Lumière-driven Enzymatic décarboxylation

Summary

Nous décrivons un protocole pour la génération de lumière, catalysée par du peroxyde d'hydrogène - un cofacteur pour les transformations oxydatives.

Abstract

Oxidoreductases appartiennent à des enzymes industrielles les plus appliquées. Néanmoins, ils ont besoin d'électrons externes dont l'offre est souvent coûteuse et difficile. Recyclage du NADH ou NADPH, les donneurs d'électrons nécessite l'utilisation d'autres enzymes et des substrats sacrificiels. Fait intéressant, plusieurs oxydoréductases acceptent le peroxyde d'hydrogène en tant que donneur d'électrons. Tout en étant peu coûteux, ce réactif réduit souvent la stabilité des enzymes. Une solution à ce problème est la production in situ du cofacteur. L'alimentation en continu du cofacteur à faible concentration entraîne la réaction sans nuire à la stabilité de l'enzyme. Ce document démontre une méthode pour la lumière , catalysée par la génération in situ de peroxyde d'hydrogène avec l'exemple de l'acide gras décarboxylase de l' hème-dépendante olet _JE. Le décarboxylase d'acide gras olet _JE a été découvert en raison de sa capacité unique à produire à longue chaîne 1-alcènes à partir d' acides gras, une enzymatique jusqu'alors inconnueréaction. 1-alcènes sont largement utilisés pour des additifs plastifiants et des lubrifiants. Olet _JE a été montré pour accepter des électrons à partir du peroxyde d'hydrogène pour la decarboxylation oxydante. Alors que l' addition peroxyde d'hydrogène endommage l'enzyme et se traduit par de faibles rendements, la génération in situ du cofacteur contourne ce problème. Le système photobiocatalytic présente des avantages évidents en ce qui concerne l'activité enzymatique et le rendement, ce qui entraîne un système simple et efficace pour la décarboxylation des acides gras.

Introduction

Le changement climatique et l'épuisement prévisible des ressources renouvelables constituent une grave menace pour notre société. Dans ce contexte, la catalyse enzymatique représente un potentiel non encore pleinement exploité pour le développement de durable et de la chimie «verte» ^1. Oxidoreductases ont la capacité de catalyser la mise en place et la modification des groupes fonctionnels dans des conditions de réactions douces et appartiennent à biocatalyseurs les plus importants ^2. La plupart des transformations redox nécessitent la fourniture d'extérieur des cofacteurs tels que le NAD (P) H. Des procédés pour la régénération du cofacteur ont été appliquées à l'échelle industrielle. Cependant, ils entraînent toujours des coûts de traitement élevés, ce qui limite leur application à la plupart des produits à forte valeur ajoutée. Il est intéressant de plusieurs peroxydases et des monooxygénases ^3,4 P450 ⁵ accepter des électrons à partir du peroxyde d'hydrogène par l' intermédiaire de la dite dérivation du peroxyde. Alors que H ₂ O ₂ est un co-réactif pas cher, il est censément harmful pour de nombreuses enzymes. Une constante formation in situ de faibles concentrations de peroxyde d'hydrogène est une approche viable pour conduire la réaction sans nuire à la stabilité de fonctionnement de l'enzyme.

Figure 1. Dispositif expérimental de la décarboxylation photobiocatalytic des acides gras par olet _JE. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L'utilisation de la lumière comme source d'énergie pour les processus chimiques et biologiques a reçu une attention croissante au cours des dernières années ^6. Génération Light-conduit de peroxyde d'hydrogène a émergé comme une méthode simple et robuste pour fournir du peroxyde d'hydrogène pour les transformations redox (figure 1). Un photocatalyseur tel que le flavine adénine LUN.onucleotide (FMN) permet la réduction de l'oxygène moléculaire pour le peroxyde d'hydrogène, qui est ensuite utilisé comme cofacteur pour la réaction enzymatique oxyfunctionalization. Les donneurs d'électrons possibles sont l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'ascorbate ou le formiate peu coûteux. Le procédé est généralement applicable pour H ₂ O _2, y compris des enzymes dépendantes des peroxydases et des monooxygénases cytochrome P450 ^{3,4 5.}

