5. Infecter les cellules hôtes avec des bactéries à une multiplicité d'infection (MOI: bactéries hôtes) de 100: 1.
    Remarque: le nombre de cellules HUVEC est déterminé en effectuant un test d'exclusion trypan sur un seul bien avant l'infection. Le nombre de cellules bactériennes est déterminé par la densité optique (par exemple, de 0,5 OD = 5 x 10 8 cellules / ml). Bacterial concentration est ajustée à bon MOI basée sur la concentration HUVECs 21.
  6. Placer plaques de 6 puits avec des cellules HUVEC infectées en incubateur anaérobie et les bactéries permettent d'interagir avec les cellules hôtes pendant 30 min.
  7. Préparation de saponine dans du BHI (1,0% p / v) à l'intérieur de la chambre anaérobie et filtrer à travers un filtre de 0,2 um.
  8. La survie de deux bactéries fixées et intériorisées.
    1. Retirer les plaques de l'incubateur, les médias aspirer, laver trois fois avec PBS anaérobie et ajouter 2 ml filtrés 1,0% de saponine (préparé comme décrit dans l'étape 4.8). Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte.
    2. Racler fond de chaque puits avec un grattoir à cellules. Recueillir le mélange de cellules de chaque puits et faire une dilution de 1: 1 dans du BHI.
    3. Passez à réaliser des dilutions de l'échantillon. Selon les espèces bactériennes et de la concentration, de régler des dilutions en série. Commencez avec 1: 100 ou 1: 1000 dilutions.
    4. Plaque 200 ul de la dilution souhaitée sur des plaques de gélose au sang. Wrap til plaques en parafilm et placer dans l'incubateur anaérobie à 37 ° C.
    5. Après sept jours d'incubation à 37 ° C, retirer les plaques et à compter unités formant colonie (UFC) en utilisant une boîte à lumière de compter manuellement colonies.
      Remarque: UFC sont énumérés. Pour de plus grandes quantités de UFC, les images peuvent être prises et des logiciels peuvent être utilisés pour faciliter le dénombrement des UFC.
  9. La survie des bactéries internalisées.
    1. Retirer les plaques de l'incubateur. Laver trois fois avec du PBS et anaérobie ajouter 2 ml de milieux de VEGF avec additionné d'antibiotiques (300 pg / ml de gentamicine et de 400 ug / ml de métronidazole).
    2. Incuber pendant 1 heure. Veillez à tester les antibiotiques de sorte qu'ils sont 100% efficace pour tuer la souche bactérienne désirée et assurez-vous qu'ils ne pénètrent pas dans les cellules hôtes 22,23.
    3. Aspirer le milieu, ajouter 2 mL de 1,0% filtrée saponine. Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte.
    4. Racler le fond de chaque well avec racleur de cellules. Recueillir le mélange de cellules de chaque puits et faire dilution 1: 1 dans du BHI.
    5. Préparer des dilutions en série de l'échantillon (1: 100, 1: 1000).
    6. Plaque 200 ul de la dilution souhaitée sur des plaques de gélose au sang. Enveloppez plaques en parafilm et placer dans un incubateur anaérobie.
    7. Après sept jours d'incubation à 37 ° C enlever les plaques et à compter UFC.

figure-protocol-2
Figure 2. Représentation schématique d'un protocole utilisé pour la survie des bactéries anaérobies avec des cellules eucaryotes. Les deux tests pour une survie bactérienne totale et la survie des bactéries intériorisées peuvent être effectuées en même temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5. L'internalisation des bactéries dans This HostLLS (microscopie à fluorescence)

Remarque: P. gingivalis est marqué avec la 2 ', 7'-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine, acétoxyméthyl ester (BCECF-AM). BCECF-AM est un colorant de membrane perméable non fluorescent; BCECF sa conversion en fluorescéine sous l'action des esterases intracellulaires de peut indiquer la viabilité cellulaire. P. gingivalis est marqué avec le colorant BCECF-AM et ensuite utilisé pour infecter des cellules eucaryotes. Après l'infection, les cellules sont fixées et marquées au DAPI et TRITC-phalloïdine. La tache de DAPI utilisé pour colorer le noyau de la cellule eucaryote sera également étiqueter noyau de la cellule bactérienne, qui fournit une contre-mesure pour identifier les bactéries non viables qui ne peuvent pas métaboliquement cleave BCECF-AM. Les cellules hôtes sont mises en évidence par la phalloïdine-TRITC, un colorant rouge de l'actine.

