Article de méthode

Quantifier Poisson Natation Comportement en réponse à une exposition aiguë de cuivre aqueux assistées par ordinateur et vidéo numérique Analyse d'image

DOI :

10.3791/53477

⸱

26 février 2016

 ,  ,  ,  , 
1Columbia Environmental Research Center, US Geological Survey, 2US Geological Survey

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesurer les impacts des contaminants environnementaux sur le comportement des poissons est souvent subjective et stimulant notamment lorsqu'ils traitent avec paramètres sublétaux. Nous décrivons les méthodes , y compris la technologie vidéo pour quantifier le comportement de nage de la vie stade précoce de l' esturgeon blanc (Acipenser transmontanus) pendant et après 96 h une exposition aiguë à diverses concentrations de cuivre.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les réponses comportementales des organismes aquatiques aux contaminants environnementaux peuvent être des précurseurs d’autres effets tels que la survie, la croissance ou la reproduction. Cependant, ces réponses peuvent être subtiles et la mesure peut être difficile. À l’aide d’esturgeons blancs juvéniles (Acipenser transmontanus) exposés au cuivre, cet article illustre les techniques utilisées pour quantifier les réponses comportementales à l’aide de vidéos assistées par ordinateur et d’analyses d’images numériques. Dans des études antérieures, de graves altérations du comportement natatoire ont été observées chez les esturgeons blancs aux premiers stades de leur vie lors d’expositions aiguës et chroniques au cuivre. Le comportement de l’esturgeon était rapidement altéré et, au point que la survie sur le terrain était compromise, car les poissons étaient emportés en aval ou facilement capturés par les prédateurs. Les objectifs de cette étude étaient d’illustrer les protocoles permettant de quantifier l’activité de nage au cours d’une série d’expositions aiguës au cuivre afin de déterminer le temps nécessaire pour agir au cours des premiers stades du développement et de comprendre l’importance de ces réponses par rapport à la survie de ces poissons vulnérables aux premiers stades de leur vie. La mortalité étant sur un continuum temporel, déterminer quand le cuivre affecte pour la première fois la capacité de nage nous aide à comprendre les implications sur les effets au niveau de la population. Les techniques utilisées sont facilement adaptables aux plans d’expériences avec d’autres organismes et facteurs de stress.

Introduction

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Comprendre comment l'exposition aux contaminants peut affecter le comportement est parfois très difficile et subjective. Le comportement est généralement défini comme une série d'activités, l'ensemble du corps observables manifestes qui opèrent à travers le système nerveux central et permettent à un organisme de survivre, se développer et se reproduire. Les changements de comportement dus à l' exposition à une substance toxique sont parmi les indicateurs les plus sensibles du stress environnemental souvent entre 10-100 fois plus sensible par rapport à la survie 1. La majorité de ces études ont examiné l' activité de natation, la ventilation et le comportement alimentaire des poissons 2,3,4. Piscine activité est sublétale critère le plus fréquemment utilisé dans la détermination d' un changement de comportement en réponse à un contaminant dans les tests de toxicité 5. les variables de natation incluent la fréquence et la durée du mouvement, la vitesse et la distance parcourue, la fréquence et l'angle de tours, la position dans la colonne d'eau et le motif de la natation. activité de natation estune mesure efficace de comportement de nage pour évaluer la sensibilité à une substance toxique sur la base des critères proposés dans le chapitre 9 par Rand 6 dans les Principes comptables de toxicologie aquatique.

Cet article présente une étude toxicologique comme un exemple de la façon dont la toxicité du cuivre jusqu'au début du stade de vie de l' esturgeon blanc (Acipenser transmontanus) à différents stades de développement précoce dans l' eau uniquement les expositions par rapport à l' esturgeon comportement de nage a été évalué et illustre les méthodes de quantification de la natation comportement.

Dans des études précédentes, les réponses comportementales indésirables étaient évidents avec l' apparition précoce au cours des premiers jours de l' exposition aiguë et chronique au cuivre et sont devenus de plus en plus sévère sur la durée d'exposition et la concentration 7,8,9. L'ampleur et le moment de l'apparition de ces réponses comportementales sont probablement suffisantes pour limiter la survie à long terme et sont donc préoccupants étant donné les implications pour recruiéchec timent 10. Afin d'interpréter correctement la signification de cette sensibilité aux méthodes et procédures d'exposition métalliques ont été mis au point pour quantifier le cours du temps et de l'étendue des troubles de comportement par rapport aux concentrations de cuivre.

protocoles d'essai pour la fonction du comportement et du développement ont été établis en analysant des échantillons vidéo généraux de l'esturgeon dans des chambres d'exposition. Les échantillons vidéo fournis évaluation qualitative du développement et de la fonction entre les traitements de cuivre pendant toute la période d'exposition. Comportement et abri recherche de l'activité ont été évalués au cours de l'exposition à des concentrations de cuivre aqueux pour déterminer le temps d'effectuer et de caractériser la séquence temporelle de la déficience qui affecte un abri recherche, la léthargie, la natation coordination, l'équilibre et la respiration. En outre, les enregistrements vidéo ont été faites de l'esturgeon sous-échantillonné de chaque répétition dans le but de documenter quantitativement la natation acti spontanéetivité. Ces critères d' évaluation comprenaient des mesures de durée ou le temps passé en mouvement, la natation vitesse et la distance parcourue 5,11 en utilisant un logiciel d'analyse d'image numérique disponible dans le commerce. Ce logiciel définit le contour de chaque image à l'intérieur d'un champ de vision et de cela, définit le centre de gravité de chaque image. Le logiciel peut alors suivre la position de chaque centroïde dans un cadre par succession de trame pour déterminer les trajectoires de déplacement.

