Article de méthode

L'analyse du filtre à air dans l'échantillon d'endotoxines et de l'ADN contenu

9.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/53444

⸱

7 mars 2016

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

Dans cet article

Résumé

Deux analyses complémentaires de particules biologiques atmosphériques provenant de filtres échantillonnés à l’air sont décrites ici : l’extraction et la détection d’endotoxines et d’ADN.

Résumé

la recherche d'aérosol extérieure utilise couramment les matières particulaires échantillonné sur les filtres. Cette procédure permet à diverses caractérisations des particules collectées à effectuer en parallèle. Le but de la méthode présentée ici est d'obtenir une analyse très précise et fiable de l'endotoxine et l'ADN contenu des bio-aérosols extraits de filtres. L'extraction de poids moléculaire élevé des molécules organiques, telles que des lipopolysaccharides, des filtres échantillonnés consiste à secouer l'échantillon dans un milieu à base d'eau exempte de pyrogènes. L'analyse qui suit est basée sur une réaction enzymatique qui peut être détectée au moyen d'une mesure turbidimétrique. En conséquence de la teneur organique élevée sur les filtres de l'échantillon, l'extraction de l'ADN à partir des échantillons est effectuée en utilisant un kit d'extraction d'ADN du commerce qui a été conçu à l'origine pour les sols et modifié pour améliorer le rendement de l'ADN. La détection et la quantification des espèces microbiennes spécifiques à l'aide Reacti en chaîne par polymérase quantitativesur (q-PCR) sont décrits et par rapport aux autres méthodes disponibles.

Introduction

Des prélèvements d'air sur les filtres est un outil de base dans la recherche sur les aérosols atmosphériques. 1 Les filtres échantillonnés sont le point de départ pour diverses caractérisations biologiques des particules ambiantes recueillies chimiques, physiques, et. 2-11 L'avantage de cette approche est que différentes analyses peuvent être effectuée hors ligne sur le même échantillon. Compiler les données de toutes les différentes analyses permet au chercheur d'obtenir une bonne compréhension des caractéristiques des particules collectées et les aides à la résolution des questions complexes dans les sciences de l' atmosphère. 12,13 Par exemple, l' air-échantillons marins et intérieures prises au cours de la même période peut être comparé en ce qui concerne la toxicité des particules échantillonnée et la composition biologique. 14 pour cette étude, les lipopolysaccharides (LPS), des composants sur bactériennes parois cellulaires gram-négatives, également connu sous endotoxines ont été extraites des filtres échantillonnés à terre et à un site intérieur, et ont été évalués en utilisant lelimule amébocyte lysat (LAL). En parallèle, une évaluation génomique de la teneur en bactéries (bactéries totales, Gram-négatives, et les cyanobactéries) a été effectuée sur le même échantillon en utilisant la réaction en chaîne par polymérase quantitative (Q-PCR). Le test LAL est basée sur des mesures de turbidité formées suite à l'ajout d'un extrait aqueux de amœbocytes de la limule, Limulus polyphemus, à une solution aqueuse contenant les endotoxines. Plus la concentration d'endotoxine dans l'échantillon, la turbidité se développe rapidement. 15 L'analyse Q-PCR est basée sur un signal de fluorescence émis sous forme d' un fragment spécifique d'ADN est amplifiée. 16 Par suivi en temps réel du signal pendant la phase exponentielle de la PCR réaction et étalonnage avec une courbe standard, la quantité d'ADN initial peuvent être quantifiés. La combinaison de ces deux analyses avec d' autres, comme détaillé ailleurs, 14 peuvent fournir une bonne estimation des niveaux d'endotoxines et de laquantité de bactéries d'origine dans les échantillons.

Le but de la méthode présentée ici est d'obtenir une analyse très précise et fiable de l'endotoxine et l'ADN contenu des bio-aérosols extraits de filtres. Bien que les méthodes d'échantillonnage des caractéristiques physico - chimiques et inorganiques des aérosols sont bien connus et, plus récemment, des méthodes ont été développées pour enquêter sur sa composante de matière organique, 17 il y a eu peu de recherches sur la composante biologique des aérosols. 18 La raison pour laquelle le courant méthode consiste à combler cette lacune en présentant en détail une méthode robuste pour extraire, analyser et identifier la fraction biologique des aérosols atmosphériques 14.