Nous avons récemment étudié l'application d'une nouvelle décarboxylase bactérienne ⁷ pour la transformation des graisses naturelles en oléfines ^8. Ce serait une voie durable pour la synthèse de produits chimiques de plateforme largement utilisés à partir d'une source de bio. Le décarboxylase olet _JE du gram positif bactérie Jeotgalicoccus sp. catalyse la decarboxylation oxydative d'acides gras et forme alcènes-1 en tant que produits. Olet _JE est étroitement liée à monooxygénases P450 bactériennes et a besoin d' électrons from peroxyde d'hydrogène pour la réaction.

Malheureusement, l' addition de H ₂ O ₂ à une solution du substrat et de l' enzyme conduit à des conversions faibles et une faible reproductibilité des résultats, vraisemblablement en raison d'un effet néfaste du peroxyde d'hydrogène sur la stabilité de olet _JE. Génération d'une protéine de fusion avec la NADPH-réductase RhFred fait une décarboxylation NADPH-dépendante possible. ⁹ Néanmoins, le prix élevé de NADPH et les possibilités actuelles limitées pour une régénération rentable nous ont incités à enquêter sur des donneurs d'électrons moins chers. Inspiré par la similitude des olet _JE avec monooxygénases P450, nous avons utilisé la génération de lumière catalysée par H ₂ O _2. Nous avons été heureux d'obtenir des conversions élevées (jusqu'à> 95%) en utilisant des extraits exempts de cellules ou des solutions d'enzymes purifiées.

Avec l'exemple de décarboxylation des acides gras, nous présentons un protocole général pour enzym conduit la lumièreatiques transformations redox utilisant FMN comme photocatalyseur et peroxyde d'hydrogène comme cofacteur. Les méthodes présentées comprennent la production de l'enzyme dans la cellule recombinante de E. coli, purification de l'enzyme, l'application à la synthèse de 1-alcènes et l'analyse des produits de réaction.

Protocol

Attention: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (MSDS) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ces synthèses sont extrêmement toxiques et cancérigènes. Toutes les étapes impliquant des solvants organiques nocives, en particulier l'extraction des produits de réaction et la dérivation d'acides gras doivent être effectuées sous une hotte en utilisant un équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon pleine longueur, des chaussures fermées ). Toutes les opérations impliquant des organismes génétiquement modifiés dans ce travail exigent des installations qui sont approuvés pour le traitement d'organismes génétiquement modifiés du S1 au niveau de la sécurité.

