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Article de méthode

Purification et le repliement de fibrilles d'amyloïde de (Son)

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DOI :

10.3791/53432

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19 décembre 2015

 ,  ,  , 
1Virologie et Immunologie Moléculaires, INRA

Dans cet article

Résumé

Une méthode chromatographique en deux étapes est décrite pour la purification de la protéine Shadoo recombinante exprimée sous forme de corps d’inclusion chez Escherichia coli, ainsi qu’un protocole pour fibriller Shadoo purifié en structures amyloïdes.

Résumé

Le système d'expression d'Escherichia coli est un outil puissant pour la production de protéines eucaryotes recombinantes. On l'utilise pour produire Shadoo, une protéine appartenant à la famille des prions. Procédé chromatographique pour la purification de (His) 6 recombinant -tagged Shadoo exprimé en corps d'inclusion sont décrits. Les corps d'inclusion sont solubilisés dans de l'urée 8 M et lié à une colonne -charged Ni 2+ à effectuer une chromatographie d'affinité d'ions. Les protéines liées sont éluées par un gradient d'imidazole. Les fractions contenant la protéine Shadoo sont soumis à une Chromatographie d'exclusion de taille pour obtenir une protéine hautement purifiée. Dans l'étape finale est purifié Shadoo dessalée pour éliminer les sels, de l'urée et de l'imidazole. Protéine recombinante Shadoo est un réactif importante pour les études biophysiques et biochimiques de troubles de la conformation de la protéine qui se produisent dans les maladies à prions. De nombreux rapports ont démontré que les maladies neurodégénératives prion proviennent du dépôt de poignarderle, a ordonné fibrilles amyloïdes. Protocoles exemples décrivant comment la fibrillation Shadoo en fibrilles amyloïdes à pH acide et neutre / pH basiques sont présentés. Les méthodes sur la façon de produire et de fibrillation Shadoo peut faciliter la recherche dans les laboratoires travaillant sur les maladies à prions, car elle permet la production de grandes quantités de protéines d'une manière rapide et à faible coût.

Introduction

Prions maladies neurodégénératives, qui comprennent l'encéphalopathie spongiforme bovine chez les bovins, tremblante du mouton et la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l'homme, sont mortelles et incurables. Les maladies à prions sont caractérisés par des changements de conformation de la protéine prion cellulaire principalement composées d'hélices a, dans la β-coupe-feuille enrichi amyloïde conformère 1,2. Croix-ß-structures contiennent denses et des feuillets bêta de type cristallin hautement ordonnés stabilisées par des liaisons hydrogène 3,4. Amyloïdes à prions peuvent se reproduire en raison des brins ß au bord de croissance qui fournissent un modèle pour le recrutement et la conversion d'une unité de protéine monomère.

Selon l'hypothèse de «protéine seulement», le conformère amyloïde de la protéine prion est le seul agent infectieux. Toutefois, d'autres biomolécules ont été proposés pour être essentiel pour troubles liés au prion. Par exemple, les membranes cellulaires sont pensés pour être un lieu où conversisur place et prend certains lipides chargés négativement ont été montré pour améliorer la 5,6 processus de conversion. En outre, certaines protéines peuvent également être impliqués dans des pathologies à prions. Plus précisément, il existe deux autres membres de la famille de la protéine prion: Doppel Shadoo et 7,8. Doppel a une structure relativement rigide stabilisé avec des ponts di-sulfure et ne parvient pas à l'auto-polymériser et globale de fibrilles amyloïdes 9. En revanche, similaire à la protéine prion, Shadoo peut adopter une structure β-feuille enrichi et l'auto-associé dans les structures de fibrilles amyloïdes. Il a été montré que Shadoo peut fibrillation dans des conditions natives ou sur membranes chargées négativement de liaison 10,11. Conversion de Shadoo en fibres de type amyloïde peut être associée à des pathologies. En effet, les mécanismes par lesquels les structures de type amyloïde causent la maladie sont encore mal compris.

Shadoo porte un domaine hydrophobe (HD) et une série de tandem Arg / Gly répète similaires to la partie N-terminale de la protéine prion (figure 1A). Comme la partie N-terminale de la protéine prion, Shadoo est fortement chargée positivement et semble être une protéine native non structurées 11,12. Shadoo semble être fonctionnellement lié à des troubles du prion, car il peut se lier directement la protéine prion. En outre, son expression est régulée au cours bas prion pathologique 13,14. Cependant, le rôle de Shadoo dans la maladie à prions est pas encore établie.