La méthode détaillée ici devrait trouver une large utilisation dans les projets intérieurs et extérieurs biologiques aérosol recherche impliquant l' analyse du filtre. 20-24

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Note: Une liste détaillée de tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole est indiqué dans la section des matériaux.

1. Air Sampling sur Filtres

  1. Préparation des filtres
    1. Pour l' échantillonnage à volume élevé, utilisez 20,3 x 25,4 cm 2 filtres. Choisissez le type de filtre qui correspond le mieux aux besoins de la recherche, ainsi que la taille de coupure du filtre, le cas échéant. 1 Ici, les filtres en microfibres utilisation de quartz.
    2. filtres pré-cuisson servant au prélèvement du composé organique et biologique pour détruire les résidus organiques. Pour pré-cuire les filtres, les envelopper individuellement dans une feuille d'aluminium, puis les faire cuire dans un four de laboratoire à 450 ° C pendant au moins 5 heures.
    3. Conserver les filtres cuits à -20 ° C jusqu'à ce que l'échantillonnage.
  2. Manipulation de l'instrument et d'échantillonnage d'air
    1. la poussière résiduelle propre de la tête de l'échantillonneur à volume élevé. Essuyez les pièces avec des lingettes en papier propres et leur permettre de befo d'air secre les reconnecter à l'échantillonneur.
    2. Désinfecter la cassette de filtre avec de l'éthanol, et de travailler avec des gants et une blouse en tout temps.
    3. Placer un filtre pré-cuit à l'intérieur de la cassette de filtre propre, et procéder selon le manuel de l'échantillonneur à volume élevé.
    4. Marquez la date et les conditions météorologiques inhabituelles, le cas échéant (par exemple la pluie, tempête de poussière) sur la pellicule d'aluminium, et enregistrez - le dans un endroit propre jusqu'à la fin de l' échantillonnage.
    5. Recueillir le filtre échantillonné et le plier en deux, avec le côté échantillonné vers l'intérieur.
    6. Enveloppez le filtre dans la feuille d'aluminium d'origine et conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
      Remarque: Si le délai entre le prélèvement et l'analyse est plus de 2 mois, stocker l'échantillon à -80 ° C pour éviter la dégradation de la matière organique et biologique.

2. Analyse des endotoxines

Note: Désinfecter la surface de travail avec 70% d'éthanold travail avec apyrogènes tubes, des conseils et des réactifs seulement. Si la verrerie sont utilisés, pré-chauffage à 250 ° C pendant 30 minutes, ou 200 ° C pendant 60 minutes est nécessaire. 25 Préparer tous les réactifs dans une enceinte de sécurité biologique de classe II et de travailler avec des gants et une blouse en tout temps.