Cette étude satisfait à toutes les sections applicables des Règles finales des règlements de la Loi la protection des animaux (9 CFR) et avec toutes les directives institutionnelles pour le traitement humain des organismes d'essai au cours de la culture et de l'expérimentation. En cas de résiliation de l'étude, tous les poissons ont été euthanasiés selon des directives appropriées approuvées par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle animale pour l'US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.

Protocole

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1. Diluter d'installation pour larvaire Sturgeon L'exposition à des concentrations aqueuses de cuivre

  1. Mettre en place des expositions en utilisant un système d'écoulement tels qu'un système 12 de dilution et le mont Brungs modifié suivant les directives de la ASTM International 13,14,15.
  2. Sélectionnez 25 ug / L la concentration élevée de cuivre en fonction des résultats des tests précédents où les effets ont été observés autour de 4-6 ug / L. Utilisez qualité réactif cuivre II pentahydraté sulfate (> 98% de pureté) et mélanger une solution test de stock.
    NOTE: Exemple série de concentration pour les expositions sont 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,0625 et 0 mg / L. En utilisant 50% des dilutions en série à partir de 25 ug / L la concentration élevée ciblera une gamme de concentrations observées pour entraîner une altération du comportement.
  3. Préparer la solution test disponible dans une fiole jaugée de 48 heures avant le début de l'exposition et réglé pour fournir à pic la chambre de mélange de dilution en utilisant unautomatisé distributeur de seringue.
  4. Utiliser un modèle de feuille de calcul pour déterminer le poids du produit chimique à ajouter à 1 L d'eau déminéralisée qui se traduira par 25 ug / L de concentration de cuivre, lorsque diluter chambre de mélange est ensemencé avec 1 ml de la solution test de stock.
    REMARQUE: La figure 1 représente un exemple d'un modèle de feuille de calcul pour la préparation des stocks chimiques pour les tests de toxicité de dilution.
  5. Peser 195 mg de cuivre de qualité réactif II pentahydrate sulfate en utilisant une balance analytique et verser dans un 1 L fiole jaugée et mélanger avec 1 L d'eau déminéralisée pour une concentration stock de 48,65 mg / L.
  6. Placer le tube d'admission du distributeur de seringue automatisée dans la solution test de stock et régler le volume de pic à 1 ml et tourner le dilueur sur en basculant l'interrupteur d'alimentation et laisser le cycle pendant 48 heures le laisser se stabiliser à la concentration de cuivre correspondante avant le stockage esturgeon.
  7. Fixer une ligne en flux séparateur 4 voies 16 à chaque ligne de livraison pour partitionner le débit d'eau à chacune des quatre chambres d'exposition répétées dans le bain d'eau de dilution. Gravité nourrir l'eau. Cycle de l'eau à travers le dilueur lorsque l'alimentation du diluteur sous tension et une électrovanne est ouverte permettant à l'eau de couler dans les cuves de dilution. Réglez l'unité de refroidissement à 15 ° C et tourner sur la pompe à eau pour faire circuler l'eau dans le bain d'eau de dilution.
    NOTE: Ce processus est régi par l'utilisation d'une minuterie automatique.
  8. Réglez le dilueur pour faire défiler toutes les 30 minutes en utilisant la minuterie automatique et pour fournir 250 ml d'eau de test avec chaque cycle, ce qui entraîne 12 additions de volume par jour à chaque répétition chambre d'essai.
  9. Sélectionnez des chambres d'essai d'exposition en fonction de la taille de l'esturgeon pour maintenir le taux acceptable de chargement qui est 2 pots en verre avec un trou de 4 cm sur le côté. Couvrir ce côté avec un écran en acier inoxydable de maille de 30 microns pour permettre l'écoulement à travers de l'eau d'essai. Le volume d'eau d'essai dans les bocaux d'exposition est de 1 L.
  10. En utilisant une seringue en plastique de 50 ml prendre deux réplicats échantillons de 50 ml d'eau à chaque concentration pour un total de 12 échantillons et distribuer de l'eau d'essai dans 100 béchers ml de verre et de mesurer l'oxygène dissous (DO), température, conductivité, pH, alcalinité, la dureté, totale l'ammoniac, les principaux cations, des anions et de carbone organique dissous en utilisant un équipement commercial standard et suivez les instructions du fabricant.
    NOTE: Les échantillons doivent être prélevés à l'initiation et à la fin de l' exposition.
  11. Pour recueillir des sous-échantillons pour l'analyse chimique, utiliser une seringue en plastique de 25 ml, établir environ 24 ml d'eau de test à partir des chambres d'exposition à l'aide d'une paille de sipper fixée à la seringue au lieu d'une aiguille.
  12. Retirez la paille de sipper du syringe et placer un boîtier de cartouche de filtre de 0,45 um de polypropylene d'une taille des pores, la membrane de polyéthersulfone de la seringue en plastique.
  13. Appuyez sur 4 ml d'eau d'essai à travers le filtre et d'en disposer.
  14. Distribuer les 20 ml restants de l'eau d'essai à travers le filtre dans une bouteille en polyéthylène acide nettoyé et acidifier à 1% en volume / volume avec de haute pureté, 16 M d'acide nitrique pour le stockage d'un maximum de 3 mois.
    NOTE: Les échantillons pour analyse chimique doivent être prises lors de l'initiation, au milieu et à la fin de l' exposition pour confirmer les concentrations de cuivre.
  15. Effectuer une analyse chimique à l' aide à couplage inductif spectrométrie de masse à plasma suivant US Environmental Protection Agency Méthode 6020A 17
  16. Après avoir pris tous les échantillons d'eau et la dilution est le vélo, stock 10 (, au hasard aléatoire) esturgeons dans chaque répétition chambre d'essai. Collecter l'esturgeon de la cuve de culture où ils sont logés à l'aide d'un filet non-abrasive à petites mailles. Placez l'esturgeon dans un petit Bucket avec de l'eau de culture. Un total de 240 poissons sont nécessaires pour commencer l'exposition.
  17. Ne pas nourrir les poissons pendant l'exposition.
    NOTE: S'il vous plaît se référer à la figure 1 pour une configuration visuelle de la mise en page de dilution.
  18. Lire le test chaque jour pendant la durée de la mortalité de l'exposition et les poissons d'enregistrement et de surveiller la natation comportement.
    NOTE: Les autres critères à rechercher comprennent la léthargie, perte d'équilibre, des changements dans la respiration, les changements dans la pigmentation, les poissons de position sont dans la colonne d'eau, cachant l' activité et d'autres anomalies qui peuvent être identifiés visuellement.
    REMARQUE: Lire le test en même temps chaque jour pour la cohérence.
  19. Mesurer et de quantifier l'activité de natation (poissons temps passé en mouvement, la vitesse et la distance de déplacement) à l'aide d'un logiciel de suivi de piste numérique disponible dans le commerce.