Nous avons développé un plasmide portant la séquence codante du gène de la souris Shadoo. Le plasmide a été utilisé pour transformer E. coli pour la production de N-terminal Son 6 protéine de fusion Shadoo. Ce système d'expression est bien établi dans notre laboratoire et est couramment utilisé dans nos projets en cours 6,15,16. Une question importante pour l'expression de Shadoo est le choix de la E. coli. Bien souche bactérienne BL21 compétente est couramment utilisé pour l'expression de pro recombinantprotéines Shadoo a été exprimé avec succès et purifié seulement de la souche bactérienne transformée SoluBL21. SoluBL21 E. compétente coli est un mutant amélioré de la souche hôte BL21 mis au point pour la production de protéines dont l'expression dans la BL21-mère a donné aucun produit soluble détectable. Expression de haut niveau de Shadoo dans SoluBL21 E. coli conduit à l'accumulation de la protéine dans des corps d'inclusion. Comme une caractéristique générale, quand une protéine non-natif est fortement exprimé dans E. coli, cette protéine a tendance à s'accumuler dans les corps d'inclusion insolubles. Shadoo agrégats probablement par des interactions hydrophobes non covalentes ou ioniques (ou une combinaison des deux) à des structures dynamiques hautement enrichi formés par la protéine repliée à des degrés divers. En conséquence, la purification comprend au moins deux étapes: (i) une séparation sélective de la protéine à partir d'autres biomolécules dans un milieu de dénaturation, et (ii) une renaturation de la protéine purifiée en utilisant dans le pliage vitroTechniques.

La séparation sélective de Shadoo a été réalisée dans une solution tampon contenant de l'urée 8 M (ou en variante de guanidine-HCl 6 M). L'élimination de l'urée et la renaturation de la protéine peut être fait en appliquant différents protocoles: (i) la renaturation dans une solution de pH acide pour obtenir une protéine de Shadoo monomère non structurée, ou (ii) la renaturation dans une solution de pH ≥ 7 pour obtenir Shadoo polymérisé en fibres amyloïdes caractéristiques stables avec motifs croix-β-feuille.

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Protocole

1. Génération du plasmide d'expression et Shadoo

Remarque: le gène codant pour la protéine murine Shadoo (Shadoo 25-122), a été sous-cloné dans le vecteur d'expression pET-28 11. Ce clone a été transformé dans E. coli SoluBL21 souche bactérienne, pour exprimer la protéine Shadoo avec une étiquette hexahistidine N-terminale, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) comme expliqué précédemment 11. Le plasmide peut être demandé auprès des auteurs. Le poids moléculaire calculé à partir de Shadoo sa séquence d'acides aminés est 12,243.2 Da.

Remarque: Effectuez toutes les manipulations avec des bactéries sous une hotte à flux laminal ou à proximité de Bunsen flamme.

  1. Transformer des bactéries de SoluBL21 compétentes avec l'animal-28-His 6 -Shadoo plasmide, en utilisant un protocole de choc thermique standard. Pour ce mélange 1 à 5 ul de plasmide (10 pg typiquement à 100ng) dans 50 ul de bactéries dans un tube. Effectuer le choc thermique à 42 ° C pendant 45 secondes.
  2. Culture des bactéries transformées à 37 ° C jusqu'à ce que 0,5 à 0,7 A 600 en milieu Luria-Bertani complété avec 40 mg / ml de kanamycine (Figure 1B).
  3. Induire l'expression Shadoo O / N par addition de 240 ug / ml de β-isopropyl-D- thiogalactopyranoside, ITPG, à la culture. Les bactéries de la Culture sous agitation à 150 tours par minute à 37 ° C. Remarque: En règle générale, la culture bactérienne a atteint 600 A du 3 O / N.
    Remarque: Transformé bactéries peuvent être conservés à -80 ° C pour l'avenir de la production de protéines. Pour cela, ajoutez 10% à 50% (v / v) de glycérol stérile dans des aliquotes de culture bactérienne et les congeler à -80 ° C.