  1. Préparation des réactifs
    1. Suivre le protocole du fabricant LAL kit pour réhydrater le lysat peu avant l' utilisation. 26 Tapez doucement le flacon pour déloger LAL restant sur ​​les parois de la bouteille. Soulevez le bouchon doucement pour casser le vide. En utilisant une seringue aiguilleté, ajouter 5 ml d'eau apyrogène (PFW) dans le flacon pour réhydrater tout le contenu de lysat et mélanger doucement pour éviter la formation de mousse.
    2. Sceller le flacon avec un film de paraffine plastique lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à deux jours. Rangez tout lysat restant à -20 ° C pendant jusqu'à trois mois.
      Remarque: Ce réactif peut être congelé une seule fois.
    3. Réhydrater le contrôle endotoxine standard (CSE), qui contient 0,5 μ; g E. coli, en conformité avec le protocole du fabricant. 27 Déterminer la quantité spécifique d'eau à ajouter au flacon CSE à partir du site Web du fabricant 28 en entrant le numéro de lot du kit où spécifié sur le site. La concentration finale de E. coli dans le flacon, est mesuré en unités d'endotoxines (UE, où 10 UE = 1 ng). Nommez ce flacon ed0.
    4. Sceller le flacon CSE avec un film de paraffine plastique lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 4 semaines.
  2. Courbe standard et préparation Pointu-filtre
    1. Dans une biosécurité armoire de classe II, préparer 22 tubes de 2 ml de centrifugeuse libre de pyrogènes contenant des quantités décroissantes de CSE (tubes Ed1-ED11) ou pas du CST (le tube ne contenant que PFW) pour produire une série de dilutions d'endotoxine dupliqué, comme indiqué dans le tableau 1.
    2. Dans une armoire biologique avec écoulement circulaire, couper 22 pièces circulaires de nettoyage filtre, pré-cuit en utilisant un désinfectée 1.1 2 cm de diamètre perce-bouchon.
    3. Placer les paires de filtres dans des boîtes de Pétri stériles.
    4. Spike 50 ul de chaque membre de la série endotoxine de dilution Ed2-ED11 et de l'ébauche de tube sur une paire correspondante de filtres.
    5. Laissez les boîtes de Petri contenant les filtres dopés ouverts sous la hotte à sécher pendant 30 minutes.
    6. Placer chaque élément de filtre dans un tube de 2 ml apyrogène.
Tube Concentration d'endotoxine final (UE ml -1) Le volume d'endotoxine standard (ml) Volume d'eau Apyrogène (ml) volume total (ml)
ed0 2.500 solution de stock * 5
Ed1 1000 80 (à partir ed0) 120 200
Ed2 100 20 (à partir Ed1) 180 200
Ed3 50 10 (à partir Ed1) 190 200
Ed4 25 5 (à partir Ed1) 195 200
ED5 12.5 2,5 (à partir Ed1) 197,5 200
ED6 6,25 1,25 (à partir Ed1) 198,75 200
Ed7 3.125 6,25 (à partir Ed2) 193.75 200
Ed8 1.563 6,25 (à partir Ed3) 193.75 200
ED9 0.781 6,25 (à partir Ed4) 193.75 200
ED10 0,391 6,25 (à partir ED5) 193.75 200
ED11 0,195 6,25 (à partir ED6) 193.75 200
Blanc 0 0 200 200