2. Observations et Comtes de mortalité pendant l'exposition

  1. Inspecter visuellement chaque ch d'essaiambre et de la mortalité et des observations de comportement anormal en utilisant une liste de contrôle du comportement (tableau 1) sur les fiches à peu près à la même heure chaque jour pendant l'exposition 96 h, de préférence le matin note.
    NOTE: Comportements qui sont étonnamment, inhabituellement, subjectivement, qualitativement différent des contrôles sont considérés comme anormaux. Idéalement l'observateur ne connaît pas les traitements.
    NOTE: La perte d'équilibre est définie comme l'incapacité de poissons pour maintenir une position verticale dans la colonne d'eau et l' immobilité est définie comme l'incapacité de poissons à se déplacer ou nager à moins poussé. D'autres anomalies telles que la léthargie, l'hyperactivité, les augmentations ou diminutions de la respiration, des changements de couleur, des tremblements, des spasmes, des abdomens gonflés, la position dans la colonne d'eau et tous les autres modèles de natation inhabituels devraient également être enregistrées sur la feuille de données.
    REMARQUE: Se reporter à la vidéo 1 pour des exemples d'anomaliescomportement.
  2. Enregistrer et supprimer l'esturgeon morts par jour.
  3. En utilisant une main tendue d' oxygène dissous (DO) mètre avec sonde mesurer l'oxygène dissous in situ et enregistrer la température de l' eau dans deux répétitions de chaque concentration d'exposition et enregistrer sur la feuille de données.

3. L'enregistrement vidéo Natation Activité

  1. Capture des échantillons de données vidéo à l'aide d'une caméra vidéo portative montés sur un trépied placé directement au-dessus de la chambre d'essai pour documenter des anomalies comportementales.
  2. Pour quantifier l' activité de la natation, couper un morceau de PVC 13 de tuyauterie cm de diamètre et 13 cm de hauteur à utiliser comme l'arène de test (Figure 1). Placez le tuyau en PVC dans le dilueur au sein de chaque réservoir d'exposition de concentration de cuivre correspondant. Utilisez la zone à l'intérieur du tuyau en PVC que l'arène de test, car cela est assez grand pour l'esturgeon nager librement.
  3. A la fin de l'exposition à 96 h, sous-échantillonner au hasard 5 survivants esturgeons de chaque Concentratio de cuivren pour mesurer l'activité de la natation et les placer dans l'arène de test en utilisant un petit filet à mailles.
    NOTE: Dans les concentrations d'essai plus élevées où la mortalité de l' esturgeon était répandue, tout esturgeon survivant restant doit être utilisé pour mesurer l' activité de la natation et dans certains cas , peut être inférieure à 5.
  4. Après avoir placé le poisson dans l'arène de test, permet au poisson de s'acclimater pendant une période de 30 min.
    NOTE: Le succès, sans erreur d' analyse de la vidéo nécessite une image de contraste élevé du poisson sur un fond avec un minimum de structure qui pourrait obscurcir ou masquer l'image du poisson. L'image du poisson doit être en bonne mise au point et doit être exempt de reflets de surface ou exempt de distorsions dues à l'eau en mouvement de sorte que le système de dilution doit être désactivé.
  5. Au bout de 30 min, tourner la caméra vidéo et réglé sur REC pour enregistrer l'activité de natation pour une période de 2 min.
  6. Euthanasier le poisson après avoir pris les enregistrements vidéo pour déterminer êtreportement.
  7. Placez l'esturgeon dans une solution concentrée de tricaïne méthanesulfonate (MS222) de l'eau pendant au moins 10 min pour permettre l'arrêt du mouvement des opercules.
    NOTE: Une concentration d'au moins 250 mg / L est recommandée et pourrait être beaucoup plus élevé pour certaines espèces.
  8. Placez l'esturgeon euthanasiés dans un sac à fermeture zip plastique et placer au congélateur pour l'élimination à une date ultérieure. Tournez la caméra vidéo OFF et transférer tous les fichiers vidéo à un ordinateur pour le post-traitement en utilisant un logiciel de suivi numérique.

