Article de méthode

Génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques Exprimant rapport optimal de Gata4, MEF2C et Tbx5

DOI :

10.3791/53426

⸱

13 novembre 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un protocole pour la génération d’iCM en utilisant l’administration médiée par rétrovirus de Gata4, Tbx5 et Mef2c dans une construction polycistronique. Ce protocole produit une population relativement homogène de cellules reprogrammées avec une efficacité et une qualité améliorées et est précieux pour les études futures de reprogrammation iCM.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La conversion directe des fibroblastes cardiaques (SCF) en cardiomyocytes induites (ICMS) détient un grand potentiel pour la médecine régénérative en offrant des stratégies alternatives pour le traitement de la maladie de coeur. Cette conversion a été obtenue par expression forcée de facteurs tels que définis Gata4 (G), MEF2C (M) et Tbx5 (T). Traditionnellement, ICMS sont générés par un cocktail de virus exprimant ces facteurs individuels. Cependant, la reprogrammation efficacité est relativement faible et la plupart de l'in vitro G, M, T-fibroblastes transduits ne deviennent pas entièrement reprogrammés, ce qui rend difficile l'étude des mécanismes de reprogrammation. Nous avons récemment montré que la stoechiométrie de G, M, T est cruciale pour l'efficacité de reprogrammation ICM. Une stoechiométrie optimale de G, M, T avec relativement haut niveau de M et de faibles niveaux de G et T obtenus à l'aide de notre vecteur de MGT polycistronique (ci-après dénommé MGT) a augmenté de manière significative l'efficacité de la reprogrammation et amélioration de la qualité iCM in vitro. Ici nous fournissons une description détaillée de la méthodologie utilisée pour générer ICMS avec MGT construction à partir de fibroblastes cardiaques. Isolement des fibroblastes cardiaques, la génération du virus pour la reprogrammation et l'évaluation du processus de reprogrammation sont également inclus afin de fournir une plate-forme pour la production efficace et reproductible du SGCI.

Introduction

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Les maladies cardiovasculaires restent la principale cause de décès dans le monde, avec 17,3 millions de décès par an1. La perte de cardiomyocytes résultant d’un infarctus du myocarde (IM) ou d’une insuffisance cardiaque progressive est une cause majeure de morbidité et de mortalité2. En raison de leur capacité de régénération limitée, les cœurs de mammifères adultes souffrent généralement d’une altération de la fonction de pompe et d’une insuffisance cardiaque à la suited’une blessure 3-6. En tant que tel, la (ré)génération efficace de cardiomyocytes in vivo et in vitro pour le traitement des maladies cardiaques et pour la modélisation des maladies est une question critique qui doit être abordée.

Le développement récent de la reprogrammation directe, qui reprogramme directement les cellules d’un phénotype différencié à un autre sans passer par l’état pluripotent, offre une approche alternative prometteuse pour la médecine régénérative. Le cœur des mammifères contient une abondance de fibroblastes cardiaques (FK), qui représentent environ la moitié des cellules du cœur et prolifèrent massivement lors d’une blessure7-9. Ainsi, le vaste bassin de FC pourrait servir de source endogène de nouveaux MC pour la thérapie régénérative s’ils pouvaient être directement reprogrammés en MC fonctionnels. Il a été démontré qu’une combinaison de facteurs de transcription, tels que Gata4 (G), Mef2c (M) et Tbx5 (T), avec ou sans microARN ou petites molécules, peut reprogrammer les fibroblastes en iCM10-26. Il est important de noter que cette conversion peut également être induite in vivo et entraîne une amélioration de la fonction cardiaque et une réduction de la taille des cicatrices dans un cœur infarctus16,27-29. Ces études indiquent que la reprogrammation cardiaque directe peut être une voie potentielle pour guérir un cœur blessé. Cependant, la faible efficacité de la reprogrammation iCM est devenue un obstacle majeur pour d’autres études mécanistes. De plus, la reproductibilité de la reprogrammation cardiaque est une autre question controversée de cette technologie11,30,31.