* Préparer la solution mère selon les instructions du fabricant.
">

Tableau 1:. Endotoxine standard Courbe concentration des endotoxines, le volume d'endotoxine standard et de l' eau apyrogène à ajouter, et le volume total obtenu sont détaillés pour chaque tube de dilution dans la courbe d'étalonnage.

  1. Extraction des endotoxines de l'expérimental et Filtres Pointu
    1. Dans une armoire biologique avec écoulement circulaire, couper les filtres de prélèvement (de l'étape 1.2) en morceaux circulaires en utilisant un désinfectée 1,12 cm de diamètre perce-bouchon, et placez-les, ainsi que les filtres standards enrichis (de l'étape 2.2) dans 2 apyrogène tubes ml (ie, les tubes d'échantillons).
    2. Ajouter 1 ml PFW les tubes et les secouer pendant 60 min à température ambiante, en utilisant un agitateur de laboratoire.
    3. Centrifuger les tubes d'échantillon dans une microcentrifugeuse à 375 xg pendant 10 min. 29
    4. e Transferte surnageant, qui contient les endotoxines, dans un nouveau tube 2 ml apyrogène.
  2. Limulus Amebocyte Lysate (LAL)
    1. Déterminer la concentration d'endotoxine dans les échantillons en effectuant le test LAL dans une microplaque à 96 puits apyrogène avec un fond plat et d'un couvercle.
    2. Planifier la matrice de la plaque à l' avance, comme le montre la figure 1. Inclure une courbe standard préparée directement à partir de solutions étalons d'endotoxine Ed2-ED11 (et donc couvrant la gamme de concentration de 100-0.195 UE / ml (voir section 2.2)) dans chaque plaque en cours d' exécution . La courbe standard doit occuper les puits 1-10 de lignes A et B de la plaque. Mettez de côté les puits 11-12 dans ces lignes pour des échantillons blancs (soit un total de quatre blancs).
    3. Activer le lecteur de microplaque et le programmer pour une réaction cinétique impliquant l'incubation de la microplaque à 37 ° C et en agitant toutes les 5 minutes, suivie par des mesures d'absorption à 405 nm. Répétez 18 fois pendant 1,5 heure.
    4. Déterminer le efficiency avec laquelle les endotoxines sont extraites des filtres de prélèvement (ie., les échantillons obtenus à partir des filtres standards enrichis) via la division de la quantité d'endotoxine calculée par le montant initial ensemencés.
    5. Démarrez le test en plaçant 50 ul des solutions d'endotoxines standards (de l'étape 2.4.2), ou de l'extrait de filtre à pointes et ses ébauches (de la section 2.3), ou des échantillons expérimentaux et ses ébauches (également de la section 2.3), selon la plaque-matrice prévue (Figure 1) et fermez le couvercle.
    6. Pour chaque puits, ajouter rapidement 50 pi de solution LAL, et secouez doucement la plaque horizontalement alors qu'il est placé sur la table avant de le soulever dans le lecteur.
    7. Placer la plaque dans le lecteur de plaque et commencer la course expérimentale.