4. Mesures de natation Activité de lecture vidéo

  1. Recherchez les fichiers de données de la feuille de données et vidéo pour l'expérience à analyser. Convertir des fichiers vidéo à un format compatible le logiciel d'analyse numérique peut gérer.
  2. Soumettre tous les fichiers à traiter dans le logiciel. Ouvrez le logiciel de suivi en cliquant sur l'icône. Cliquez sur "l'expérience New par défaut" dans le "Créer une nouvelle expérience" option sur l'écran principal.
  3. Entrez le nom pour l'expérience dans la boîte de dialogue "Experiment New" qui apparaît à l'écran. Choisir le fichier de l'expérience de l'emplacement doit être enregistré. Cliquez sur "OK". Choisissez "Paramètres Experiment" option sous "Setup" .Choisissez "À partir du fichier vidéo" sous "Video Source".
  4. Sélectionnez "1" pour "Nombre d'arènes". Sélectionnez "3" pour "Nombre de sujets par arène". Sélectionnez "Détection Centre point" sous "Caractéristiques chenilles". Sélectionnez les unités souhaitées.
  5. Sélectionnez l'option "Liste d'essai" sous "Setup". Cliquez sur "Ajouter des vidéos" en haut de l'écran. Choisissez "ordre alphabétique" sous option "Ordre de tri" sur "Ajouter des vidéos" boîte de dialogue qui apparaît à l'écran. Cliquez sur "Parcourir". Accédez au dossier où se trouvent les fichiers vidéo.
  6. Mettez en surbrillance tous les fichiers vidéo. Cliquez sur "Ouvrir". Cliquez sur "Ajouter une variable" en haut de l'écran. Entrez "Concentration" dans ""Boîte. Entrez" Label de concentration de cuivre en microgrammes / L "dans" zone Description ".
  7. Choisissez "numérique" dans la liste déroulante "Type". Cliquez sur la boîte «Valeurs prédéfinies». Choisissez "Définir les valeurs individuelles" dans le "Prédéfinir des valeurs numériques" boîte de dialogue qui apparaît.
  8. Entrez "0", "3", "6", "13", "25" et "50" dans l'espace "Predefined Value". Cliquez sur "Ajouter >>" entre chaque addition de nombre. Décochez «Autoriser d'autres valeurs" option. Cliquez sur "OK".
  9. Choisissez "Trial" de menu déroulant dans la case "Scope". Entrez concentration appropriée pour chaque essai dans des boîtes prévues. Cliquez sur "Ajouter une variable" en haut de l'écran. Entrez "Répliquer" dans la boîte "Label". Entrez "Répliquer numéro" dans la boîte "Description". Choisissez "numérique" dans la liste déroulante "Type".
  10. Cliquez sur "PLes valeurs redéfinies "boîte. Choisissez" Définir les valeurs individuelles "option dans le" Prédéfinir des valeurs numériques "boîte de dialogue. Entrez" 1 "," 2 "," 3 "et" 4 "dans" Predefined Value "espace. Cliquez sur" Ajouter >> "entre chaque addition de nombre. Décochez la case" Autoriser les autres valeurs "option.Click" OK ".
  11. Choisissez "Trial" de menu déroulant dans la case "Scope". Entrez le numéro de répétition approprié pour chaque essai dans des boîtes prévues. Choisissez "Paramètres Arena" sous l'onglet "Configuration" en haut de l'écran. Nom premier réglage "Trial 1". Cliquez sur l'option "Grab Image de fond" de "(1 essai) Paramètres Arena" boîte de dialogue.
  12. Cliquez sur "Parcourir" dans la boîte de dialogue "Grab Image de fond". Localisez le fichier vidéo pour l'essai 1 et cliquez sur «Ouvrir». Cliquez sur l'option "Grab" dans la boîte de dialogue "Grab Image de fond" après la vidéo apparaît. Cliquez sur le cercle icône blanche près haut de l'écran under "Paramètres Arena".
  13. Manipuler cercle qui apparaît de telle sorte que toute la zone de baignade est enfermé dans le cercle. hachures apparaissent lorsque la zone d'arène est définie. Cliquez sur l'icône "Scale Calibration" près haut de l'écran sous "Paramètres Arena". Clic gauche sur un bord de l'aréna. Tenez et faites glisser la souris sur extrémité opposée de l'aréna. Relâchez le clic gauche.
  14. Entrez "10.5" dans la boîte "à distance dans le monde réel" dans la boîte de dialogue "Calibration Distance" qui apparaît. Cliquez sur "OK". Si nécessaire, ajuster la ligne d'étalonnage afin qu'il couvre tout le diamètre de la scène circulaire.
  15. Cliquez sur l'option "Paramètres Arena Valider" sur "Paramètres Arena (Essai 1)" boîte de dialogue. Adresse tous les problèmes si les paramètres ne sont pas validés. clic droit "Paramètres Arena" sous option "Setup" de la barre d'outils "Experiment Explorer" sur la gauche de l'écran et choisissez "Nouveau" dans le menu.
  16. Répétez les étapes jusqu'à ce que 4,11 à 4,15 arena paramètres have été créé pour chaque essai. Assurez-vous de choisir le fichier vidéo approprié pour chaque essai. Choisissez "Paramètres de détection" sous option "Configuration" de la barre d'outils "Experiment Explorer" sur la gauche de l'écran.
  17. Choisissez "Dynamic Soustraction" dans le menu déroulant sous "Méthode" dans le "Paramètres de détection: Paramètres de détection 1" boîte de dialogue qui appears.Choose différentes couleurs de remplissage pour chaque sujet sous la rubrique «Identification Sujet» dans le: dialogue "Paramètres de détection des paramètres de détection 1" boîte.