Très récemment, nous avons généré un ensemble complet de constructions polycistroniques codant G,M,T dans tous les ordres d’épissage possibles avec des séquences 2A identiques dans un seul ARNm. Ces constructions polycistroniques ont produit des niveaux d’expression variés des protéines G, M et T, ce qui a conduit à une efficacité de reprogrammation significativement différente25. La construction la plus efficace, nommée MGT, qui a montré une expression relativement élevée de Mef2c et une faible expression de Gata4 et Tbx5, a considérablement amélioré l’efficacité de la reprogrammation et a produit de grandes quantités d’iCM avec l’expression de marqueurs CM, une oscillation calcique robuste et un battement spontané25. De plus, en utilisant la construction polycistronique MGT, notre étude a évité l’utilisation de vecteurs multiples et généré des cellules avec un rapport d’expression homogène de G, M, T, fournissant ainsi une plate-forme améliorée pour la recherche sur la reprogrammation cardiaque. Pour augmenter la reproductibilité expérimentale, nous décrivons ici en détail comment isoler les fibroblastes, produire une cassette MGT porteuse de rétrovirus, générer des iCM et évaluer l’efficacité de la reprogrammation.

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Protocole

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Le protocole décrit ici utilise des souris néonatales. Les soins et expériences sont réalisées en conformité avec les lignes directrices établies par la Division de médecine de laboratoire animale (DLAM) à l'Université de Caroline du Nord, Chapel Hill.

1. Préparation des tampons et des médias

  1. Préparer fibroblastes (FB) milieu: Supplément de 500 ml de milieu IMDM avec 100 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 6 ml de pénicilline / streptomycine.
  2. Préparer le milieu iCM: Complémentaires 400 ml du milieu DMEM avec 100 ml de milieu M199 et 50 ml de FBS.
  3. Préparer le milieu de B27: Supplément 490 ml RPMI1640 médias avec 10 ml B27 médias.
  4. Préparer Plat-E milieu de culture: 500 ml Supplément milieu DMEM avec du FBS à 50 ml, 5 ml de pénicilline / streptomycine et 5 ml d'acides aminés non-essentiels.
  5. Préparer Plat-E milieu de transfection: Supplément 500 ml du milieu DMEM avec du FBS à 50 ml et 5 ml d'acides aminés non-essentiels.
  6. Prepare gélatine revêtu plaque à 24 puits: Ajouter une solution de gélatine 0,5 ml à 0,1% à un puits de plaque à 24 puits, incuber à 37 ° C pendant au moins 10 min et aspirer juste avant l'utilisation.
  7. Préparer le tampon de marquage FACS: Supplément de 500 ml avec 10 ml de DPBS FBS et 2 ml d'EDTA (0,5 M) pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Passer à travers un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C.
  8. Préparer tampon MACS de tri: Supplément DPBS avec 500 ml 2,5 g de BSA et 2 ml d'EDTA (0,5 M) pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Passer à travers un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C.
  9. Préparer du tampon HBS 2x pour la transfection: compléter à 500 ml tampon HEPES (50 mM) de NaCl 280 mM (8,1816 g), 10 mM de KCl (0,37275 g), 1,5 mM de Na 2 HPO 4 (0,10647 g), mM de glucose 12 (1,08096 g ). Ajouter 650 ul d'environ 10 N de NaOH pour ajuster le pH à 7,05 à 7,12. Filtrer à travers un filtre de 0,22 um des pores et conserver à 4 ° C.
  10. Préparer 2,5 M solution de CaCl 2 pour la transfection: Ajouter 18,376 g CaCl 2 à 50 ml ddH 2 O. Filtrer à travers un filtre de 0,22 um des pores et conserver à 4 ° C.
  11. Préparer CPI (immunocytochimie) tampon de fixation: Ajouter 5 ml de paraformaldéhyde (PFA, 32%) à 35 ml DPBS pour atteindre une concentration finale de 4%.
  12. Préparer du tampon de perméabilisation ICC: Ajouter 0,1 ml de Triton 100 ml de DPBS pour atteindre une concentration finale de 0,1%.
  13. Préparer du tampon de blocage ICC: Ajouter 5 g d'albumine sérique bovine (BSA) à 100 ml de DPBS pour atteindre une concentration finale de 5%.
  14. Préparer du tampon de coloration ICC: Ajouter 1 g de BSA pour 100 ml de DPBS pour atteindre une concentration finale de 1%.