figure-protocol-1
Figure 1:. Plaque de matrice endotoxines Un exsuffisamment d'un tableau d'analyse des endotoxines dans une microplaque à 96 puits.

3. Analyse génomique

Remarque: Pour l'extraction d'ADN, désinfecter la surface de travail avec 70% d'éthanol et de travailler avec des tubes stériles, des conseils et des réactifs seulement. Pour l'analyse q-PCR de l'ADN, désinfecter la surface de travail avec la surface de l'ADN-décontaminant. Préparer tous les réactifs dans une armoire de biosécurité de classe II et de travailler avec des gants et une blouse en tout temps.

  1. Préparation des ADN Amorces et sondes
    1. Avant l' extraction d'ADN, soit pour un ensemble disponible dans le commerce d'amorces et d' une sonde (si la méthode de la sonde d'hydrolyse est appliquée), ou concevoir un nouvel ensemble d'amorces et une sonde en utilisant l' amorce de la conception des outils de calcul. 30
    2. Réhydrater les amorces selon le protocole du fabricant en utilisant soit 10 mM de Tris-0,1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (tampon TE) ou de l'eau de qualité PCR.
      Remarque: Il est recommandé de dissoudre l'amorce PCR initiale stock dans un tampon TE à faible EDTA (0,1%), telle qu'elle empêche la dégradation de l'amorce, lorsqu'il est conservé pendant des durées plus longues. Utiliser de l'eau PCR de qualité pour les dilutions ultérieures pour réduire les quantités d'EDTA qui pourraient inhiber les réactions de PCR.
    3. Préparer des aliquotes de 50 ul ou 100 ul de l'amorce et de la sonde dans 0,5 ml tubes stériles et conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
  2. Norme d'évaluation cellule de concentration avant l'extraction de l'ADN
    1. Dans un tube de centrifugeuse de taille appropriée, préparer une solution standard de cellule des espèces microbiennes d'intérêt (OD0 le tube, le tableau 2A). Mélanger la suspension de cellules par pipetage vers le haut et vers le bas dans le tube 7-10 fois à l'aide d'une pipette avec un petit alésage.
    2. Si les cellules sont colorées (par exemple , certaines spores fongiques), ne pas effectuer une procédure de coloration. Si la coloration des cellules est nécessaire, diluer la suspension cellulaire dans un colorant approprié pour la détection microscopique des cellules d'intérêt. 31
    3. Nettoyez la lamelle et hemocytomEter avec de l'éthanol. Mouiller et apposer le lamelle à l'hémocytomètre.
    4. Chargez environ 8 pi de la suspension cellulaire dans les deux chambres de hémocytomètre en touchant soigneusement le bord de la lamelle avec la pointe de la pipette et le remplissage de la chambre par action capillaire. Ne pas remplir sur / sous la chambre.
    5. Déterminer le nombre de cellules en les regardant au microscope à un grossissement de 400X (40X dans l'objectif et 10X dans oculaire). Neuf carrés mesurant 1 x 1 mm 2 et disposés en une grille de 3 x 3 doivent être considérées. Concentrez le microscope sur l'une des quatre cases de coins de la grille (un grossissement plus élevé peut être utilisé). Le 2 mm carré 1 x 1 devrait contenir 16 petits carrés.
    6. Compter toutes les cellules dans les quatre 1 x 1 mm 2 carrés d'angle, ainsi que sur la place centrale de la grille 3 x 3. S'il y a trop ou trop peu de cellules pour compter, répéter la procédure, soit la concentration ou la dilution de la suspension cellulaire d'origine, le cas échéant (15-50 cellules devraient recouvrir une 1 mm 2 zone singulariser).
    7. Calculer la concentration des cellules (cellules ml -1) dans la suspension de cellules standard OD0 de la cellule comptent en moyenne sur les cinq carrés comptés comme suit: carré de comptage cellulaire count ml -1 = cellule moyenne -1 Dilution Factor 10 4.
  3. L'évaluation de l'efficacité d'extraction d'ADN
    1. Préparer neuf stériles tubes de 0,5 ml , conformément au tableau 2A.