  18. Choisissez "Sélectionner la vidéo" et de localiser la vidéo pour Trial 1.Click "Open" .Select "5,9941" de case "taux d'échantillonnage" sous "Vidéo" dans le "Paramètres de détection: Paramètres de détection 1" boîte de dialogue. Cliquez sur "Paramètres" pour l'option "image de référence" sous "détection" dans la boîte de dialogue Rechercher "Paramètres de détection des paramètres de détection 1".
  19. Cliquez sur "Démarrer l'apprentissage (C)4; option dans le "Image de référence" dialogue box.Wait pour le programme pour apprendre l'image de référence. Une fois l'image dans la boîte de dialogue "Référence de l'image" apparaît sans animaux, cliquez sur "Utiliser l'image de référence dynamique" sous "Paramètres d'acquisition" dans la boîte de dialogue.
  20. Cliquez sur "Fermer". Choisissez "Darker" dans le menu déroulant pour "Le sujet est" sous "détection" dans la boîte de dialogue Rechercher "Paramètres de détection des paramètres de détection 1". Définir un plus petit nombre de "33" et plus grand nombre "153" pour "contraste noir" sous "détection" "Paramètres de détection: Paramètres de détection 1" boîte de dialogue.
  21. Cliquez sur "Enregistrer les modifications" en bas à droite de: case "Paramètres de détection des paramètres de détection 1" dialogue. Cliquez sur le bouton de lecture sur la boîte de dialogue "Contrôle de la lecture» et vérifiez que le logiciel est suivi avec succès les animaux plutôt que des ombres ou des débris. Réglez le nombre de "contras sombrest "si nécessaire.
  22. Une fois que le suivi est approprié, cliquez sur "Enregistrer les modifications" en bas à droite de: case "Paramètres de détection des paramètres de détection 1" dialogue. Choisissez "Acquisition" dans l'option "Setup" de la barre d'outils "Experiment Explorer" sur la gauche de l'écran.
  23. Cliquez sur "Track prochain essai prévu" dans la boîte de dialogue "Paramètres d'acquisition". Confirmer le procès, la vidéo et de l'aréna réglage correct est affiché sous "Paramètres" dans la boîte de dialogue "Paramètres d'acquisition".
  24. Cochez l'option "Détection détermine la vitesse" dans la boîte de dialogue «Contrôle d'acquisition». Cliquez sur le bouton avec le cercle vert enfermé dans un carré blanc pour commencer le processus d'acquisition. Répétez les étapes de 4,22 à 4,23 jusqu'à ce que tous les essais ont été suivis.
  25. Cliquez sur "Profils de données" dans l'option "Analyse" de la barre d'outils "Experiment Explorer" sur la gauche de screen.Choose "Time" sous "Nesting" option dans la barre d'outils "Composants". Réglez "To" à "00:02:00" sous la "Sélection d'une plage intervalle de temps" rubrique dans la boîte de dialogue "Time". Cliquez sur "OK".
  26. Faites glisser la case «Nest» entre la case "Démarrer" et la case "Résultat 1" dans la zone "Profils de données» sur le côté droit de l'écran. Cliquez sur "Profil d'analyse" sous l'option "Analyse" de la barre d'outils "Experiment Explorer" sur la gauche de l'écran. Cliquez sur "Velocity" dans le cadre du "Distance and Time" rubrique dans le "Variables dépendantes" barre d'outils qui apparaît.
  27. Cliquez sur "Ajouter" sur la boîte de dialogue "Velocity". Cliquez sur "Distance déplacé" sous la "Distance et Heure" dans la barre d'outils "Variables dépendantes". Cliquez sur "Ajouter" sur le "Distance déplacé" boîte de dialogue. Cliquez sur "Mouvement" dans le cadre du "Comportement individuel" rubrique dans les «variables dépendantes» tBarre d'outils.
  28. Réglez "intervalle de moyenne" à "1" dans le "filtre Outlier" rubrique dans la boîte de dialogue "Mouvement". Réglez "Start vitesse" à "2.00" et "vitesse d'arrêt" à "1.75" dans le cadre du "Seuil" rubrique dans la boîte de dialogue "Mouvement".
  29. Vérifiez les deux cases pour "Moving" et "non en mouvement» sous la rubrique «Calcul de statistiques pour" rubrique dans la boîte de dialogue "Mouvement". Cliquez sur "Ajouter" au bas de la boîte de dialogue "Mouvement". Cliquez sur "Sortie d'analyse" sous l'option «Résultats» dans la barre d'outils "Experiment Explorer" sur la gauche de l'écran. Cliquez sur "Calculer" en haut de l'écran.
  30. Une fois les variables dépendantes sont calculées, cliquez sur "Exporter" en haut de l'écran. Choisissez le dossier de destination dans "Sortie Analyse Export" boîte de dialogue. Sélectionnez "Excel" dans le menu déroulant "Type de fichier" dans le "Export Analyse output "boîte de dialogue. Cliquez sur" OK ".
  31. Cliquez sur "Enregistrer Experiment" sous l'onglet "Fichier" en haut de l'écran. Fermez le logiciel de suivi numérique. Importez les données dans un fichier de tableur et d'analyser en utilisant un progiciel statistique commerciale du logiciel d'analyse.