figure-protocol-1
Figure 1. Schéma de Shadoo construction d'expression, bactéries transformation et induction de l'expression Shadoo (comme décrit dans l'étape 1). (A) Le produit d'assemblage d'expression pour Shadoo code pour une étiquette hexahistidine fusionné à l'extrémité N-terminale de la protéine, le Nt. Le schéma montre que la protéine de base contient des répétitions Shadoo arginine / glycine (vert) de cylindre, un domaine hydrophobe (HD), et un seul site de N-glycosylation (CHO), suivie d'une extrémité C-terminale (Ct). (B) Le PET-28-His 6 -Shadoo plasmide est transformé dans des bactéries SoluBL21 par choc thermique pendant 45 secondes à 42 ° C. Les bactéries transformées sont étalées sur de la gélose sélectif contenant 40 ug / ml de kanamycine. Une colonie unique de la plaque est utilisée pour inoculer une culture dans un flacon secoueur 1.000-3.000 ml. L'expression de la protéine recombinante est induite avec IPTG 1 mM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Purification de Shadoo protéines par chromatographie en phase liquide à basse pression (LPLC)

  1. La lyse des cellules et enconclusion organes préparation
    1. Recueillir la suspension bactérienne et de la transférer dans des tubes de centrifugation (figure 2).
    2. Spin à 2500 xg, pendant 20 min à 4 ° C. Retirer le surnageant par décantation et des pastilles de remettre en suspension dans 15 ml de tampon (Tris 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8 avec un cocktail anti-protéase) pour chaque pastille provenant de 500 ml de culture cellulaire.
      Remarque: Les culots remis en suspension peuvent être congelés et conservés à -20 ° C pendant plusieurs jours. La congélation des cellules bactériennes facilite la lyse.
    3. Vérifiez la sur-expression de la protéine recombinante en utilisant des bactéries brut pastilles par l'analyse SDS-PAGE et coloration de Coomassie.
      1. Pour cela, centrifuger 1 ml de culture bactérienne pour sédimenter les cellules. Ajouter 100 ul de solution de dénaturation Laemmli (277,8 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 4,4% de SDS, 44,4% en poids / volume de glycerol, 0,02% de bleu de bromophénol) pour former un culot et on chauffe à 100 ° C pendant 5 min.
      2. Charge 10 pi de l'échantillon à un gel d'acrylamide 12%, exécutez SDS-PAGE et visualize protéines séparées par coloration de Coomassie.
    4. Ajouter Triton X-100 à 0,5% à une concentration finale complètement remis en suspension le culot de 2.1.2).
    5. Incuber la suspension dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min.
    6. Soniquer la suspension pendant 5 minutes à 6-12 microns d'amplitude crête-à-crête dans de l'eau glacée pour lyser les cellules bactériennes.
    7. Transfert soniquée suspension dans 50 ml propres tubes de centrifugation.
    8. Tubes à centrifuger à 15000 g pendant 15 min à 4 ° C.
    9. Retirer le surnageant par décantation et ajouter 5 ml de tampon de liaison (tampon 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, urée 8 M, 5 mM d'imidazole) par tube.
    10. Placer les tubes sur la roue tournante O / N pour une suspension complète des protéines de corps d'inclusion.

    figure-protocol-2
    Figure 2. Schéma de purification de l'inclusiondes organes (comme décrit à l'étape 2.1). transformées bactéries exprimant Shadoo sont récoltées par centrifugation et remises en suspension dans le tampon de lyse. La suspension est incubée à 37 ° C pendant 30 min, puis traitée par ultrasons pour briser mécaniquement les cellules bactériennes. Sonication se fait sur la glace pour éviter l'échauffement de l'échantillon. Cellules brisées sont récoltées par centrifugation et remises en suspension dans un tampon contenant de l'urée 8M pour solubiliser des protéines de corps d'inclusion. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  2. La Chromatographie de Ni 2+
    Remarque: La chromatographie est effectuée sur un système FPLC en utilisant -charged Ni 2+, 5 ml de Sepharose chélatant colonne (figure 3A). Toutes les solutions sont chargées sur la colonne avec un débit de 1 ml / min de débit.
    1. Injecter 10 ml de 0,2 M NiSO solution 4 de l'eau dans la colonne Sepharose afin de la rechargeravec les -ions de Ni.
    2. Equilibrer la colonne chargée avec Ni 2+ -ions par injection de 30 à 50 ml de tampon de liaison contenant de la faible concentration d'imidazole (20 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, urée 8 M, 5 mM d'imidazole).
    3. Charger les protéines de l'urée solubilisé avec une boucle d'injection de 50 ml.
    4. Récupérer la fraction à écoulement continu par un lavage soigneux de la colonne avec 10 ml de tampon à faible imidazole de liaison (tampon 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, urée 8 M, mM d'imidazole 5) afin d'éliminer au maximum les protéines non liées à partir de la colonne.
    5. Laver la colonne avec 50 à 100 ml du tampon de lavage (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, urée 8 M, 80 mM d'imidazole) pour éluer les protéines non spécifiquement liées à la colonne.
    6. Application d'un gradient linéaire de 15 min de 80 à 800 mM d'imidazole dans le tampon contenant 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, urée 8 M. Prélever 1 ml fractions lors de l'application de gradient. Remarque: protéines His-tagged sont élues espritha gradient de tampon contenant de l'imidazole (utilisé en tant que concurrent).
    7. Prendre une aliquote de 8 pi de chaque fraction et ajouter 4 ul solution de dénaturation 4x Laemmli (voir 2.1.3.1). Solutions de chaleur à 100 ° C pendant 5 min.
    8. Charge 10 pi de marqueur de taille de protéines et 10 pi de chaque échantillon sur le gel d'acrylamide 12%, exécuter SDS-PAGE et de visualiser des protéines séparées par coloration de Coomassie. Remarque: Le poids moléculaire de Shadoo calculée former sa séquence d'acides aminés est 12,243.2 Da.
    9. Piscine toutes les fractions contenant Shadoo.