2. Génération de souris néonatales fibroblastes cardiaques

  1. Générer fibroblastes cardiaques de méthode de explant
    1. Clean néonatale αMHC-GFP souris transgénique (P1 à P2) avec 75% d'éthanol. Couper la tête avec des ciseaux stériles. Ensuite, faire une incision horizontale sous une aisselle à l'autre. Utilisez un stérilepince émoussée et pliés à disséquer le cœur et le placer dans un puits de la plaque de 24 puits contenant du tampon PBS glacé.
      1. Sinon, presser le coeur après l'incision horizontale.
    2. Vérifiez expression de la GFP dans le cœur par microscope à fluorescence. Étant donné que l'expression de la GFP est entraîné par le promoteur αMHC qui est un promoteur spécifique cardiaque, le cœur de souris transgénique doit être 15 en vert, alors que le cœur est faible négative dans toute fluorescence.
    3. Prendre 3-4 GFP coeurs positives dans une boîte de culture centre du puits de 60 mm et hachez-les en petits morceaux moins de 1 mm 3 dans la taille de ciseaux et des pinces stériles.
    4. Placez 3-4 coeurs hachées dans un plat de 10 cm avec 2 ml de milieu FB. Laissez les tissus installent pendant 3 heures.
    5. Lentement, ajouter 8 ml préchauffé médias FB pour les plats contenant des tissus cardiaques. Ne pas déranger les tissus pendant trois jours.
    6. Remplacer les médias tous les trois jours.
    7. Au jour 7, ASPIRmangé le milieu de culture et laver les cellules avec du DPBS. Ajouter 3 ml de trypsine à 0,05% à chaque plaque et à digérer à 37 ° C pendant 5 min.
    8. Ajouter 5 ml de milieu FB pour étancher la trypsine. Détacher les cellules doucement avec un grattoir à cellules. Introduire à la pipette les médias de haut en bas de dissocier outre mécaniquement le tissu.
    9. Recueillir des cellules et filtrer à travers 40 um crépines de cellules pour éviter la contamination des fragments de tissu cardiaque, puis sédimenter les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min.
    10. Laver les cellules une fois avec MACS tampon et cellules sont prêtes pour le tri.
  2. Générer fibroblastes cardiaques de méthode de digestion enzymatique
    1. Récolte GFP Hearts positifs que 2.1.1. Transférez tous les cœurs dans un plat de 10 cm avec 10 ml DPBS glacées.
    2. Pressez ventricules avec des pinces stériles pour enlever le sang et rincer une fois avec DPBS glacées.
    3. Couper les cœurs d'être libre d'autres tissus et de matières grasses.
    4. Couper chaque cœur dans environ 4 morceaux qui sont encore vaguement reliés.
    5. Si moins de 20 coeurs, transférer le coeur dans un tube conique de 15 ml avec 8 ml chaud 0,05% de trypsine-EDTA, et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
      1. Si il y a 20-30 cœur, le cœur transférer dans un tube conique de 50 ml avec 10 ml chaud 0,05% de trypsine-EDTA, et on incube à 37 ° C pendant 15 min.
    6. Jeter la trypsine et ajoutez 5 ml (pour les moins de 20 coeurs) ou 10 ml (pour les 20-30 coeurs) chaude collagénase de type II (0,5 mg / ml) dans HBSS.
    7. Vortex tube sur vortex pendant 1 min à un niveau de vitesse d'environ 4 à 6 (si le liquide ne se lève pas pour le couvercle, puis la vitesse est très bien).