Résultats

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Traitement manuel des données d' observation visuelles ont montré des anomalies pour cent ont augmenté avec la concentration de cuivre croissante après seulement 72 heures d'exposition initiée post éclosent 2 jours (DPH) esturgeon (figure 2). Les échantillons vidéo documentés l'impact extrême de l'exposition de cuivre sur le comportement de nage de l'esturgeon (Vidéo 2) et aidé à définir la déficience du comportement en conséquence. Dans un autre exemple, l'esturgeon à 30 dph avéré sensible à l'exposition de cuivre avec une 96 h médiane concentration d'effet létal (CL50) de 40,3 ug / L basée sur la mortalité seulement. Toutefois, lorsque paramètres comportementaux sublétales de perte d'équilibre et d'immobilisation sont inclus avec la mortalité la sensibilité augmente avec une concentration estimée de 96 h à effet médian (EC50) allant de 2,4 à 5,0 mg / L. Documentation vidéo capturés ces effets sublétaux et encore validées observations humaines des anomalies comportementales enregistréespendant l'exposition. L'utilisation du logiciel de suivi numérique a réduit le temps de post-traitement de manière significative lors de l'analyse de l'activité piscine. La vitesse de nage des poissons, le temps passé à se déplacer, et la distance parcourue a diminué de manière significative tous (figure 3) avec une concentration en cuivre de plus en plus. Les chemins de natation ont également été réduites avec l' augmentation de la concentration en cuivre (figure 4).

figure-results-1
Figure 1:.. Computer capture d' écran d'un modèle de feuille de calcul utilisée pour déterminer essai Concentration de la solution mère de préparation de la pâte chimique pour les tests de toxicité dilueurs a été déterminée en utilisant un modèle de feuille de calcul basée sur une concentration cible S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
Figure 2:. Configuration Diluter et design expérimental Diverses étapes de la vie de l' esturgeon blanc ont été exposés au cuivre. La taille du dilueur utilisé pour l'exposition est sélectionné sur la base de la taille du poisson. (A) l' esturgeon début de l' étape de vie ont été exposés à l' aide d' une petite configuration de dilueur et (b) l' esturgeon ancien stade de vie ont été exposés à l' aide d' une configuration à grande dilueur.

figure-results-3
Figure 3: Natation comportement résulte d'un esturgeon blanc stade précoce de vie (Acipenser transmontanus) d'exposition au cuivre 72 h ( en commençant par les hachures de 30 jours [dph] de poisson). Activité Piscine terminaux (a) la durée du mouvement parmi les 30 dph esturgeon blanc; (B) la vitesse de la natation; et (c ) déplacé a diminué avec l'augmentation de la concentration en cuivre entre l'esturgeon blanc exposé pendant 96 heures. Asterisk indique une différence significative du contrôle, les barres d'erreur représentent l'écart type.

figure-results-4
Figure 4: Les résultats d'une esturgeon blanc stade précoce de vie (Acipenser transmontanus) 96 d'exposition de cuivre h ( en commençant par les hachures de 2 jours [dph] de poisson) Surviving esturgeon blanc à 2 dph présentant une perte d'équilibre et d' immobilisation après 72 h d'un. exposition de 96 h avec l'augmentation de la concentration en cuivre. Asterisk indique une différence significative du contrôle, les barres d'erreur représentent l'écart type.

figure-results-5
Figure 5: Exemple de natation chemin résulte d'un esturgeon blanc stade précoce de vie (Acipenser transmontanus) exposition au cuivre 96 h (regardant post éclosent 30 jours [dph] de poisson). chemins de natation de l' esturgeon numérisées en utilisant un logiciel de suivi numérique à partir de (a) répliquée de contrôle (n = 5 poissons) et (b) d'un traitement élevé (50 ug / L) répliquée (n = 3 poissons) après une exposition de 96 h. Notez le nombre de chemins de natation ne représente pas le nombre de poissons présents dans la chambre à cause de certains poissons étaient inactifs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Paramètre quantifiable Paramètres observationnelles
Rapidité Léthargie / Hyperactivité
Distance Déplacé Perte d'équilibre
Durée du temps passé dans la zone Spasmes / tremblements / têtevers le bas
Zone de transition nombre de fois l'organisme se déplace entre les zones sélectionnées Position dans la colonne d'eau
En route pour point calcule la déviation de la trajectoire de l'animal vers un point d'intérêt Respiration (rapide / lent)
Heading calcule le cap du point de corps sélectionné Coloration
Tournez angle de différence dans la position entre deux échantillons Dissimulation
Vitesse angulaire calculée en divisant l'angle de braquage par l'intervalle d'échantillon
Promenez-calculée en divisant l'angle de braquage par la distance parcourue. Utilisé pour comparer les transformer en animaux se déplaçant à des vitesses différentes
Le temps passé à se déplacer
Mobilité état calcule la durée pendant laquelle la zone complète détecté comme animal est en train de changer, même si le centpoint de er reste le même
Rotation-une rotation est terminée lorsque le point de corps sélectionné a un angle de braquage cumulatif de 360 ​​°. Tourne dans le sens opposé inférieur au seuil sont ignorés.
Mobilité continue calcule le pourcentage de la mobilité pour la zone complète de l'animal détecté, même si le point central reste le même.
Distance entre les sujets-calcule la distance entre tous les acteurs et les récepteurs sélectionnés
De proximité calcule la durée pendant laquelle l'acteur est ou non à proximité du récepteur
Mouvement relatif
mouvement Le net pondéré mouvement de l'acteur (positif) et de (négatif) du récepteur, pondérée par la distance entre eux
mouvement pondéré de-moveme nt de l'acteur du récepteur, pondérée par la distance entre eux.
mouvement pondéré To- mouvement de l'acteur au récepteur, pondérée par la distance entre eux
contrôle de la période d'essai, déclaration entre deux événements des éléments de contrôle de première instance, ou au sein d'un élément
le contrôle de première instance événement moment où un événement dans un élément que vous avez défini dans le contrôle de première instance se produit.

