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Article de méthode

Suivi et quantification des processus de développement des

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⸱

DOI :

10.3791/53469

⸱

16 décembre 2015

 ,  ,  ,  , 
1Buchmann Institute for Molecular Life Sciences and Institute of Biochemistry II, School of Medicine, Goethe University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, on montre comment suivre et quantifier les processus de développement chez C. elegans. Les méthodes présentées sont basées sur des outils open-source qui peuvent être facilement mis en œuvre. Il est démontré comment reconstruire des modèles de forme cellulaire 3D, comment suivre manuellement les structures subcellulaires et comment analyser le flux contractile cortical.

Résumé

Capturant quantitativement les processus de développement est cruciale pour obtenir des modèles mécanistes et clé pour identifier et décrire les phénotypes de mutants. Voici protocoles sont présentés pour la préparation des embryons et des adultes de C. elegans pour animaux à court et à long terme Vidéomicroscopie et des méthodes pour le suivi et la quantification des processus de développement. Les méthodes présentées sont toutes basées sur C. souches elegans disponibles à partir du Centre de Génétique et de Caenorhabditis sur les logiciels open-source qui peuvent être facilement mises en œuvre dans tout laboratoire indépendamment du système de microscopie utilisée. Une reconstruction d'un modèle cellulaire-forme 3D utilisant le IMOD logiciel de modélisation, suivi manuel des structures sous-cellulaires marqués par fluorescence à l'aide du multi-usages programme d'analyse d'image Endrov, et une analyse des flux contractile corticale en utilisant PIVlab (Time-Resolved numérique Particle Image Velocimetry Outil pour MATLAB) sont présentés. Il est discuté comment ces méthodes peuvent également être déployés to capturer quantitativement autres processus de développement des différents modèles, par exemple, le suivi de la lignée cellulaire et le traçage, le suivi des flux de vésicule.

Introduction

Avec les améliorations constantes des protéines fluorescentes, l'ingénierie des génomes, la microscopie optique et ciels et de matériel informatique, il est désormais possible d'enregistrer développement de nombreux organismes modèles à une résolution spatio-temporelle sans précédent. Cela permet aux chercheurs de poser des questions qui ne pouvaient pas être traitées antérieurement ou de revoir les processus de développement connues afin de chercher des aspects négligés. Ce progrès a suscité le domaine de la biologie du développement quantitatif, qui vise à transformer les modèles qualitatifs, informelles dans des modèles quantitatifs par des mesures approfondies et des analyses statistiques.

Cellules de suivi et de structures sous-cellulaires a permis de tirer des modèles quantitatifs du développement embryonnaire, l'activité du système nerveux, ou la division cellulaire 1-12. En faisant le suivi des restes de la division cellulaire au cours du développement précoce de la C. elegans embryon, nous pourrions récemment révéler qu'ils suivent une chaîne stéréoFacteurs tapé chemin de polarisation importante et constituer 13,14.

Ici, les protocoles sont présentés qui font la biologie quantitative développement approches accessibles pour les non-experts. L'accent est mis sur trois outils straight-forward, librement disponibles qui sont mis en œuvre dans tout laboratoire qui a accès à la microscopie confocale et les ordinateurs standard. Ceux-ci comprennent un protocole pour générer des formes cellulaires 3D, un protocole à suivre restes de la division cellulaire, et un protocole pour décrire quantitativement la dynamique de actomyosine corticales. Le nématode C. elegans est utilisé comme un cas exemplaire, cependant, les méthodes et les outils présentés ici sont adaptés à une variété de questions dans d'autres modèles biologiques, par exemple, des cellules en culture, des explants de tissus, organoïdes ou sphéroïdes, les autres embryons, etc.

Généralement, certaines des analyses présentées ici peuvent également être effectuées avec l'outil open source ImageJ populaire (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; ou FIDJI, les «batteries inclus» version de ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) pour lequel de nombreux plugins pour des analyses quantitatives différentes sont disponibles. Cependant, les programmes discutés ici sont conçus pour résoudre les problèmes spécifiques.

