L'eau dans l'huile Emulsions: un nouveau système d'assemblage des protéines Chlorophylle liaison solubles dans l'eau avec Pigments hydrophobes

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode simple et à haut débit pour l'assemblage des protéines solubles dans l'eau avec des pigments hydrophobes qui est basée sur des émulsions eau-dans-huile. Nous démontrons l'efficacité de la méthode dans l'ensemble des chlorophylles indigènes avec quatre variantes de l' eau-soluble dans la chlorophylle recombinante des protéines de liaison (WSCPs) de plantes Brassica exprimé dans E. coli.

Résumé

Chlorophylles (CHLS) et bactériochlorophylles (BCHLS) sont les cofacteurs primaires qui effectuent la récolte de lumière photosynthétique et de transport d'électrons. Leur fonctionnalité dépend essentiellement de leur organisation spécifique au sein de grandes et complexes complexes protéiques multimérique transmembranaires. Afin de comprendre au niveau moléculaire comment ces complexes facilitent la conversion de l'énergie solaire, il est essentiel de comprendre la protéine-pigment, et les interactions pigment pigment, et leur effet sur la dynamique excités. Une façon d'obtenir une telle compréhension est par la construction et à l'étude des complexes de CHLS avec des protéines recombinantes solubles dans l'eau simples. Cependant, l'incorporation des CHLS et BCHLS lipophiles dans les protéines solubles dans l'eau est difficile. De plus, il n'y a pas de méthode générale qui pourrait être utilisé pour l'assemblage des protéines solubles dans l'eau avec des pigments hydrophobes. Ici, nous démontrons un système de débit simple et haute à base d'émulsions eau dans l'huile, ce qui permet le culembly de protéines solubles dans l'eau avec CHLS hydrophobes. La nouvelle méthode a été validée par l' assemblage des versions recombinantes de la protéine de liaison à la chlorophylle soluble dans l'eau des plantes brassicacées (WSCP) avec un Chl. Nous démontrons l'assemblage réussi de Chl a l' aide de lysats bruts de WSCP exprimant E. cellule coli, qui peut être utilisé pour le développement d' un système de criblage génétique pour de nouvelles protéines Chl liant soluble dans l'eau, et pour l' étude des interactions Chl-protéine et des procédés d'assemblage.

Introduction

des pigments hydrophobes tels que les chlorophylles (CHLS), bactériochlorophylles (Bchl) et caroténoïdes sont des cofacteurs primaires dans les centres réactionnels photosynthétiques et les protéines de récolte de lumière qui effectuent le transport d'électrons, et la capture de l'énergie lumineuse et de transfert. Les centres réactionnels et la plupart des antenne collectrice CHL-liaison sont des protéines transmembranaires. La protéine Fenna-Matthews-Olson (FMO) des bactéries vert-soufre photosynthétique non oxygénés ^1,2, et la protéine péridinine-Chl (PCP) de dinoflagellés ³ sont des exemples exceptionnels de protéines lumière de réco....

Protocole

1. Préparation de Chl un stock Solutions

1. ÉTAPE CRITIQUE: Effectuez toutes les étapes de la préparation de la chlorophylle dans une hotte chimique, sous la lumière verte (520 nm) ou dans l'obscurité afin de minimiser le photovieillissement. Toujours ajouter azote ou l'argon avant la congélation des pigments pour le stockage. Veiller à ce que tous les solvants sont de qualité analytique.
2. Peser environ 5 mg de cellules Spirulina platensis lyophilisées ou d' autres cellules cyanobactérie ne contenant que Chl a dans les membranes thylacoïdes et l' écraser à l' aide d' un mortier et un pilon.
3. Charger ....

Résultats

Apoprotéines WSCP recombinants ont été assemblés avec un Chl dans les émulsions E / H selon le protocole décrit dans la section précédente. Le protocole a été réalisé en utilisant des phases aqueuses contenant soit WSCPs purs, ou des lysats de E. coli surexprimant les cellules WSCP (figure 1). Le protocole est simple, rapide et ne nécessite aucun équipement spécial, sauf un homogénéisateur de tissu.

Discussion

Notre objectif était de développer un nouveau système général pour l'assemblage des protéines de chlorophylle liant soluble dans l'eau avec des pigments hydrophobes. Ici , il est indiqué que le nouveau système de reconstitution basée sur émulsion E / H est une approche générale éprouvée à travailler pour l' assemblage des apoprotéines WSCP de choux de Bruxelles, chou - fleur, raifort japonais et Virginia pepperweed exprimées par recombinaison dans E. coli. Voici les résultats sont présentés à partir.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Huile minérale	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Chromatographie d’affinité pour la purification WSCP avec séquence native.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Chromatographie d’affinité pour la purification WSCP avec His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Milieu de chromatographie pour la purification de la chlorophylle