    2. Diluer la solution de cellules standard (OD0) contient environ 10 7 cellules ml - 1 dans un volume total de 20 ul (OD1).
    3. Ajouter 18 ul d'eau PCR de qualité stérile sans nucléase (SNF) aux tubes Od2-OD8 et 20 pi au tube vide, OD9.
    4. Transfert de 2 ul de la solution cellulaire à partir OD1 en Od2. Pipette doucement pour mélanger et transférer 2 pl du tube Od2 à OD3. Continuer à diluer les cellules de la même manière le long des tubes jusqu'à et y compris le tube OD8 à obtenir une dilution en série de 10 7 -10 0 cellules ml -1.
    5. Dans une armoire biologique avec écoulement circulaire, couper 18 pièces circulaires propre filtre, pré-cuit, en utilisant un désinfectée 1,12 cm de diamètre perce-bouchon. Placez les filtres par paires dans des boîtes de Petri stériles.
    6. Spike 10 ul de dilutions à OD1 OD8 et du tube-ébauche OD9 sur chacun des filtres couplés, de sorte qu'il y a une paire de filtres correspondant à chaque concentration de cellules standard.
    7. Laissez les boîtes de Pétri ouvertes sous le capot et les laisser sécher pendant 30 minutes.
    8. Placez chaque morceau de filtre dans une vis-top 2 ml tube stérile et extraire l'ADN selon la procédure détaillée dans la section 3.4.
  4. Extraction de l'ADN de l'expérimental et Filtres Pointu
    Remarque: Pour l'extraction d'ADN à partir des filtres, en utilisant des kits commerciaux destinés à l'extraction d'ADN à partir du sol selon le protocole du fabricant avec les modifications suivantes.
    1. Pour chaque filter échantillon (OD1-OD8), préparer un mélange de billes acide lavé verre dans un tube stérile de 0,5 ml. En utilisant 0,1 g de perles ayant un diamètre de 425-600 um et 0,3 g de billes ayant un diamètre de ≤106 nm.
    2. Dans une armoire biologique avec écoulement circulaire, couper trois pièces circulaires à partir d'emplacements choisis au hasard sur chaque échantillon de filtre à l'aide d'un désinfectée 1,12 cm de diamètre perce-bouchon, et les placer dans vissable tubes de 2 ml.
    3. Ajouter le mélange de perles de verre dans les tubes.
    4. Ajouter le tampon de lyse cellulaire fourni avec le kit d'extraction pour chacun des tubes dans l'armoire biologique, la quantité indiquée dans le protocole du fabricant.
    5. Préparer un seau de glace et de perturber les cellules mécaniquement à l'aide d'un batteur à billes.
    6. Battre les perles pendant 1 min, puis placez-les sur la glace pendant 1 min. Répétez cinq fois.
    7. Procédez avec le protocole du fournisseur de kit de l'étape de post-lyse.
    8. Après élution avec le tampon d'élution fourni (contenant 10 mM de Tris buffer) ou SNF, rechargent l'échantillon élué à travers la colonne à nouveau pour améliorer le rendement de l'ADN.
      Nota: Dans le cas contraire analysés le même jour que l'extraction d'ADN, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
A- Préparation de la norme série de cellules de Dilution
Tube La concentration finale de cellules (cell ml -1) volume de cellule standard (ml) volume d'eau exempte de nucléase (ml) Volume total (ml)
OD0 déterminer avec Hemocytometer chambre de comptage
øD1 doit être élue dans la plage de 10 7 cellules ml -1 20
Od2 10 -1 øD1 2 øD1 18 20
OD3 10 -2 øD1 2 Od2 18 20
OD4 10 -3 øD1 2 OD3 18 20
OD5 10 -4 øD1 2 OD4 18 20
Od6 10 -5 øD1 2 OD5 18 20
Od7 10 -6 øD1 2 Od6 18 20
OD8 10 -7 øD1 2 Od7 18 20
Blanc 0 0 20 20
B- Préparation de la courbe standard d' ADN
Tube Concentration finale de l' ADN (mg ml -1) le volume de l'ADN standard (ml) volume d'eau exempte de nucléase (ml) Volume total (ml)
déterminer avec NanoDrop
Dd1 devrait être élue à la gamme de 10 à 1 mg ml -1 20
Dd2 10 -1 Dd1 2 Dd1 18 20
DD3 10 -2 Dd1 2 Dd2 18 20
DD4 10 -3 Dd1 2 DD3 18 20
DD5 10 -4 Dd1 2 DD4 18 20
Dd6 10 -5 Dd1 2 DD5 18 20
DD7 10 -6 Dd1 2 Dd6 18 20
DD8 10 -7 Dd1 2 DD7 18 20
Blanc 0 0 20 20
1 "style =" height: 21px; "> DD0