Tout d'abord, IMOD, un traitement d'image, la modélisation et la suite de l'affichage peut être utilisé pour des reconstitutions en 3D de coupes en série de microscopie électronique ou la lumière 15. IMOD contient également des outils pour la visualisation des données 3D à partir d'une orientation quelconque. Deuxièmement, Endrov, un programme Java conçu pour effectuer l'analyse d'image, traitement de données, et l'annotation des réseaux ou des pistes (entre autres) sur la base d'une architecture de plugin prolongée, avec compatibilité plugin ImageJ 16. Il contient plus de 140 opérations de traitement d'image et une interface utilisateur extensible dans lequel le modèle et les données brutes sont affichés séparément. Son code source peut être trouvé à https://github.com/mahogny/Endrov. Troisièmement, PIVlab, un MAtlab outil de particules d'image numérique velocimetry qui permet à l'utilisateur d'analyser quantitativement et qualitativement les champs de flux de particules 17. L'utilisation de ce programmes nécessite une licence MATLAB qui comprend le Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab est un programme conçu pour décrire quantitativement flux. Il calcule la distribution de la vitesse, de l'ampleur, le tourbillon, la divergence, ou de cisaillement dans les paires d'images ou séries. Pour cela, il cross-corrélation de petites zones d'images (appelés 'passe' dans la section de protocole) d'une paire d'image pour dériver le déplacement de la particule la plus probable. Cette corrélation croisée donne une matrice de corrélation qui peut être analysé dans le domaine de l'espace ou de fréquence utilisant soit inter-corrélation directe ou une transformation de Fourier rapide (FFT), respectivement.

L'équipement utilisé ici est un microscope inversé équipé d'un Nipkow («spinning») disque, un EMCCD, 488 et 561 nm solide-normelasers, et 20x ou 40x ou air 60x / plan apochromat objectifs de pétrole ou de l'eau d'immersion. Cependant, il est également possible d'effectuer une imagerie time-lapse avec d'autres modalités d'imagerie, par exemple, Point-, ligne- ou la microscopie à balayage feuille à base de laser, la microscopie multi-photons, ainsi que la microscopie épifluorescence combiné avec déconvolution ou structurée éclairage. L'avantage d'utiliser un système de disque Nipkow est l'acquisition d'image extrêmement rapide, surtout si un mode de diffusion (mouvement et la numérisation de l'objet dans la dimension z continu) est disponible. En outre, pour améliorer la résolution, un agent d'allongement de 1,5 grossissant de pliage en face de la EMCCD peut être utilisé.