    figure-protocol-3
    Figure 3. Procédure de purification (comme décrit dans les étapes 2.2-2.4). (A) Ni 2+ -ions peuvent être coordonnés par des résidus d'histidine, ce qui permet la purification sélective des protéines à marquage polyhistidine. Imidazole est utilisé pour éluer la protéine, par l'intermédiairesa capacité à assurer la coordination avec le Ni 2+ et d'ion déplacer la protéine liée. (B) Des protéines de faire varier le rayon hydrodynamique qui ont été retenues sur le Ni 2+ -column sont séparés sur une colonne d'exclusion de taille. Les protéines sont élues de la plus grande à la plus petites. (C) Avant d'utiliser, fractions contenant Shadoo sont regroupées et dessalées pour éliminer l'urée, de l'imidazole et de sels. Des analyses de contrôle de qualité comprennent SDS-PAGE / coloration de Coomassie, Western blot. Purifiée Shadoo peut être lyophilisé. Lyophilisée Shadoo est stable pendant des mois lorsqu'il est stocké à -20 ° C. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  3. Chromatographie d'exclusion de taille
    Remarque: Une deuxième étape de purification consiste en une chromatographie d'exclusion de taille qui sépare Shadoo protéine des autres protéines co-éluées au cours de la première étape de purification(Figure 3B).
    1. Equilibrer la colonne Superdex de 120 ml de volume de lit en injectant au total 250 ml de tampon 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, urée 8 M, à raison de 1,5 ml / min.
    2. Charger les fractions regroupées contenant Shadoo du 2.2.9 sur la colonne équilibrée. Prélever 1 ml fractions après le volume de 40 ml de colonne vide sur le flux constant de tampon ci-dessus.
    3. Prenez une aliquote de 10 pi de chaque fraction et effectuer une analyse SDS-PAGE et coloration de Coomassie comme décrit ci-dessus pour savoir qui fractions contiennent Shadoo.
    4. Fractions de piscine contenant Shadoo.
  4. Dessalage
    Remarque: la procédure de dessalage supprime sels, l'imidazole et de l'urée pour obtenir la protéine recombinante Shadoo dans un tampon approprié pour d'autres études biophysiques et biochimiques (figure 3C). Le même résultat peut être obtenu par dialyse contre le tampon d'échantillons.
    1. Équilibrer une colonne de dessalage de 53 ml avec 150 ml10 mM de tampon d'acétate d'ammonium, pH 5, à raison de 5 ml / min de débit.
    2. Charge fractions rassemblées Shadoo sur la colonne. Lors de l'injection du tampon d'acétate d'ammonium collecter manuellement les fractions qui présentent une augmentation du signal à 280 nm à la sortie du détecteur d'UV.
    3. Lyophiliser la Shadoo dessalée et de le stocker à -20 ° C.
    4. Dissoudre Shadoo lyophilisée dans un tampon adéquat, un tampon d'acétate de sodium comme 10 mM, pH 5, avant l'utilisation.
      Remarque: L'étiquette polyhistidine peut être enlevé avec une entérokinase.