    8. Incuber le tube à 37 ° C bain d'eau pendant 3 à 5 min.
    9. Vortex le tube pendant 1 min.
    10. Les sédiments pendant 1 min par gravité jusqu'à ce que les morceaux de tissu se fixent, de recueillir le liquide dans un nouveau tube contenant 5 ml de milieu de FB froid.
    11. Répétez les étapes 2.2.6-2.2.10 3-5 fois.
    12. Combinez toutes les collections par filtration à travers 40 um tamis cellulairede faire suspension cellulaire unique.
    13. Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
    14. Resuspendre les cellules dans 10 ml de tampon MACS, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
    15. Facultatif: Si il ya un grand nombre de cellules sanguines, remettre les cellules avec 1 ml RBC tampon de lyse (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 et 0,1 mM d'EDTA), garder sur la glace pendant 1 min, puis diluer avec 10 ml MACS tampon et centrifuger à 200 g pendant 5 min. Laver une fois de plus avec un tampon MACS.
  3. Isolement de Thy1.2 + fibroblastes par MACS (magnétique tri cellulaire activé)
    1. Déterminer le nombre de cellules viables par coloration au bleu trypan.
      1. Prenez 10 cellules pi à partir de 10 ml de suspension cellulaire à l'étape 2.2.14. Mélangez-le avec une solution de bleu de 10 ul de 0,4% de trypan.
      2. Ajouter le mélange à un hémocytomètre. Laisser reposer pendant 3-5 min, puis examiner immédiatement sous un microscope. Les cellules mortes sont colorées dans les cellules bleues et viables sont sans tache.
      3. compter toutes les cellules viables dans quatre carrés de 1 mm d'angle de l'hémocytomètre. Déterminer le nombre de cellules viables: le nombre moyen par carré x 2 (facteur de dilution) 10 x 4 x 10 (volume total de suspension cellulaire).
    2. Pour moins de 1 x 10 7 cellules, remettre les cellules avec 10 pi microbilles de Thy1.2 dans 90 ul refroidis tampon MACS. Ajouter plus de perles proportionnellement si il ya plus de 1 x 10 7 cellules. Mélanger bien et incuber dans un réfrigérateur (2-8 ° C) pendant 30 min.
    3. Ajouter 10 ml de tampon MACS et des échantillons de tourner à 200 g pendant 5 min; laver une fois avec 10 ml MACS tampon et centrifuger à nouveau.
    4. Amener le volume à 2 ml dans un tampon MACS.
    5. Mettre en place un séparateur MACS dans le capot. Insérer une colonne de LS pour le séparateur. Appliquer 3 ml de tampon MACS à la colonne pour équilibrer cela.
    6. Faire passer la suspension de cellules à travers la colonne de LS équilibrée.
    7. Lavez 3 fois avec 2 ml de tampon MACS à chaque fois.
    8. Prenez la colonne LS hors til séparateur et élue 3 fois avec 2 ml de tampon MACS dans un nouveau tube de 50 ml.
    9. Spin à 200 g pendant 5 min.
    10. Resuspendre les cellules dans 10 ml de milieu de FB, Compter les cellules et des semences dans des plaques à une densité adéquate. Pour les fibroblastes provenant méthode d'explant, la densité de cellules d'ensemencement peut être de l'ordre de 2 à 3 x 10 4 cellules / puits de plaque à 24 puits. Pour fibroblastes générés par la méthode de digestion enzymatique, la densité des cellules pourrait être autour de 4-5 x 10 4 cellules / puits de plaque à 24 puits.