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Protocole

1. Préparation de C. elegans embryons pour Time-lapse microscopie utilisant des microbilles

  1. Transfert vers adultes gravides en utilisant un choix sans fin (fil de platine) dans une goutte de tampon M9 et nettoyer les bactéries en premier agitant vigoureusement et ensuite transférer chaque ver à une baisse adjacente de M9 utilisant un cil monté sur un / pointe de la pipette cure-dent ou utiliser un capillaire de verre pointu.
  2. Diluer la dispersion contenant 20 um billes diamètre de polystyrène de 10 fois dans du tampon M9 (1 tampon L M9 contenant 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, et, après l'autoclavage (20 min, 120 ° C), ajouter un 1 ml supplémentaires d'une solution à 1 M 4 MgSO).
  3. Faire une pipette de la bouche de tout type de mince capillaire en verre (par exemple, la fonte des capillaires ponctuelles ou capillaires utilisés pour tirer les aiguilles d'injection), un environ 0,5 m de long morceau de caoutchouc, silicone ou tubes en matériau similaire (idéalement transparent), un 200 pipointe de la pipette, le couvercle d'un tube de PCR de 200 pi, un filtre hydrophobe pour les petites seringues (par ex., un de 0,2 à 0,45 um taille des pores et 15-50 mm de diamètre Nylon, PTFE ou le filtre de matériau similaire) pointe, et une pipette de 1000 pi . Ce type de bouche pipette assure qu'aucun matériel biologique ne peut entrer en contact avec l'expérimentateur.
  4. Monter la pipette par l'insertion, la pointe de la pipette 200 ul de la première extrémité dans le tube et de le brancher avec le couvercle d'un tube de PCR qui présente une perforation centrale qui correspond au diamètre du capillaire utilisé. Une aiguille poinçon ou de la préparation très pointu peut être utilisé pour générer la perforation.
  5. Dessinez un capillaire mince et l'insérer dans la perforation. Insérez le filtre dans l'autre extrémité de la tubulure et d'insérer une pipette de 1000 pi que la bouche pièce (Figure 1).
  6. Disséquer adultes gravides en coupant vers transversalement à la vulve avec une lame de rasoir propre ou d'un scalpel.
    NOTE: Habituellement, de nombreux embryons seront expulsed après la coupe. Toutefois, si les embryons précoces sont nécessaires, ils ont parfois à être libéré de la carcasse à l'aide d'un cil ou une aiguille pointue.
  7. Pipette une goutte de la dispersion de perles de polystyrène dilué (~ 4 pi) sur un 24x60 mm couvercle en verre et d'embryons de transfert dans cette goutte en utilisant la bouche pipette.
  8. Placez délicatement un petit (par exemple, 18x18 ou 20x20 mm) couvrir verre sur le dessus de la goutte et assurez-vous que la baisse a pleinement étaler.
    NOTE: La baisse devrait également être suffisamment petit pour ne pas toucher les bords de la petite vitre de protection.
  9. Sceller la montagne avec de la vaseline liquéfié. Ajouter une goutte d'huile d'immersion sur le côté de la lamelle de 24x60 mm et passez à la section 'Time-lapse microscopie.

2. Préparation des adultes C. elegans animaux pour Time-lapse microscopie utilisant des nanobilles

NOTE: En général, le protocole pour le montage d'animaux adultes est une adaptation du protocole de réf. 18.Avec ce protocole, il est possible de réaliser à long terme Vidéomicroscopie confocale des animaux adultes.

  1. Préparer un 1,5% (p / v) de solution d'agarose dans du tampon M9, faire bouillir (1 min, 100 ° C au bain-marie ou micro-ondes). L'utilisation de concentrations plus élevées d'agarose est déconseillé car cela peut conduire à l'extrusion de l'intestin et / ou des parties de la gonade.
  2. Coller 2-3 couches de ruban adhésif sur deux lames de microscope chacun. Placez une diapositive sans bande entre les deux diapositives avec du ruban adhésif.
  3. Utiliser un embout de pipette et déposer une goutte de la solution d'agarose chaud dans le centre de la diapositive milieu. Placer rapidement une autre diapositive sur la goutte de sorte qu'il est soutenu par les couches de ruban de chaque côté. Cela va créer un rond et pad agar forfaitaire d'environ 10 mm de diamètre.
  4. Mettre une goutte de solution de talon 100 nm (non dilué, ce qui est 2,6% (p / v)) sur le tampon. Transfert 1-10 vers adultes nettoyés dans la goutte avec un pic de ver. Sceller avec 18x18 mm verre de couverture et de la vaseline comme expliqué dans Protocol 1.

3. microscopie time-lapse

  1. Mettre une goutte d'huile d'immersion sur la lame de microscope ou le sandwich de verre de couverture. Utilisez fond clair à faible grossissement (5x ou 10x lentilles) pour localiser l'échantillon.
    REMARQUE: Limiter l'exposition à la lumière bleue autant que possible (en particulier pour C. elegans embryons), par exemple, ne pas utiliser la microscopie épifluorescence pour trouver / concentrer l'échantillon, mais utiliser en fond clair à la place.
  2. Changer pour un plus fort grossissement (40x ou 60x objectifs), amener l'échantillon dans le foyer (soit plan central ou les plans haut / bas de l'échantillon, selon le logiciel d'acquisition).
  3. Définissez les intervalles d'échantillonnage à 30 avions à 1 um espacement enregistrés chaque 1min. Dans le cas d'une xy ou xyz stade automatisé est disponible, plusieurs points peuvent être enregistrées en une seule session. Passez à l'imagerie de fluorescence et de vérifier la mise à nouveau.
    REMARQUE: Essayez d'éviter d'utiliser de hautes puissances laser, utilisez plutôt un peu plus longs temps d'expositionà de très faibles intensités. Mesure images acquises immédiatement, soit dans le programme d'acquisition d'image ou dans ImageJ pour éviter la saturation, quelles cultures vont la dynamique et signifie également l'exposition excessive au rayonnement.
  4. Démarrez l'enregistrement de la série time-lapse.
    NOTE: Pour exclure l'analyse des artefacts, commencer avec des intervalles longs (3-10 min) de temps entre la numérisation de l'échantillon et augmenter progressivement échantillonnage temporel aux intervalles souhaités. Timing de développement ainsi que des points d'extrémité dans les deux cas doivent être similaires lors de l'exécution d'une analyse statistique. En outre, il est souvent nécessaire d'évaluer la phototoxicité et les taux de survie. Par conséquent, récupérer spécimen de la montagne après long terme Vidéomicroscopie et vérifier si elles continuent à se développer / live.

