Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Résumé

Nous présentons ici une description unifiée de techniques qui peuvent être utilisés pour développer, transformer, administrer et tester l'expression de protéine hétérologue de la levure probiotique Saccharomyces boulardii.

Résumé

Le développement d’un traitement oral recombinant permettrait de cibler plus directement le système immunitaire muqueux et d’améliorer la capacité à combattre les troubles gastro-intestinaux. L’adaptation de la levure probiotique en particulier pour cette approche comporte plusieurs avantages. Ces souches ont non seulement le potentiel de synthétiser une grande variété de protéines hétérologues complexes, mais sont également capables de survivre et de protéger ces protéines pendant leur transit dans l’intestin. Cependant, cette approche nécessite une expertise dans de nombreuses techniques de laboratoire diverses qui ne sont généralement pas utilisées en tandem. De plus, bien que les protocoles individuels de transformation des levures soient bien caractérisés pour les souches de laboratoire couramment utilisées, l’accent est mis ici sur les approches alternatives et l’importance d’optimiser la transformation pour les souches probiotiques moins bien caractérisées. Le détail de ces méthodes facilitera la discussion sur les meilleures approches pour tester la levure probiotique en tant que véhicules d’administration de médicaments par voie orale et servira effectivement à faire progresser le développement de cette nouvelle stratégie de thérapie gastro-intestinale.

Introduction

micro-organismes probiotiques sont des moyens potentiels intrigants de manière efficace et économique la prestation protéines hétérologues dans le tractus gastro-intestinal. Ces organismes sont capables de survivre passage à travers le tractus gastro-intestinal pour l'instant ne coloniser ^1, ce qui permet un dosage contrôlé et en limitant l'exposition au médicament exprimé. En outre, la capacité de construire facilement ces organismes pour produire une protéine hétérologue à grande échelle les rend une alternative économique aux particules de livraison synthétiques. Cependant, le développement d'une telle approche, comme l'a montré récemmen....

Protocole

1. mutagenèse UV pour générer auxotrophes souches de levure

1. Générer des courbes de survie pour déterminer les doses nécessaires de l'irradiation UV
   1. Préparer YPD (extrait de levure peptone dextrose) les médias et d'autres réactifs énumérés dans le tableau 1 selon les procédures standard ²⁶ et ensemencer des colonies isolées dans 5-10 ml de YPD médias. Incuber les cultures sur un rouleau tambour à 30 ° CO / N à la saturation pendant au moins 8 heures.
   2. Déterminer la concentration cellulaire de O / N cultures à l'aide d'un spectrophotomètre en diluant les cellules 01 heures 10 dans l'eau dans u....

Résultats

Génération d'une courbe de survie après irradiation UV nécessite placage des cellules de levure dilués de telle sorte que les unités formant colonie (UFC) distinctes sont capables de former. Chaque échantillon de 500 ul recueillies comme décrit ci-dessus contient environ 5 x 10 ⁶ cellules; Toutefois, plus de 100 colonies par plaque sont difficiles à distinguer avec précision. Placage échantillon non dilué ainsi que série des dilutions 1:10 de cellules irradiées assure ains.......

Discussion

Ensemble, les protocoles ici décrivent les étapes essentielles nécessaires pour le développement et les tests de souches de levures probiotiques auxotrophes pour la livraison de la protéine thérapeutique hétérologue à l'intestin. Cette manipulation et l'expérimentation de levure probiotique recombinant nécessite des techniques et des ressources avec lesquelles tout laboratoire individu peut ne pas être actuellement familier. Ainsi, bien que de nombreuses études précédentes ont décrit les protocoles ci-dessus pou.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Spectrophotomètre SmartSpec 3000	BioRad	170-2501	Exemple de spectrophotomètre pour déterminer la concentration cellulaire et la 600 des cultures de levure
Nouveau-Brunswick Tambour à rouleaux	Eppendorf	M1053-4004	Exemple de tambour à rouleaux pour l’incubation de cultures de levures
UV Stratalinker 2400 Stratagene		400075-03	Exemple de stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate support avec grossissement enregistre le nombre de colonies lors de la détection de la pression du stylo
Scienceware Colony Counter  ;	F378620002	Bel-Art Scienceware	Compteur de colonie à main
Réplique du dispositif de placage	Fisherbrand	09-718-1	Exemple de réplique de support de placage et de tampons  ;
Carrés de velours	Fisherbrand	09-718-2
Épandeurs de cellules stériles en forme de L	Fisherbrand	14665230
Acide désoxyribonucléique, simple brin à partir de testicules de saumon	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Exemple d’ADN porteur pour la levure Transformation LiOAc
Aiguilles de gavage	Braintree Scientific	N-PK  ; 002	Pour les souris de 15 à 20 g, l’aiguille suggérée est une aiguille à gavage réutilisable de calibre 22 (boule de 1,25 mm), longue et droite. Pour les souris pesant plus de 20 g, calibre 20 ou plus Des aiguilles à gavage droites ou incurvées peuvent être utilisées
ml Seringue à tuberculine jetable stérile à embout coulissant	Becton Dickinson	BD 309659
Pince émoussée telle que Electron Microscopy Sciences Pointe dentelée de 7" (178 mm), pince à prise large	Microscopie électronique	Sciences 77937-28	Exemple de pince émoussée nécessaire pour la dissection  ;
Ciseaux de dissection droits et courbes	Microscopie électronique Sciences	72966-02 et 72966-03	Exemples de ciseaux nécessaires pour la dissection
IMDM	Life technologies	12440053

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