. Tableau 2: Courbe standard d' ADN standard série de dilutions de cellules de micro - organisme (A) détaillé du volume normal de la cellule, le volume SNF, et le volume total dans chaque tube de dilution. Préparation ADN standard de la courbe (B), détaillé pour le volume standard d'ADN, le volume SNF, et le volume total dans chaque tube de dilution.

  1. Préparation courbe standard ADN
    1. Extraire l'ADN directement à partir d'un échantillon étalon du micro-organisme d'intérêt (DD0) en utilisant la même procédure que celle décrite pour les filtres expérimentaux à l'étape 3.4.
    2. Utiliser un spectrophotomètre pour déterminer la concentration d'ADN de l'échantillon d'ADN standard (DD0) à 260 nm.
    3. Préparer neuf stériles tubes de 0,5 ml à partir de laquelle pour préparer une courbe standard d'ADN, comme indiqué dans le tableau 2B.
    4. Si nécessaire, diluer la solution d'ADN standard DD0 à l' intérieur d' une plage de concentrations de 1-10 pg ml - 1 dans le premier tube (Dd1) dans un volume total de 20 ul.
    5. Ajouter 18 pi de SNF aux tubes Dd2-DD8 et 20 pi au tube vide.
    6. Transfert 2 pl de la solution d'ADN standard de Dd1 en Dd2. Pipet doucement pour mélanger puis transférer 2 pl de Dd2 à DD3. Continuer la dilution de l'ADN de la même manière le long des tubes pour parvenir à une dilution en série de 10 0 -10 -7 Dd2 dans des tubes-DD8 conjointement avec un tube vide containing seulement SNF.
      Remarque: Dans le cas contraire analysés le jour même de l'extraction, conserver les échantillons à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
  2. L'analyse quantitative PCR
    1. Allumez l'instrument q-PCR à l'avance pour se réchauffer.
    2. Dans un nouveau fichier de programme, insérer les détails pour le q-PCR exécuter dans le logiciel de l' appareil fonctionnant comme détaillé dans le tableau 3.
      Remarque: Différents instruments ont différents moment optimal pour chaque étape du cycle thermique. Cette entrée est spécifiée dans le manuel de l'instrument.
    3. Désinfecter la surface de travail avec la surface de l'ADN-décontaminant et de travailler uniquement avec des tubes stériles, des conseils et des réactifs.
    4. Préparer un seau de glace à côté du banc de travail. Magasin Taq-polymérase mélange sur la glace.
    5. Calculer le nombre total de puits de réaction qui seront occupés dans la plaque. Faire provision théorique pour des réactions supplémentaires (5%) et multiplier le nombre élargi de réactions par le volume par réaction pour calculer la reactio totalen volume.
    6. Préparer la piscine de réaction mixte, à partir de SNF, les amorces, la sonde, et enfin le mélange de polymerase Taq. Voir l' exemple pour les calculs de volume pour la piscine mixte dans le tableau 4.
    7. Stocker le mélange de réaction dans l'obscurité et sur la glace jusqu'à utilisation.
    8. Placer 1 pi d'ADN standard, l'ADN de l'échantillon, ou SNF (comme témoin négatif) à l'intérieur des puits dans la microplaque q-PCR en triple exemplaire.
    9. Faire en sorte que la plaque est un support de plaque pour l'empêcher de toucher la surface de travail et pour le maintenir propre.
    10. Ajouter 9 pi de la piscine mixte (tableau 4) dans chaque puits de réaction.
    11. Couvrir la plaque avec un film adhésif optique et sceller hermétiquement de tous les côtés.
    12. Isoler la plaque dans une centrifugeuse avec des seaux de plaque pendant 1 min à 1000 xg avant de le placer dans le dispositif q-PCR.
    13. Placer la plaque dans l'instrument et activer le programme en cours d'exécution.
Paramètre Détails commentaires
Méthode de détection sonde d'hydrolyse quantitative
Les conditions de cyclage thermique
Dénaturation initiale et l'activation de l'enzyme 95 ° C pendant 10 min
Dénaturation 95 ° C pendant 15 sec répéter 45 fois
Recuit et l'extension 60 ° C pendant 60 sec
array Plate
courbe standard Dd1 - DD8 3 répétitions par dilution dans 1-8 puits à 3 rangées supérieures
Contrôle non-template (NTC) eau libre nucléase (SNF) 3 répétitions dans le 9 ème et au sommet3 rangées.
Les échantillons analysés ADN extrait des filtres 3 répétitions par échantillon dans les puits restants.
Amorce par chaque puits
volume d'échantillon 10 ml

Tableau 3:. Détails pour le logiciel d' exploitation q-PCR Détails des paramètres d'analyse pour être entrés dans le fichier de programme q-PCR.

Réactif Volume par réaction (ml) Nombre de réactions Provision pour erreur(5%) Mix volume total (ml)
Taq polymérase mix 5 50 52,5 262,5
F amorce (10 mM) 0,5 50 52,5 26.25
R primaire (10 mM) 0,5 50 52,5 26.25
eau libre nucléase 3 50 52,5 157,5
ADN - 1 ml sera ajouté directement dans les puits de cibles dans la plaque 96.

Tableau 4:. Quantitative-PCR Réaction Mix Calcul Volume par réaction, nombre de réactions, l' allocation pour l' erreur, et le volume total calculé à ajouter dans le mélange de réaction par réactif sont détaillées.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Il est commun pour étudier les aérosols atmosphériques en utilisant "off-line" analyses de filtres échantillonnés (voir la figure 2). 32 Les analyses chimiques de la matière comprennent organique (par exemple les protéines, les molécules d'hydrocarbures, saccharides) et inorganiques (métaux, sels) contenu échantillonné . Les analyses biologiques comprennent le contenu viable et non viable microorganisme, l'identification des...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Cet ouvrage décrit les méthodes d'extraction et de détection pour quantifier les endotoxines et de l'ADN présent dans des échantillons d'aérosols collectés sur des filtres. Les méthodes nécessitent des routines précises et peuvent être réalisées facilement aussi longtemps que l'expérimentateur adhère à quelques points essentiels et importants discutés ici.