4. Reconstruire un modèle cellulaire de forme 3D avec IMOD

REMARQUE: Le logiciel IMOD est disponible à partir de la page Web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. L'installation du logiciel est décritD il. Si vous utilisez Windows OS, une boîte à outils Unix doit être installé, qui peut également être trouvé comme un paquet sur la page Web IMOD. En outre, il ya une introduction 3dmod excellemment compilé disponible sur la page Web IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).

  1. Ouvrez le shell Unix et tapez "imod". La fenêtre IMOD ouvrira. Sélectionnez le fichier avec les données brutes (idéalement un TIF empilés ou similaires) qui permet de produire un modèle 3D.
  2. Localisez le bas et le haut des objets dans la fenêtre ZaP en utilisant la fenêtre d'information (de haut en bas outil de défilement).
  3. Commencer à tracer les contours de cellules. Surtout, veiller à ce que chaque cellule est un objet. Commencez avec le plan supérieur de chaque cellule et de créer le premier contour de là en utilisant la fenêtre d'information. Faites défiler z et de créer un nouveau contour pour chaque plan z.
  4. Faites de même pour autant de cellules que nécessaire pour modéliser en 3D. Ne pas oublier de créer un nouvel objet lors du démarrage d'une nouvelle cellule.
    NOTE: Il ya beaucoup de façons différentes pour le traçage de contour et plusieurs plugins utiles. S'il vous plaît visitez la page Web IMOD et tutoriels en ligne pour plus de détails. Dans le cas représenté ici, le réglage par défaut a été utilisé.
  5. Ouvrez le "Model View" fenêtre d'inspecter les objets et leurs contours.
  6. Dans le "Model View" barre d'outils Choisissez "Editer" - "Objets". La fenêtre d'édition respective ouvre.
  7. Pour modéliser les cellules comme des objets remplis et fermés, choisissez "Mesh" comme "Dessiner Type de données" et de "remplissage" comme "style de dessin". Cliquez sur "Maillage" dans la sélection de défilement en bas à gauche de la fenêtre. Cochez l'option "Cap" dans la sélection en bas à droite. Vérifiez autant d'objets que nécessaire et cliquez sur "Mesh tous». Le programme va générer des objets solides des piles de contours. Le facteur z-échantillonnage peut être ajustée en changeant "Z-échelle" dans la fenêtre "View".
  8. Déplacer / tourner la objec 3Dt ("Edit" - "Affichage") et enregistrer des instantanés ou des films ("Fichier" - "Aligner Tiff sous ..." ou "Film / Montage").

5. Suivi par fluorescence Structures marqué avec Endrov

NOTE: Pour suivre les restes de la division cellulaire, utiliser une souche avec un marqueur de membrane nucléaire ou de plasma pour l'identification de cellule (par exemple, H2B, PH-PLC-d1) et un marqueur reste de la division cellulaire (par exemple, NMY-2, ZEN-4 ). Le marqueur de membrane nucléaire ou le plasma est important de déterminer quelle cellule hérite le reste de la division cellulaire.