Tableau 1:. Paramètres comportementaux quantifiés grâce à un logiciel de suivi numérique Ces paramètres peuvent être utilisés sur des individus ou des groupes et servir aussi comme une liste des contrôles d' observation visuelle de la déficience du comportement au cours de l'exposition.

figure-results-6
/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> Vidéo 1:. définition visuelle de comportement anormal présenté par l' esturgeon blanc affecté (clic droit pour télécharger) Une liste de contrôle d' observation quotidienne a été utilisé pour documenter des anomalies Le. perte d'équilibre et d' immobilisation sont les anomalies les plus fréquentes observées lors des expositions. Modifiée de Calfee et al. 7

figure-results-7
Vidéo 2: Documentation visuelle mettant en évidence un exemple de blanc comportement de nage de l' esturgeon. (Clic droit pour télécharger) l' activité de natation de l' esturgeon blanc a été considérablement réduit l' exposition à la concentration en cuivre de plus en plus. L'esturgeon représenté dans cette vidéo sont d'un contrôle, moyen faible, et un traitement élevé à la fin d'un cuivre aqueux 96 hexposition. Bien que l'esturgeon blanc étaient encore en vie, il est évident que le poisson a été grandement altérée dans les traitements par rapport aux contrôles. Modifié à partir de Calfee et al. 7

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les changements de comportement dus à l'exposition à un contaminant sont souvent utilisés comme un critère d'évaluation de la toxicité sub-létale, mais peut être difficile à mesurer. En règle générale, les réponses de comportement sont mesurés par des observations visuelles et l'analyse manuelle des données qui nécessite beaucoup de temps à traiter. Cependant , avec les progrès technologiques, des procédés permettant de quantifier l' activité de natation se sont concentrés sur l' utilisation de 18 vidéographie et analyse de mouvement ou d'un logiciel de suivi de piste numérique qui réduit le temps de traitement et d' analyse. Lors de l'analyse de la vidéo données capturées, la quantification des variables de natation manuellement auraient été beaucoup de temps donc l'utilisation d'enregistrements de données vidéo et de logiciels de suivi des poissons fournis d'une manière plus efficace et efficient pour l'analyse du comportement de natation de l'esturgeon. Bien que la procédure a mis en évidence la natation comportement d'un poisson, la personnalisation pour d'autres organismes tels que les amphibiens et les invertébrés aquatiques nécessiteraient des modifications simples. Selon ce que endpoin comportementalets sont traitées, les systèmes de conception et de caméras expérimentales peuvent être développés pour une utilisation avec à peu près tout paquet disponible dans le commerce de logiciel de suivi.

La méthode est démontrée en utilisant le cuivre dissous, mais est applicable à d'autres contaminants ou des caractéristiques telles que la température ou la teneur en oxygène aqueux. Les protocoles développés et présentés dans ce document ont utilisé une caméra vidéo numérique simple que le dispositif d'enregistrement. Les fichiers numériques sont facilement transférées vers un ordinateur et téléchargées dans le logiciel d'analyse de mouvement. Les méthodes sont constamment modifiées et raffinées pour rationaliser le processus de quantification. Il est impératif que la qualité vidéo soit en haute définition pour que le logiciel d'analyse pour identifier chaque poisson individuel pour le suivi. Tout fond qui ne contraste pas avec les poissons causera des problèmes en essayant de traiter les fichiers de données. Un autre problème commun avec deux suivi vidéo dimensionnel est d'identifier les individuslorsque les chemins de natation se croisent. Ceci peut être corrigé manuellement en identifiant chaque poisson pendant la traversée de chemin et reliant les segments de chemin dans le logiciel. En variante, l'activité totale peut être déterminée à partir de chaque chambre répliquée comme une moyenne du groupe. Plusieurs chambres individuelles avec chacune contenant un poisson peuvent être filmés dans le même champ de vision pour calculer les mouvements de chaque poisson.

Actuellement, nous avons mis à niveau à l'aide d'une série de caméras de surveillance aériennes au-dessus des chambres d'exposition qui sont liés à un dispositif d'enregistrement vidéo numérique haute définition (HD-DVR). Cependant, l'utilisation de tout système de caméra qui peut enregistrer en haute définition MPEG-4 vidéos fonctionnera. Le HD-DVR peut être configuré pour enregistrer à un moment précis et programmé pour un maximum de 7 jours. Cette main-off approche automatisée permet la capture de plusieurs vidéos en même temps de maintenir la cohérence tout en minimisant les perturbations externes qui pourraient compromettre le comportement des poissons. Le syste HD-DVRms sont connectés à un réseau interne afin de transférer des fichiers est relativement simple. Alors que le système de caméra automatique est une technique améliorée beaucoup pour quantifier le comportement de la natation, il est toujours utile de mener des observations visuelles pour servir de support d'information supplémentaire pour documenter des altérations comportementales lors des tests de toxicité.

Il y a une longue histoire de comportement des poissons modifié la littérature documentant résultant de l' exposition aux métaux remontant au début des années 1960 19,20,21. Il a été démontré en cuivre pour provoquer des changements dans les niveaux d'activité tels que l' hypoactivité chez le crapet 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) et les changements dans locomoteur et de l' activité d' alimentation de l' omble de fontaine 23 (Salvelinus fontinalis). Au moins certains poissons juvéniles comptent sur ​​leur sens de l' odorat pour détecter et éviter les prédateurs, et chemosensory privation induite de cuivre peut avoir un impact comportements liés à la détection des produits chimiques d'alarme 24,25,26 . L'épithélium olfactif est endommagé en raison de l' exposition de cuivre affectant ainsi les mécanismes sensoriels qui pourraient entraîner une désorientation, un comportement d' évitement, réduction de l' alimentation et d'autres comportements qui sont guidés par olfaction 27. Ces comportements modifiés étaient conformes à ce qui a été observé lors des expositions.