3. Génération de rétrovirus pour ICM Reprogrammation

Remarque: Effectuez les étapes suivantes dans une enceinte de sécurité biologique BSL2 dans des conditions stériles. L'élimination appropriée des cellules transfectées, embouts de pipette et tubes est recommandé d'éviter tout risque de risques environnementaux et sanitaires.

  1. Maintenir des cellules Plat-E-E à Plat milieu supplémenté avec 1 ug / ml de puromycine et de 10 pg / ml de blasticidin à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  2. Le jour 2, remplacer le milieu par Plat-E milieu de culture dépourvu puromycine et blasticidine.
  3. Au jour 0, diviser les cellules Plat-E en boîtes de 10 cm le jour avant la transfection 4-5 x 10 6 cellules par plaque à environ. Les cellules doivent être ~ 80-90% de confluence le jour de la transfection.
  4. Au jour 1, les médias changement de culture sur un support de transfection sur des cellules à moins de 1 heure avant la transfection. Procédure de transfection est la suivante:
    1. La transfection en utilisant des kits commerciaux
      1. Mélanger 20 ul réactif de transfection (par exemple Lipofectamine) et 500 pi médias sérique réduite (par exemple, Opti-MEM). Ajouter 10 pg du plasmide retroviral à un autre support 500 ul de sérum réduites. Incuber chaque mélange à la température ambiante (TA) pendant 5 min.
      2. Lentement, ajouter le mélange de plasmide au mélange de transfection. Cette étape peut prendre 15-30 sec. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante (solution peut paraître trouble).
      3. Ajouter chute de savant mélange aux cellules.
      4. Incuber pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° C.
    2. Transfection en utilisant le phosphate de calcium.
      1. Mélanger 40 ul de 2,5 M CaCl 2 et 440 pi ddH 2 O, puis ajouter 20 pg du plasmide rétroviral (ajuster la quantité de ddH 2 O de sorte que le volume total est de 500 pi).
      2. Ajouter 500 pi 2x HBS à un tube de 15 ml conique.
      3. Vortex du HBS et en attendant, ajouter le mélange de calcium-ADN à la HBS goutte à goutte. Cette étape prend environ 30 secondes pour chaque échantillon. Donc au maximum faire 3-4 échantillons simultanément.
      4. Incuber à température ambiante pendant 3 minutes d'incubation pour plus de temps conduit à une plus grande précipité et moins de cellules prendra le précipité.
      5. Ajouter le mélange goutte à goutte à des cellules et observer sous microscope 20X. Précipités fins (un grand nombre de petits sont bons, mais quelques grands ne sont pas bonnes) doivent être considérés.
      6. Incuber pendant une nuit à 37 ° C incubateur.
  5. Le jour 2, changer de support sur les cellules avec 8 ml préchauffé milieux de culture. Incuber pendant 24 h.
  6. Au jour 3 et le jour 4, recueillir le surnageant de culture de la vaisselle à l'aide d'une seringue jetable de 10 ml stérile, en filtrant à travers un filtre de taille de cellulose de 0,45 um acétate de pores, et transférer dans un tube de 50 ml. Ajouter 2 ml de solution de précipitation rétrovirus à chaque surnageant contenant le virus 8 ml. Mélanger doucement et incuber une nuit à 4 ° C.
  7. Au jour 5, le mélange viral tourner à 1500 x g à 4 ° C pendant 30 min. Les particules virales doivent apparaître dans le culot blanc au fond du tube.
  8. Jeter le surnageant. Isoler solution résiduelle par centrifugation à 1500 xg pendant 5 min. Eliminer toute trace de liquide par aspiration, en prenant grand soin de ne pas perturber les particules rétrovirales précipités en tablettes.
  9. Reprendre pastilles rétroviraux avec 100 pi de tampon DPBS pour 8 ml de surnageant viral. Aliquotele virus sur de la glace. Utiliser immédiatement ou conserver à -80 ° C.

4. La reprogrammation des fibroblastes cardiaques

  1. Ajouter 4 pi de 10 mg / ml solution de polybrène dans le milieu 10 ml iCM, et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. La concentration finale est de polybrène 4 ug / ml.
  2. Ajouter 500 ul médias iCM contenant polybrène à chaque puits de plaque à 24 puits ensemencées avec des fibroblastes.
  3. Ajouter 10 ul rétrovirus à chaque puits contenant soit 2-3 x 10 4 cellules de explant ou 4-5 x 10 4 cellules de la méthode de digestion enzymatique. La quantité de virus devrait être augmenté proportionnellement à l'augmentation du nombre de cellules dans des plaques de culture différentes ou des plats. Mettre la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 à 48 d'une heure pour permettre à l'infection virale. La ligne de temps pour la reprogrammation cardiaque est représenté sur la Figure 1.
  4. Après transduction virale, remplacer virus contenant les médias avec 500 ul médias régulière ICM.
  5. Changer de support tous les 2-3 jours. Pour la sélection positive des cellules transduites virales, ajouter médias iCM complétées avec la puromycine à 2 pg / ml aux cellules cibles. Gardez pendant trois jours. Après cela, maintenir la puromycine dans le milieu iCM à la concentration de 1 ug / ml.
  6. Trois jours après l'infection virale, prenez la plaque hors de l'incubateur et le placer sous un microscope à fluorescence inversé (20X) pour observer l'expression de la GFP.
    Remarque: Dix jours après l'infection virale, les cellules peuvent être récoltées pour analyse FACS analyse et ICC pour déterminer l'efficacité de reprogrammation (à l'étape 5 et 6).
  7. Quatorze jours après l'infection virale, remplacer iCM médias avec les médias de B27. Changer de support tous les trois jours. Battement spontané cellule loci peut apparaître à partir de cellules provenant de trois (procédé de digestion enzymatique) ou quatre (cellules de mode de explant) semaines après transduction virale.

