Suivi et quantification des processus de développement des C. elegans Utilisation des outils open-source

Summary

Ici, on montre comment suivre et quantifier les processus de développement chez C. elegans. Les méthodes présentées sont basées sur des outils open-source qui peuvent être facilement mis en œuvre. Il est démontré comment reconstruire des modèles de forme cellulaire 3D, comment suivre manuellement les structures subcellulaires et comment analyser le flux contractile cortical.

Abstract

Capturant quantitativement les processus de développement est cruciale pour obtenir des modèles mécanistes et clé pour identifier et décrire les phénotypes de mutants. Voici protocoles sont présentés pour la préparation des embryons et des adultes de C. elegans pour animaux à court et à long terme Vidéomicroscopie et des méthodes pour le suivi et la quantification des processus de développement. Les méthodes présentées sont toutes basées sur C. souches elegans disponibles à partir du Centre de Génétique et de Caenorhabditis sur les logiciels open-source qui peuvent être facilement mises en œuvre dans tout laboratoire indépendamment du système de microscopie utilisée. Une reconstruction d'un modèle cellulaire-forme 3D utilisant le IMOD logiciel de modélisation, suivi manuel des structures sous-cellulaires marqués par fluorescence à l'aide du multi-usages programme d'analyse d'image Endrov, et une analyse des flux contractile corticale en utilisant PIVlab (Time-Resolved numérique Particle Image Velocimetry Outil pour MATLAB) sont présentés. Il est discuté comment ces méthodes peuvent également être déployés to capturer quantitativement autres processus de développement des différents modèles, par exemple, le suivi de la lignée cellulaire et le traçage, le suivi des flux de vésicule.

Introduction

Avec les améliorations constantes des protéines fluorescentes, l'ingénierie des génomes, la microscopie optique et ciels et de matériel informatique, il est désormais possible d'enregistrer développement de nombreux organismes modèles à une résolution spatio-temporelle sans précédent. Cela permet aux chercheurs de poser des questions qui ne pouvaient pas être traitées antérieurement ou de revoir les processus de développement connues afin de chercher des aspects négligés. Ce progrès a suscité le domaine de la biologie du développement quantitatif, qui vise à transformer les modèles qualitatifs, informelles dans des modèles quantitatifs par des mesures approfo....

Protocol

1. Préparation de C. elegans embryons pour Time-lapse microscopie utilisant des microbilles

1. Transfert vers adultes gravides en utilisant un choix sans fin (fil de platine) dans une goutte de tampon M9 et nettoyer les bactéries en premier agitant vigoureusement et ensuite transférer chaque ver à une baisse adjacente de M9 utilisant un cil monté sur un / pointe de la pipette cure-dent ou utiliser un capillaire de verre pointu.
2. Diluer la dispersion contenant 20 um billes diamètre de polystyrène de 10 fois dans du tampon M9 (1 tampon L M9 contenant 3 g de KH _{2 PO} 4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl, ....

Results

En utilisant les protocoles 2, 3, et 4, imagerie time-lapse de gonades dans sauvage de type C. elegans adultes est effectuée (souche OD58 (unc-119 (ed3) III; ltIs38 [pAA1; Pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), exprimant un marqueur de la membrane d'un promoteur de la lignée germinale ). En se concentrant sur ​​le tour de la gonade, un modèle 3D de cellules germinales est généré à partir des données de microscopie (figure 2). Ce modèle permet d'analyser l'évolution de la taille des ce.......

Discussion

Grâce objet de suivi dans le développement, dans le suivi nucléaire particulier, il a été possible d'élucider les mécanismes de formation de motifs centraux de C. elegans embryogenèse ^1,23,24. Élargir cette stratégie à un débit plus élevé, il a été récemment possible de découvrir les règles de structuration supplémentaires et de proposer une méthode comment déduire structuration règles de novo ^10. Pour de nombreux mutants, cependant, les défauts de mise en forme préci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stéréomicroscope	Motic/VWR	OT4005S	Stéréomicroscope pour la dissection et le montage
de microsphères de polybille de polystyrène,  ;	Polysciences	18329	Montage d’embryons
20 & micro ; m
Microsphères de polystyrène polybilé,  ;	Polysciences	876	Montage d’animaux adultes
0.1 & micro ; m
Lames de microscope	VWR	631-0902	Montage d’animaux adultes
Verre de couverture 18x18 mm	VWR	631-1331	Montage d’embryons/adultes
Verre de couverture 24x60 mm	VWR	631-1339	Montage d’embryons
Scalpel	VWR	233-5455	Dissection d’embryons
Tube en silicone	VWR	228-1501	Tube pour pipette buccale
Filtre à membrane PTFE 30 mm	NeoLab	Jul-01	Filtre pour pipette buccale
Tubes capillaires	VWR	621-0003	Pointe de pipette pour pipette buccale
Vaseline		Roth E746.1	Montage embryonnaire/adulte
Agar	Roth	5210.5	Montage animal adulte
Potassium-di-hydrogénphosphate	Roth	P018.2	Tampon M9
Phosphate de disodium et d’hydrogène	Roth	P030.2	Tampon M9
Chlorure de sodium	Roth	3957.1	Tampon M9
VisiScope Spinning Disc Système confocal	Visitron Systems	n/a	Microscopie confocale