1. Expression du recombinant décarboxylase olet _JE dans E. coli

1. Préparation de la souche de production
   1. Préparer un gène de synthèse de olet de _JE Jeotgalicoccus et clone dans le vecteur d'expression pASK-IBA37plus comme décrit. ⁸ REMARQUE: Pour éviter la dégradation des acides gras par les enzymes du métabolisme bactérien, E. coli , la souche de la collection JW5020 Keio avec une voie de dysfonctionnement de la dégradation des acides gras a été utilisé.
2. La culture et l' induction de l' expression enzymatique
   1. Préparer un pré-culture en inoculant le E. coli JW5020 olet mutant d'un LB-plaque (contenant 100 pg ml ^-1 ampicilline) en deux 3 ml de milieu LB dans des tubes à essai. Pipette ampicilline (100 pg ml ^-1) à partir d' une solution mère dans le milieu de sélection et incuber à 37 ° C pendant 15 heures dans un incubateur à agitation à 180 tours par minute.
   2. Ajouter 2 ml de pré-cultures à deux 200 ml de milieu LB, contenant de l' ampicilline (100 pg ml ^-1), dans 1 L secouer les flacons. L'incubation se déroule à 37 ° C et à 180 tours par minute.
   3. Surveiller le changement de OD _600nm après l'inoculation. Lorsque l'OD ₆₀₀ atteint une valeur comprise entre 0,6 und 0,8 induire l'expression en ajoutant la tétracycline (0,2 pg ml ^-1). Incuber les cultures pendant 15 heures à 20 ° C et à 180 tours par minute.
      NOTE: Depuis olet _JE contient un cofacteur hème, addition d'acide lévulinique δ-amino (0,5 mM) avant l'induction est nécessaire pour fournir la culture avec un précurseur de la synthèse du cofacteur.
3. lyse cellulaire
   1. Effectuez les étapes suivantes sur la glace. Transférer les cultures par décantation ou pipetage dans des tubes de centrifugation et utiliser une échelle pour assurer une distribution égale. Centrifuger les cultures pendant 20 minutes à 12.000 xg à 4 ° C.
   2. se débarrasser soigneusement le surnageant et remettre en suspension les culots dans 50 ml de tampon (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) par pipetage et transférer la suspension dans un tube centrifuge conique.
   3. Après centrifugation pendant 15 min à 4000 g à 4 ° C, éliminer le surnageant, remettre en suspension chaque culot dans 3 ml de tampon par pipetage.
   4. Effectuer la lyse cellulaire par tantnication les solutions sur la glace (trois cycles x 30 sec) en laissant une pause de 1 min entre les cycles. Centrifuger les solutions pendant 20 min à 15 000 xg à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires et le transfert du surnageant dans un tube de centrifugation conique sans perturber le culot par pipetage. Jeter le culot.
      Remarque: Une fraction de solvant sera utilisée directement pour la biocatalyse après les petites molécules sont enlevées. La seconde fraction est utilisée pour la purification du olet _JE marquée par His.
4. Enlèvement de petites molécules de cellules-extraits
   1. Avant d'utiliser l'extrait brut en biocatalyse pour éliminer les petites molécules qui pourraient interférer avec la formation de peroxyde d'hydrogène ou un transfert d'électrons par pipetage 3 ml d'extrait acellulaire dans une unité de filtre centrifuge avec une membrane et centrifuger kDa, 10 à 4000 g à 4 ° C. Remettre en suspension la protéine restante dans 3 ml de Tris-HCl tampon.
5. Purification de olet
6. Appliquer 3 ml du deuxième extrait cellulaire à ses colonnes à centrifuger Pur Ni-NTA, qui ont été équilibrées avant avec un tampon d'équilibrage (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazole 10 mM).
7. Sceller les colonnes avec les bouchons de fond et capsules à vis supérieures et les secouer légèrement jusqu'à ce que la résine est répartie également avec l'extrait exempt de cellules. Incuber les colonnes chargées pendant 30 min dans un agitateur de tête à 4 ° C.
8. On lave les colonnes avec 1 ml de tampon de lavage (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazole 20 mM, pH 7,4) par centrifugation à 700 g pendant 2 min. Répéter deux fois cette étape.
9. Placez les colonnes dans un tube de centrifugation conique fraîche et ajouter 1 ml de tampon d'élution (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, pH 7,4) olet _JE. Centrifuger à 700 g pendant 2 min et répétez cette étape deux fois.
   NOTE: Imidazole va se lier au nickel et donc retirer olet _JE de la colonne.
10. Transfert de l'élution à une unité de filtre centrifuge (10 kDa membrane) et centrifuger à 4000 g à 4 ° C pour éliminer l'imidazole.
11. Vérifier la pureté de l'enzyme par une SDS-PAGE (15%). Mélange ⁹ 3 ul de l'élution avec un tampon SDS (concentration finale 1x) et on incube la solution à 95 ° C pendant 5 min pour la dénaturation. appliquer ensuite le montant total sur un SDS-PAGE. Exécutez le gel à 35 mA en utilisant une protéine étalon commercial. Détecter la protéine à 50 kDa.
12. Pour déterminer la concentration en protéines disponibles utilisent un BSA-kit commercial. Pipette 50 ul d'échantillons de protéines dilué (1: 100, 1: 200, 1: 500) et la norme BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml ^-1) dans une plaque à 96 puits . Ajouter 200 pi de réactif de Bradford, mesurer l'absorbance à 595 nm après 15 min avec un fluorimètre et calculer les concentrations en utilisant la courbe standard.