  1. Lamelles autoclave. Ajouter stérilement lamelles à plaques à 12 puits avant de semer les cellules endothéliales à 5 x 10 4 cellules / puits. (Journée Préparé avant l'expérience)
  2. Ai préparés sur des cellules endotheliales de 18 mm (# 1.5) d'épaisseur Lamelles circulaires dans des plaques à 12 puits comme décrit ci-dessus.
  3. Préparer bactéries anaérobies cultivées jusqu'à la phase mid-log (OD 660 = 0,5-0,7) comme décrit dans l'article 1.
  4. Laver les bactéries anaérobies 2x avec du PBS par centrifugation à 5000 xg et de mise en suspension le culot dans du PBS à 5-7 x 10 8 cellules / ml.
  5. Ajouter 20 ul de 0,2 mM de BCECF-AM à 2 ml de suspension bactérienne (5-7 x 10 8 cellules / ml) jusqu'à une concentration finale de BCECF-AM de 2 uM.
  6. Incuber à 37 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
  7. Des plaques de transfert avec les cellules endothéliales ensemencées sur 18 mm (# 1.5) d'épaisseur des lamelles circulaires de culture de tissu dans la chambre incubateur anaérobie. Laver avec du PBS et l'échange avec les médias de VEGF anaérobie.
    Remarque: Vérifiez que HUVECs sont en bonne santé sous un microscope optique. HUVEC devrait être ~ 80% de confluence, la morphologie devrait être comparable à des fabricants.
  8. Centrifuger étiqueté à bactéries5000 xg pendant 10 min pour éliminer le colorant résiduel BCECF-AM. Mettre en suspension dans 2 ml de milieu de VEGF anaérobie.
  9. Infecter les cellules hôtes avec des bactéries marquées à MOI de 100: 1 (bactéries: accueil).
  10. Incuber à chambre anaérobie à 37 ° C pendant 30 min.
  11. Après que les cellules de lavage de l'infection avec PBS trois fois et fixer fraîchement préparée 4,0% de paraformaldehyde pendant 10 min.
    Remarque: Après que les cellules de fixation, l'expérience peut être menée à l'extérieur de la chambre anaérobie.
  12. Laver avec lamelles de PBS à trois reprises.
  13. Ajouter 1 ml de 0,2% de Triton X-100 pendant 10 min.
  14. Laver avec lamelles de PBS à trois reprises.
  15. Ajouter 50 ul de TRITC phalloïdine (50 ug / ml) à lamelles pendant 45 minutes.
  16. Lavez lamelles de trois fois, retirer de la plaque de 12 puits et les placer sur une diapositive avec soft-jeu milieu de montage contenant DAPI. Sceller les côtés avec du vernis à ongles.
    Remarque: Les lames peuvent être stockées pendant quelques mois dans l'obscurité. Évitez exposition à la lumière pour éviter photo-blanchiment.
  17. Voir les diapositivesen utilisant un microscope confocal.
    1. Ici, utilisez un système 34 de canal spectrale (détecteur de réseau 32-canal et deux détecteurs de PMT de côté, plus un détecteur de lumière transmise) configuré autour d'un AxioObserver (inversé) stand avec un étage XY motorisé. Le système dispose de cinq lasers: diode bleue (405 nm), multi-ligne Argon (458, 488, 514 nm), diode verte (561 nm), rouge HeNe (633 nm) et un laser pulsé 440 nm. Équipé d'un système d'imagerie de vie de fluorescence avec 2 détecteurs de GaAsP hybrides (pour FRET-FLIM).
    2. Détecter la fluorescence à partir de DAPI et TRITC dans une chaîne à l'aide d'un filtre bi-bande avec des longueurs d'onde d'excitation de 340-380 nm et 540-560 nm, et un filtre d'émission de 435-485 nm et 570-590 nm, respectivement. Détecter la fluorescence de BCECF-AM en utilisant un filtre avec une excitation longueur d'onde de 440-500 nm et un filtre d'émission de 510 à 590 nm.
      Remarque: Les commandes de BCECF-AM doivent être effectuées sur chaque souche bactérienne à l'étude pour assurer l'étiquetage approprié des bactéries viables. Première valider que nonviabLe bactéries sont DAPI-positif et BCECF négatif. Deuxièmement, veiller à ce que des bactéries vivantes peuvent métaboliser BCECF-AM dans la fluorescéine BCECF. Peut-être besoin d'être testés pour l'étiquetage optimale des concentrations variables de bactéries ou BCECF-AM colorant.

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Résultats

Protocoles décrits ci-dessus ont été utilisés dans l'étude de l'interaction hôte-pathogène entre P. gingivalis et les cellules endothéliales. P. gingivalis W83 et une p gingivalis V3150 portant une délétion de PG0228 ont été utilisés dans l'étude. Le PG0228 est prédit pour coder pour une protéine susceptible de modifier les niveaux d'ARN et de protéines, qui peuvent en fin de compte affecter l'interaction de P. gingivalis avec les cellules hôtes. Pour étud...

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Discussion

Tous les procédés ci-dessus peuvent être utilisées pour concevoir des dosages spécifiques pour évaluer l'interaction entre les bactéries anaérobies avec des cellules eucaryotes. Cependant, il ya plusieurs considérations à effectuer avec succès les expériences. D'abord, les souches microbiennes à être utilisés dans une étude.

Il est essentiel dans la comparaison des deux souches à la fois le test de survie, ainsi que par une analyse par microscopie qu'ils sont à des phases de croi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Hiroshi Miyazaki, le Dr Scott Henderson, le Dr Todd Kitten, le Dr Justin Hutcherson, le Dr Catherine Jauregui et Collin R. Berry. Ce travail a été soutenu par des subventions NIH NIDCR R01DE016124, R01DE018039 et R01DE023304 à J.P. Lewis.

Microscopie a été réalisée au département d’anatomie et de neurobiologie de la VCU, financée en partie par la subvention de base du NIH-NINDS Center (5P30NS047463).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chambre anaérobie en vinyle de type BCoy ProduitsModèle 2000 incubateur  ;
Gélose de soja TSA II trypticase avec 5 % de sang de moutonBBL221261
cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine Pool 10 donneurs TechnologieLifeLineFC-0044
VascuLife VEGF Medium Kit completLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
SaponinRiedel-de Haen16109
Sulfate de gentamicine SelSigma-AldrichG-1264
MétronidazoleSigma-AldrichM-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC Phalloïdine  ;Sigma-AldrichP1951
18 mm Recouvrement circulaireMicroscopie électronique Sciences72222-01
Support de montage VectaShield avec DAPIVector LaboratoriesH-1200
de laboratoire

Références

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, öZ. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787(2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. III C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039(2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616(2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226(2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).

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