5. Immunocytochemical analyse de l'efficacité Reprogrammation

  1. Rincer les cellulesavec PBS glacé à trois reprises; éliminer l'excès de solution.
  2. Ajouter tampon de fixation 0,5 ml de la CPI à chaque puits de plaques à 24 puits. Fixer les cellules à la température ambiante pendant 15-20 min.
  3. Rincer les cellules avec PBS trois fois.
  4. Ajouter tampon de perméabilisation 0,5 ml de la CPI à chaque puits des plaques 24 puits. Perméabiliser les cellules à température ambiante pendant 15 min.
  5. Rincer les cellules avec PBS trois fois.
  6. Ajouter 0,5 ml CPI tampon de blocage dans chaque puits de plaque à 24 puits, incuber à température ambiante pendant 1 h.
  7. Anticorps primaire dilué avec le tampon CPI de coloration. Ajouter 200 pi solutions d'anticorps à chaque puits et incuber une nuit à 4 ° C. Les facteurs de dilution anticorps sont répertoriés dans les Matériaux.
  8. Le lendemain, laver les cellules avec du PBS trois fois.
  9. Ajouter 200 d'anticorps secondaires solutions pi aux cellules et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.
  10. Laver les cellules avec du PBS à trois reprises.
  11. Ajouter 150 ul solution contenant DAPI à chaque puits de montage. Laisser colorer les noyaux pendant 1 min. alorscouvrir chaque puits avec couvercle en verre ronde glissement et appuyez doucement sur le glissement contre la surface inférieure avec une pince pour enlever les bulles d'air.
  12. Aspirer la solution en excès et les échantillons sont prêts pour l'imagerie. Les images représentatives montrant les cellules reprogrammées qui expriment le marqueur cardiaque cTnT et αActinin à d14 sont présentées dans la figure 2B.

6. Analyse FACS de la reprogrammation efficacité

  1. Laver soigneusement les cellules une fois avec du DPBS. Ajouter 0,3 ml de trypsine (0,05%) dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
  2. Tapoter doucement la plaque pour faciliter la levée des cellules. Vérifiez le détachement des cellules au microscope. Ajouter 1 ml de tampon FACS à chaque puits où la plupart des cellules sont dissociées. Pipette de haut en bas de dissocier outre mécaniquement les cellules.
  3. Transfert cellules dans la plaque de 24 puits à une plaque de puits puits profond de 96 puits en puits. Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C pour recueillir les cellules.
  4. Laver les cellules une fois avecTampon FACS.
  5. Ajouter 100 solutions de fixation / perméabilisation pi pour remettre en suspension les cellules pendant 20 min à 4 ° C.
  6. Laver les cellules deux fois avec la solution de lavage de 1x, culot, et retirer le surnageant.
  7. Préparer une solution d'anticorps primaire contre la GFP et cTnT dans un tampon de lavage 1x. Bien remettre en suspension chaque échantillon avec une solution d'anticorps de 50 pi et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
  8. Laver les cellules une fois dans la solution de lavage 1x, culot, et retirer le surnageant.
  9. Ajouter 50 une solution d'anticorps secondaire Alexa Fluor pi contenant 488 âne conjugué IgG anti-lapin Alexa Fluor 647 et âne conjugué IgG anti-souris de chaque échantillon. Incuber à 4 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
  10. Laver les cellules une fois dans la solution de lavage 1x, culot, et retirer le surnageant.
  11. Resuspendre les cellules dans 400 ul tampon de fixation (des DPBS avec 1% PFA). Transfert cellule dans FACS tube avec bouchon de crépine de cellule. Les échantillons sont prêts pour la détection FACS. L'analyse FACS représentant de reprogrammation efficiencpMxs-y en utilisant la puromycine-MGT construire avec ou sans sélection à la puromycine est représenté sur la figure 2A.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les étapes de reprogrammation sont résumés par schématique sur la figure 1. Après MGT transduction, l'expression de GFP dans la reprogrammation des cellules peuvent être détectés dès le jour 3. sélection puromycine de cellules transduites commence au jour 3 et est mis à jour pendant les deux premières semaines si PMX-puro -MGT construction est utilisée. Le jour 10 au jour 14, l'expression des marqueurs cardiaques comme cTnT et αActinin pu être détecté à la fois par la CCI (figur...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour réussir une génération iCM lors de l'utilisation de ce protocole, il ya plusieurs facteurs importants qui ont une incidence sur l'efficacité globale. Notamment les conditions de fibroblastes de départ et la qualité de l'encodage de rétrovirus MGT peuvent grandement affecter l'efficacité de reprogrammation.