2. Biotransformation Light-catalysée

1. Les réactions biocatalytiques sans addition de peroxyde d'hydrogène
   1. Préparer une solution à 10 ml de bouillon de 10 mM d'acide stéarique (M _r 284,5 g mol ^-1) en ajoutant 10% (v / v) tergitol et 0,0284 g d' acide stéarique à l' eau distillée. Chauffer la solution dans une chambre de chauffage à 60 ° C jusqu'à ce que l'acide gras est complètement dissous.
   2. Biocatalyse et d' échantillonnage
      1. Préparer deux 2 ml de mélanges réactionnels contenant 50 mM d'EDTA, 0,01 mM de FMN, l'acide stéarique 0,5 mM dans du Tris-HCl tampon. Ajouter une barre d'agitation magnétique pour l'alimentation en oxygène suffisante et placer les tubes de verre dans un bain d'eau chauffée à 25 ° C.
      2. Ajouter 200 pg ml ^-1 d'enzyme purifiée ou 10% (v / v) d' extrait exempt de cellules à chacun des mélanges réactionnels et les éclairer avec une ampoule de verre transparent (120 W) à 15 cm de distance des tubes de réaction.
      3. Prendre des échantillons de 200 ul à des points temporels spécifiques (0, 10, 30, 60 et 120 min et pendant la nuit) à arrêter la réaction avec 20 ul de HCl à 37%. Ajouter 5 ul d'acide myristique (10 mM afinrésolu-) comme standard interne.
2. L' analyse des produits de réaction
   1. Pour l'extraction ajouter de l'acétate d'éthyle, 500 ul des échantillons deux fois, inverser les tubes et centrifuger pendant 1 min à 13 000 x g.
   2. Enlever 400 pi du surnageant et laisser le solvant évaporer complètement.
   3. Dérivatiser les acides carboxyliques en acide trimethylsilylcarboxylic en ajoutant 200 pi de N -méthyl- N - (triméthylsilyl) trifluoro acétamide (MSTFA). Incuber la solution à 60 ° C pendant 30 minutes afin de convertir les groupes hydroxyles en triméthylsilyléthers.
   4. Détermination de la conversion par GC / FID
      REMARQUE: déterminer la formation de 1-heptadécène (TR: 8,34 min), l'acide stéarique, α- et β-hydroxy (RT: 12,05 et 12,1 min) et la diminution du substrat (RT: 11,15 min) en utilisant GC / FID.
      1. Définissez le profil de température décrit ci-dessous Régler la température d'injection à 340 ° C. Tenirla température initiale du four est à 90 ° C pendant 3,5 min , et augmente ensuite à 45 ° C min ^-1. A 220 ° C, maintenir la température pendant 2 min. Après une augmentation répétée de 45 ° C min ^-1, maintenir la température à 280 ° C pendant 2 min, puis augmenter avec 60 ° C min ^-1.
         NOTE: La température maximale de 330 ° C est maintenue pendant 1,44 min.
      2. Injecter 4 ul de l'échantillon, avec un rapport de division de 5 pour obtenir une volatilisation rapide et un mélange homogène avec de l'hélium gazeux porteur.
         Remarque: en fonction de l'augmentation de la température du substrat et des produits entreront dans la phase gazeuse. Les substances sont détectées par le GC / détecteur FID après le passage de la colonne à des temps de rétention spécifiques et sont affichés sous forme de pics à l'écran. Observer la formation de pointe sur le moniteur.
      3. Calculer la concentration du produit formé par la formule suivante:
         NOTE: Le facteur d'étalonnage a été déterminée spécifiquement pour cette colonne pour chaque substrat et le produit en calculant la courbe standard à partir de quantités connues des substances dérivées et leur zone de pic correspondant.
   5. Identifier les pics d'acides oléfiniques et ß-hydroxy par GC / MS.
      1. Identifier les pics d'acides oléfiniques et ß-hydroxy par GC / MS. Définissez le profil de température. Réglez la température d'injection à 250 ° C. Maintenir la température du four à 100 ° C pendant 5 min et ensuite augmenter à 20 ° C min ^-1.
         NOTE: Maximum température est maintenue pendant 7,5 min.
      2. Régler la température du détecteur de spectrométrie de masse à 250 ° C et de numérisation de 50 à 500 m / z en mode d'impact d'électrons.
         REMARQUE: ionisation par impact électronique supprime un seul électron qui entraîne la formation d'un radical cation qui sera transmis vers l'avant pour une analyse de masse. En raison des liaisons covalentes énergétiques élevées dans le intramolarbreak molécule création de fragments de bas m / z. Ces fragments forment une empreinte spécifique pour une substance.
      3. Injecter 1 pl de l'échantillon. Détecter le 1-heptadécène après 11,4 min Temps de rétention par l'empreinte correspondante (figure 2).