Pour l'étape de détection d'endotoxine, notons que la solution de lysat est tout à fait visqueux et tend à produi...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Yoav Barak de la Faculté de chimie de l’Institut Weizmann pour son soutien et ses conseils. Cette étude a été soutenue par la Fondation israélienne des sciences (subvention # 913/12), et par la Fondation Minerva avec un financement du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filter sampling
HiVol 3000 - Échantillonneur d’air à haut volumeEcotech
Filtres en microfibre de quartzWhatman1851-865203 mm x 254 mm
ELF - Fours à chambre de laboratoireCarboliteELF 11series
Feuille d’aluminiumOpale
< strong>NomEntreprise>Numéro de catalogue>Comments
Endotoxin
EthanolSigma Aldrich16368  ;Réactif de laboratoire, 96 %
Enceinte de sécurité biologique Airstream Classe II AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell -TAssociates de Cape Cod, Inc.T0051
Norme de contrôle EndotoxinAssociates de Cape Cod, Inc.E0005-1Escherichia coli  ; O113 :H10, 0,5 et micro ; g/flacon 1 paquet
réactif LAL WaterAssociates de Cape Cod, Inc.W0051
Seringue stérile de 10 ml avec embout Luer-LokBecton-Dickinson & Co.
aiguille à seringue BD PrecisionglideBecton-Dickinson & Co.305129Stérile  ;
Parafilm-M ruban d’étanchéitéParafilmP7543Sigma numéro de catalogue
MicrotubesAxigenMCT-200-C2 ml, apyrogène
1,12 cm de diamètre Perceur de liègeBoekel Scientific1601 BD Series - AcierPartie d’un kit de foreurs de liège contenant des foreurs de différents diamètres.  ;
Boîte de Pétri 50 mmMiniplast Ein-Shemer72050-01Aseptic
Vortex Genie 2  ;Industries scientifiques, inc.SI-0297
Microcentrifugeuse 5415 DEppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI avec couvercleNunc167008Puits à fond plat (avec couvercle (emballé individuellement)), stériles, sans pyrogène
Synergy HT Multi-Detection Microplate ReaderBiotek7091000
NameCompanyNuméro de catalogue>Comments<
strong>DNA
DNA awaySigma Aldrich7010
ADN standard de l’espèce microbienne d’intérêtATCC ou autre collectionSoit la souche microbienne appropriée pour l’extraction de l’ADN, soit l’ADN extrait
Tampond’hémocytomètreMarienfeld640030
, Low EDTALife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (pH 8,0)  ; 0,1 mM d’EDTA  ;
Eau de qualité PCR sans nucléases  ;Sigma Aldrich3315959001
amorces PCRSigma AldrichCible les espèces microbiennes d’intérêt
Sondes à double marquageSigma AldrichCible les espèces microbiennes d’intérêt
Tubes à bouchon à visAxigenST-200-SS2 ml  ;
Kit d’extraction d’ADN PowerSoil  ;Mo Bio Laboratories12888-100
Perles de verre, lavées à l’acide 425-600 & micro ; mSigma AldrichG8772-100G
Perles de verre, lavées à l’acide < 106 et micro ; mSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Solution C1Mo Bio Laboratories12888-100-1Tampon de lyse cellulaire , Power soil Kit
Magic Touch seau à glaceBel-Art18848-4001
Mini-Beadbeater-16BioSpec607EUR
Système de PCR en temps réel StepOnePlusApplied Biosystems4376600
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612
TaqMan Expression génique Master MixApplied Biosystems4370048
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate avec code-barres, 0,1 mlApplied Biosystems4346906
MicroAmp Splash-Free 96-WellApplied Biosystems4312063
MicroAmp Optical Adhesive FilmadhésifApplied Biosystems4311971
Centrifugeuse 5810 REppendorf5811 000.010Rotor A-4-62 avec godets MTP  ;
de 309605 de cultures TE amélioré par Neubauer Base

Références

  1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
  3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).
  9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
  10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
  26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
  27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
  28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
  29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
  32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
  33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
  40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Analyse des endotoxinesExtraction d ADNchantillonnage par filtrationMesure turbidim triquePCR quantitativeBroyage aux billes de verreEau exempte de pyrog nesProtocole de centrifugationPoste de s curit microbiologiqueLecteur de microplaques

Articles connexes