  1. Pour le chargement rapide et la facilité d'utilisation, les données brutes doit être converti en un fichier TIFF (par exemple, dans ImageJ). Ensuite, ouverte Endrov et charger le fichier à analyser en choisissant l'option "Load File" dans le menu fichier. Cliquez sur l'icône "de la visionneuse 2D" sur la barre d'outils.
  2. Réglez l'histogramme en cliquant sur l'icône "gamme Fit" (l'icône bleue au coin inférieur droitde l'écran Endrov). Réglez le XYZ-résolution en allant à "Données" - "nom de fichier" - "ImageSet" - "Channel" - "Set XYZ-résolution". Tapez des valeurs pour X, Y et Z, par exemple, 5, 5, 1 si la résolution X et Y est de 0,2 um et d'échantillonner chaque 1 um dans Z.
  3. Pour annoter les noyaux, déplacer au plan de l'intérêt et cliquez sur "spectateur 2D". Sélectionnez "Lineage" dans le menu déroulant et choisissez "Nouveau lignée".
  4. En cliquant et en faisant glisser sur le noyau, il peut être marqué. Pour nommer le noyau, cliquez droit et choisissez "Renommer particules" dans le menu déroulant. Pour augmenter ou diminuer le diamètre du cercle, faites glisser l'icône de flèche qui apparaît sur la gauche du cercle marqué. Pour marquer le plan central du noyau, cliquez sur l'icône à droite. Lors de l'utilisation d'un marqueur de la membrane plasmique, une grande sphère peut être tirée qui couvre la majeure partie de la cellule.
  5. Pour poursuivre dans le temps et l'avion, choisir le "Frame" et "Z"options à la barre d'outils en bas. Après être allé à la prochaine point de temps, ajuster la position ou la taille du cercle qui marque le noyau en conséquence. Répétez jusqu'à ce que la cellule se divise suivis.
  6. Quand il ya une division cellulaire, marquer les noyaux filles et passer à "spectateur de Lineage". Cela peut être sélectionné en cliquant sur l'icône "Windows" sur la barre d'outils supérieure. Marquez tous les trois noyaux simultanément, aller à l'option "Lineage" dans la barre d'outils supérieure et sélectionnez "parent associé".
  7. Lorsque le suivi de la cellule est terminée, passer à la cérémonie marquant le reste de la division cellulaire pour le suivi canal. Pour changer de chaîne, cliquez sur le nom du fichier dans le coin inférieur gauche de la barre d'outils. Le reste de la division cellulaire (ou toute autre structure) peuvent être suivies comme décrit ci-dessus pour le noyau.
  8. Lors du retour au logiciel après la fermeture, il est nécessaire d'aller à "2D Viewer" - "Lineage" - "Modifier" et de cliquer sur le numéro de la lignée qui sera édité.

6. Analyse corticale actomyosine débit avec PIVlab

REMARQUE: PIVlab est un logiciel disponible gratuitement sur: http://pivlab.blogspot.de/; il peut être invoqué à partir de l'environnement de ligne de commande en tapant PIVlab_GUI Matlab. Lorsque vous travaillez avec PIVlab, il est recommandé de sauvegarder la série d'images dans un dossier distinct.