Results

Bien que l'ajout de peroxyde d'hydrogène au mélange réactionnel conduit à des conversions faibles à modérées (<10%), la génération in situ de peroxyde d'hydrogène a augmenté jusqu'à la conversion à une conversion de 80%. L' analyse par CG / SM montre la formation d'oléfines à partir d' acides gras (Figure 2).

Figure 2. (A) Profil de température pour GC / MS mesures. (B) d' empreintes digitales de l'élution 1-heptadécène après 11,4 min. (C) secondaire ions C _n H _2n-1 fragments caractéristiques d'oléfines terminales exemplaire montré pour 1-heptadécène. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

E. coli. Une solution d'enzyme purifiée a montré une corrélation claire entre la concentration d'enzyme et de conversion. L'augmentation de la concentration de la lumière-récolte molécule FMN conduisent à des conversions plus élevées. Cependant, l'augmentation de la concentration au-dessus de 10 mM n'a pas accélérer les réactions, ce qui indique que la quantité de peroxyde d'hydrogène est suffisamment disponible et non plus le facteur limitant.

En plus de la decarboxylation d'acides gras, olet _JE catalyse également une hydroxylation en position β. Dans la conversion de l'acide stéarique, la décarboxylation est environ trois fois plus rapide que l'hydroxylation. Dans une expérience typique utilisant une solution d'acide stéarique, 0,5 mM et 10 uM de FMN, 99% du substrat ont été convertis en un mélange de 1-heptadécène et de l'acide 2-hydroxystéarique avec un rapport de3.3: 1 (figure 3) ^8. Une enquête sur le spectre de la biocatalyse lumière entraînée substrat a montré que pour les acides gras avec de plus longues chaînes acyles, olet _JE catalyse préférentiellement la décarboxylation, tandis que la quantité relative d'acides hydroxyles gras dans le mélange de produits a augmenté avec plus courte longueur de chaîne. Les acides gras plus courts que l'acide myristique (C14) ne subissent pas décarboxylation.

Figure 3. Gas analyse chromatographique de olet _JE médiée décarboxylation de l' acide stéarique (11,15 min) dans 1-heptadécène (8,4 min), l' acide stéarique (12,04 min) acide stéarique β-hydroxy α-hydroxy (12,1 min). Le changement des zones de pic à partir d' échantillons prélevés sur un temps-cours de 2 heures est affiché. S'il vous plaît cliquez ici pour rivaliserwa version plus grande de cette figure.

De manière surprenante, l'acide des acides insaturés oléique (C18: 1D9 cis) et de l' acide linoléique (C18: 2d9d12) ne sont pas acceptés en tant que substrats, ce qui indique que la configuration torsadée de doubles liaisons cis ne peut pas être logé dans un mode de liaison productive dans l'enzyme. L'addition d'acide oléique (10%) a également empêché la transformation de l'acide stéarique. Fait intéressant, l' acide stéarique (C18: 1D9 trans) a été converti par olet _JE, mais avec une activité légèrement inférieure puis de l' acide stéarique.

Discussion

La génération de lumière-driven de peroxyde d'hydrogène peut être appliquée pour une gamme redox transformations, y compris peroxygenases ^3, chloroperoxidases ¹⁰ et P450 monooxygénases ^5. Il est une approche facile et pratique. À long terme, l'utilisation de la lumière visible ouvre la perspective d'utiliser la lumière du soleil pour les transformations chimiques, ce qui est une alternative durable pour les réactions riches en énergie.