3. In Vitro Assemblage des Shadoo en fibrilles d'amyloïde à pH physiologique

Note: Les agrégats de protéines Shadoo et spontanément forme fibrilles à pH ≥ 7 11.

figure-protocol-4
Figure 4. Schéma de Shadoo repliement de fibrilles amyloïdes (comme description figurelit dans l'étape 3). Shadoo purifiée transforme spontanément de fibrilles amyloïdes lorsqu'il est dissous dans du tampon pH ≥ 7. Dans une solution acide, Shadoo convertit en fibrilles amyloïdes lors d'une incubation avec 1 M HCl Gdn-tout en agitant. Des analyses de contrôle de la qualité comprennent microscopie électronique et ThT coloration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Diluer Shadoo à une concentration finale de 2 uM dans un tampon 20 mM Tris-HCl, pH 7,4. Mesurer la concentration en mesurant la densité optique de la solution à 280 nm et en utilisant le coefficient d'extinction déduite de Shadoo composition d'acides aminés de 20 970.
  2. Incuber 500 ul de la solution dans un tube conique en plastique à 4 ° C pendant une quinzaine de jours, pour permettre la conversion de la protéine spontanée de structures amyloïdes (figure 4).
  3. Ajout fraîchement préparé thioflavine T (THT) à un conce finalentration de 10 uM à une portion aliquote de 100 ul de la solution Shadoo. Incuber la solution pendant 5 min à température ambiante. Mesurer l'émission de fluorescence de 460 à 520 nm en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 435 nm pour vérifier la présence de structures amyloïdes 17.

4. In Vitro Assemblage des Shadoo d'amyloïde fibrilles au pH acides

  1. Diluer à 1 M Shadoo GdnHCl, 20 mM de tampon acétate-Na, pH 5 à une concentration finale de 2 uM.
  2. Incuber 500 ul de cette solution dans un tube conique avec agitation continue à 37 ° C, pendant 3-7 jours.
  3. Vérifier la présence de fibrilles amyloïdes en ajoutant ThT à une aliquote de la solution comme dans 3.3.
  4. Dialyser suspension obtenue contre un tampon 10 mM d'acétate de Na, pH 5,0, à purifier Shadoo fibrilles amyloïdes.
  5. Stockez fibrilles purifiés à +4 ° C.

figure-protocol-5
Figure 5. Les résultats représentatifs. Fractions de protéines éluées à partir de la colonne Ni 2+ -charged chélateur (A) et de la colonne d'exclusion de taille (B) ont été analysés en utilisant une SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie. Identification des Shadoo purifiée a été évaluée en utilisant un anticorps anti-Shadoo RRPS (C). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Résultats

A propos de 5-10 mg de protéine purifiée est obtenue Shadoo par litre de culture bactérienne. Une purification en deux étapes est nécessaire pour obtenir Shadoo recombinante de haute pureté. La première étape est réalisée par chromatographie d'affinité avec une colonne de Ni qui conserve ses -charged-protéines marquées. Les fractions éluées sont soumises à une SDS-PAGE et colorées au bleu de Coomassie Brilliant avec (figure 5A). Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et Shad...

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Discussion

Un protocole simple et efficace à la fois pour l'expression et la purification d'une grande quantité de protéine recombinante Shadoo souris est présentée. La méthode décrite permet solubilisation succès et la purification de (Son 6) protéine recombinante Shadoo -tagged. Il est important, comme indiqué dans le titre, qui lorsqu'elle est exprimée dans une bactérie procaryote E. coli Shadoo accumule dans des corps d'inclusion. Avant purification Shadoo, les bactéries doivent être lysées ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Natalie Doude et David Westerway (Université de l’Alberta) pour nous avoir fourni l’ADNc Sho, Christophe Chevalier (INRA) pour la construction des plasmides, Michel Brémont (INRA) pour nous avoir fourni la bactérie BL21Sol ; Christine Longin (INRA) pour l’assistance TEM et Edith Pajot-Augy (INRA) pour les commentaires et la relecture.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AKTA FPLC  ;GE, Amersham# 1363
HiLoad 16/60 SuperdexGE Healthcare17-1069-01
HiTrap IMACGE HealthcareGE17-0920-05
HiPrep26/10 Colonne de dessalageGE HealthcareGE17-5087-01
SoluBL21 Competent E. coliGenlantisC700200
pET-28b+Novogen69865-3
IPTGSigma-AldrichI6758
LB-Broth moyenSigma-AldrichL3022
Eppendorf BiophotometarEppendorf550507804
Trito X-100Life Technologies85111
NiSO4Sigma-Aldrich656895
EDTASigma-AldrichE6758
Tris-HClSigma-AldrichRES3098T
Inhibiteur de protéaseCocktail Tablets Roche4693116001
NaClSigma-Aldrich746398
ImidazolSigma-AldrichI5513
Gdn-HClSigma-AldrichG4505
marqueur de taille de protéine  ;Thermo Fisher Scientific26620

Références

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