  1. Démarrez une nouvelle session dans le menu "Fichier". Chargez les fichiers image en cliquant sur le bouton «Charger les images".
  2. Sélectionnez le style de séquençage 1-2, 2-3, ... et accédez au répertoire qui contient la séquence d'images souhaitées. Sélectionnez les images et cliquez sur le bouton "Ajouter" et l'importation.
  3. Allez dans "Paramètres" Analyses et sélectionnez «Exclusions (ROI, masque)". Alternativement, appuyez sur "Ctrl + E". Utilisez le bouton "Dessiner masque (s) pour la trame courante" pour inactiver la partie indésirable de l'image / s (c.-à-région en dehors embryon).
  4. Sélectionnez "Paramètres de PIV" from le menu "paramètres Analyses". Alternativement, appuyez sur "Ctrl + S". Choisir "fenêtre FFT déformation" en tant que l'algorithme de PIV souhaitée.
    REMARQUE: transformation de Fourier rapide (FFT) réduit le coût de calcul, mais est seulement recommandé le signal est bien au-dessus du bruit et si le déplacement des particules étudiées ne dépasse pas la moitié de la zone de passage analysé (voir 6.5).
  5. Entrez les valeurs suivantes pour les trois passages, qui sont la zone d'interrogation croisée d'intensité corrélation entre les images suivantes: Pass 1: Interrogation superficie de 64 pixels avec un pas de 32. Col 2: Interrogation superficie de 32 pixels avec un pas de 16 . Sélectionnez "linéaire" de la déformation de la fenêtre dans le menu déroulant. Choisissez la méthode de Gauss 2 * 3 points pour les sous-pixel déplacement estimation.
  6. Sélectionnez "Analyser!" à partir du menu Analyse et utiliser le bouton "Analyser tous les cadres" pour commencer une analyse.
  7. Pour le post-traitement sélectionnez "validation de Vector" de "; Traitement après menu "et régler la déviation standard (Stdev) seuil de filtre à 7 et d'appliquer à tous les cadres.
  8. Choisissez "dériver les paramètres / modifier les données" du menu "Plot". Sélectionnez "vecteurs [px / frame]" dans le menu déroulant. Réglez la finesse de vecteurs et de filtre passe-haut et d'appliquer à tous les cadres.
  9. Pour calculer des vecteurs moyennes de tous les cadres, définir les «cadres d'occasion" à 1: fin et cliquez sur le bouton «Calculer vecteurs moyens".

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Résultats

En utilisant les protocoles 2, 3, et 4, imagerie time-lapse de gonades dans sauvage de type C. elegans adultes est effectuée (souche OD58 (unc-119 (ed3) III; ltIs38 [pAA1; Pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), exprimant un marqueur de la membrane d'un promoteur de la lignée germinale ). En se concentrant sur ​​le tour de la gonade, un modèle 3D de cellules germinales est généré à partir des données de microscopie (figure 2). Ce modèle permet d'analyser l'évolution de la t...

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Discussion

Grâce objet de suivi dans le développement, dans le suivi nucléaire particulier, il a été possible d'élucider les mécanismes de formation de motifs centraux de C. elegans embryogenèse 1,23,24. Élargir cette stratégie à un débit plus élevé, il a été récemment possible de découvrir les règles de structuration supplémentaires et de proposer une méthode comment déduire structuration règles de novo 10. Pour de nombreux mutants, cependant, les défauts de mise en forme préci...

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Déclarations de divulgation

La recherche dans le laboratoire de CP est financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115 ; FOR 1756) et le groupe de recherche LOEWE Ubiquitin Networks. Le Programme d’action communautaire est également soutenu par le programme-cadre 7 de l’Union européenne (Projet d’actions Marie Curie 326632).

Remerciements

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
StéréomicroscopeMotic/VWROT4005SStéréomicroscope pour la dissection et le montage
de microsphères de polybille de polystyrène,  ;Polysciences18329Montage d’embryons
20 & micro ; m
Microsphères de polystyrène polybilé,  ;Polysciences876Montage d’animaux adultes
0.1 & micro ; m
Lames de microscopeVWR631-0902Montage d’animaux adultes
Verre de couverture 18x18 mmVWR631-1331Montage d’embryons/adultes
Verre de couverture 24x60 mmVWR631-1339Montage d’embryons
ScalpelVWR233-5455Dissection d’embryons
Tube en siliconeVWR228-1501Tube pour pipette buccale
Filtre à membrane PTFE 30 mmNeoLabJul-01Filtre pour pipette buccale
Tubes capillairesVWR621-0003Pointe de pipette pour pipette buccale
VaselineRoth E746.1Montage embryonnaire/adulte
AgarRoth5210.5Montage animal adulte
Potassium-di-hydrogénphosphateRothP018.2Tampon M9
Phosphate de disodium et d’hydrogèneRothP030.2Tampon M9
Chlorure de sodiumRoth3957.1Tampon M9
VisiScope Spinning Disc Système confocalVisitron Systemsn/aMicroscopie confocale

Références

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