La méthode est applicable avec l'enzyme purifiée ou avec un extrait acellulaire. Alors que ce dernier exige un coût moindre et le travail, il convient de noter que de petites molécules dans l'extrait brut peuvent interférer avec la conversion de la lumière catalysée. Une approche possible consiste à éliminer ces petites pièces avec une micromembrane ( à savoir, par centrifugation dans une unité de filtration centrifuge ou par dialyse). La concentration de la molécule de lumière récolte FMN détermine la concentration du peroxyde d'hydrogène. En fonction de la Affinité de l'oxydoréductase, cette concentration est déterminante pour l'activité enzymatique. Un autre facteur important est la concentration de l'EDTA donneur d'électrons sacrificiel. Le paramètre le plus important, toutefois, est la stabilité de fonctionnement et l'activité de l'enzyme.

Le olefinization d'acides gras est une réaction élégante pour la conversion des acides gras à base biologique en oléfines qui appartiennent aux principaux produits de base pour l'industrie chimique. Le biocatalytique décarboxylation conduit de lumière peut être effectuée à la température ambiante et à pH neutre, ce qui offre des avantages évidents en termes de durabilité.

Nos résultats montrent que la production in situ de peroxyde d'hydrogène est une stratégie pour alimenter le cofacteur sans nuire à la stabilité de l' enzyme, conduisant à une conversion élevée. Les méthodes actuelles pour la régénération du cofacteur utilisent des produits agricoles ou des produits chimiques à base de pétrole. réactions légères-driven apparaissent comme une alternative renouvelable. Avenirla recherche sera consacrée aux méthodes pour la substitution du réactif EDTA sacrificielle par des molécules moins chers et de réduire la quantité de la lumière-récolte molécule FMN.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Ampicilline	Sigma Aldrich	69-52-3
Réactif Bradford	Roth	K015.1
BSA	Sigma Aldrich	90604-29-8
DMSO	Sigma Aldrich	67-68-5
Acétate d’éthyle	Fisher Chemical	141-78-6
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Roth	8043.1
Riboflavine 5-monophosphate sel de sodium hydraté	Sigma Aldrich	130-40-5
Acide chlorhydrique 37 %	Sigma Aldrich	7647-01-0
Peroxyde d’hydrogène 30 %	Sigma Aldrich	7722-84-1
&delta ;-Acide aminolévulinique	Sigma Aldrich	5451-09-2
N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acétamide (MSTFA)	Sigma Aldrich	24589-78-4
Acide myristique >99 %	Sigma Aldrich	208-875-2  ;
Imidazole	Sigma Aldrich	288-32-4
Chlorure de sodium	Fisher Chemical	7647-14-5
Acide stéarique >99 %	Sigma Aldrich	57-11-4
Tétracycline	Sigma Aldrich	60-54-8  ;
Tergitol	Sigma Aldrich	MFCD01779855  ;
Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane	Sigma Aldrich	77-86-1
Device
Incubator	shaker G-25CK	New Brunswick Scientific
	Ecotron	Infors HT
Centrifugation	Labofuge 400R	Heraeus
	RC 5B Plus	Sorvall
	Fresco 17	Thermo Scientific
Rotors de centrifugation	SS34	Sorvall
	SLA	Sorvall
Banc propre	Envirco	Ceag Schirp Reinraum technik
Colonne GC-FID  ;	CP-Sil 5CB (30 m x 0,25  ; mm x 0,25 et micro ; m)  ;	Agilent Technologies
	(VF-5 ms + 5 m EZ Guard)  ;	Varian
GC-FID	GC-2010 plus	Shimadzu
GC-MS	IST-40	Varian
Agitateur magnétique	RCT classic	IKA
pH-mètre	SevenEasy	Mettler toledo
Sonicator	Branson Sonifier 250	Branson
Photomètre spectral	FLUOstar Omega	BMG Labtech
Equipment
Colonne de chromatographie d’affinité	His Pur Ni-NTA	colonne de spin Thermo Scientific
Centricon	Vivaspin turbo 15	VWR International
Microtiter	plates 96 Well Multiply® ; Plaques PCR	Sarstedt