Il est important de générer des fibroblastes aussi frais et sain que possible. Pour la méthode de explant, les fibroblastes peuvent être utilisés avant les sept jours ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants de l’assistance technique experte de la part de la plateforme de cytométrie en flux de l’UNC et de la plateforme de microscopie de l’UNC. Nous remercions les membres du laboratoire Qian et du laboratoire Liu pour les discussions utiles et les critiques du manuscrit. Cette étude a été financée par la subvention R00 HL109079 du NIH/NHLBI au Dr Liu et la subvention de développement scientifique 13SDG17060010 de l’American Heart Association (AHA) et la subvention de New Scholar AG-NS-1064-13 de l’Ellison Medical Foundation (EMF) au Dr Qian.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
anti-troponine cardiaque TThermo ScientificMS-295-PO1:200 pour FACS et 1:400 pour ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 pour FACS et ICC
anti-aactinineSigma-AldrichA78111:500 pour FACS et
ICC anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 pour  ; ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1 000 pour ICC  ;
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 pour ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 pour ICC
Alexa Fluor 488&ndash ; âne conjugué anti-lapin IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 pour FACS et ICC
Alexa Fluor 647&ndash ; âne conjugué anti-souris IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 pour FACS et ICC
Kit Cytofix/Cytoperm pour coloration intracellulaireBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microbillesMiltenyi Biotec130-049-101
Solution Vectashield avec DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsine-EDTA (0,05 %)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplémentLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Sérum réduit MediumLife Technologies31985-070
M199medium Life Technologies10-060
DMEM, glycémie élevéeLife Technologies10-013
Pénicilline-streptomycineCorning30-002
Acides aminés non essentielsLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
blasticidineLife TechnologiesA11139-03
puromycineLife TechnologiesA11138-03
Collagénase IIWorthingtonLS004176
polybrèneMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl< sub>2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlucoseSigma-AldrichG6152
Albumine sérique bovineFisher9048-46-8
paraformaldéhydeEMS15714
Solution de précipitation de rétrovirusALSTEMVC-200
0,4 % Trypan blue solutionSigma-AldrichT8154
gélatine Sigma-AldrichG1393
PBS de Dulbecco sans CaCl2 et MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS columnMiltenyi Biotec130-042-401
0.45 &mu ; Filtre en acétate de cellulose MThermo Scientific190-2545
Plaques 24 puitsCorning3524
10 cm Boîtes de culture tissulaire  ;Thermo Scientific172958
Boîte de culture à puits central de 60 mm  ;   ;Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylène Deep Well PlateDenville ScientificP9639
Tubes en polystyrène à fond rond avec capuchon de filtre de cellules  ;BD Biosciences352235
CentrifugeuseEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiSéparateur MACSMiltenyi Biotec130-042-302
Couvercle rond en verreMicroscopie électronique Sciences72195-15

Références

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Induced CardiomyocytesCardiac FibroblastsPolycistronic ConstructGata4 Mef2c Tbx5Retroviral ReprogrammingCell IsolationFlow Cytometry AnalysisImmunochemistry DetectionPurmycin SelectionGFP Expression

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