Le comportement de nage de l'esturgeon blanc a été grandement affecté lors de l'exposition sublétale à des concentrations de cuivre aqueux .. Ces résultats illustrent comment le comportement est affecté à des concentrations sublétales de cuivre et peut être utilisé comme un indicateur de stress toxique. L'analyse basée vidéo avérée efficace pour quantifier le comportement de natation et a également servi en tant que documentation visuelle qualitative des impacts graves sur l'esturgeon exposés au cuivre. Le logiciel d'analyse est également capable de quantifier les divers autres paramètres comportementaux. S'il vous plaît se référer au tableau 1 pour une liste. Le système d'exposition peut être modifié pour répondre à chaque extrémité dansle mode en temps réel et peut être utilisé pour quantifier les différences dans le comportement associé à l'exposition à divers contaminants préoccupants.

L'utilisation de paramètres comportementaux dans la recherche toxicologique aquatique est de plus en plus employée et doit être considéré lors de l' évaluation des effets des contaminants parce que la fonction du comportement adaptatif est crucial dans la détermination du préjudice environnemental 9. Les effets des contaminants environnementaux pour le comportement des poissons est souvent subjective et stimulant notamment lorsqu'ils traitent avec paramètres sublétaux en l'absence de méthodes standard ..

Piscine activité quantifiée par l'utilisation de ces méthodes peuvent être surveillées avec rigueur, est non-destructive avec un minimum de stress pour l'organisme et peut être répétée. Piscine comportement est un index valide et cohérente de toxicité sublétale qui devrait être intégrée dans les protocoles de test pour développer la sensibilité des tests de toxicité standard 5.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toute utilisation de noms commerciaux, d’entreprises ou de produits est uniquement à des fins descriptives et n’implique pas l’approbation du gouvernement américain.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le personnel de la Direction de l’écologie, de la Direction de la toxicologie et de la Direction de la chimie environnementale de l’U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center pour leur assistance technique et analytique. Le financement est fourni en partie par Teck American Incorporated dans le cadre d’une entente avec l’Environmental Protection Agency (USEPA) de la région 10 de l’USEPA et par l’intermédiaire du US Geological Survey (USGS) par l’intermédiaire du Central Hazmat Fund du ministère de l’Intérieur.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
cuivre II sulfate pentahydratéSigma-Aldrichcontaminant préoccupant
distributeur de seringuesHamilton MicroLab 600 Seriesappareil pour droguer produit chimique
jaugépour la solution mère
24-1,5 L Bocaux en verre Chambre d’essaid’esturgeon 2 dph
Logiciel de suivi numérique HDR-CX550V
Noldus Ethovision
Moniteurs
24 caméras de surveillanceModèle CL101
Appareils
DO mètreYSI
pH-mètreOrion 940
sonde de phOrion  ;
d’ammoniac
sonde d’ammoniac
, pompe
Flacon de 2 L pour caméra vidéo à écran plat 3-17"d’enregistrement numérique 3-16 canauxcompteur , , unité de refroidissement Orion à eau de recirculation

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerhardt, A. Aquatic behavioral ecotoxicology-prospects and limitations. Hum Ecol Risk Assess: An International Journal. 13 (3), 481-491 (2007).
  2. Beitinger, T. L. Behavioral reactions for the assessment of stress in fishes. J Great Lakes Res. 16, 495-528 (1990).
  3. Beitinger, T. L., McCauley, R. W. Whole-animal and physiological processes for the assessment of stress in fishes. J Great Lakes Res. 16, 542-575 (1990).
  4. Behavioural Ecotoxicology. Dell'Omo, G. , J Wiley & Sons. Chichester, UK. (2002).
  5. Little, E. E., Finger, S. E. Swimming behavior as an indicator of sublethal toxicity in fish. Environ Toxicol Chem. 9, 13-19 (1990).
  6. Rand, G. M. Behavior. Fundamentals of Aquatic Toxicology: Methods and Applications. Rand, G. M., Petrocelli, S. R. , Hemisphere Publishing. New York. 221-256 (1985).
  7. Calfee, R. D., et al. Acute sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to copper, cadmium, or zinc in water-only laboratory exposures. Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2259-2272 (2014).
  8. Little, E. E., Calfee, R. D., Linder, G. Toxicity of smelter slag-contaminated sediments from Upper Lake Roosevelt and associated metals to early life stage White Sturgeon (Acipenser transmontanus Richardson, 1836). J Appl Ichthyol. , 1-11 (2014).
  9. Wang, N., et al. Chronic sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to cadmium, copper, lead or zinc in water-only laboratory exposures. Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2246-2258 (2014).
  10. Little, E. E. Behavioral measures of injuries to fish and aquatic organisms: regulatory considerations. Behavioural Ecotoxicology. Dell'Omo, G. , J Wiley & Sons. Chichester, UK. 411-431 (2002).
  11. Little, E. E., Brewer, S. K. Neurobehavioral toxicity in fish. Target Organ Toxicity in Marine and Freshwater Teleosts New Perspectives: Toxicology and the Environment. Volume 2. Schlenk, D., Benson, W. H. , Taylor and Francis. London and New York. 139-174 (2001).
  12. Mount, D. I., Brungs, W. A. A simplified dosing apparatus for fish toxicological studies. Water Res. 1, 21-29 (1967).
  13. Standard guide for performing early life-stage toxicity tests with fishes. Annual.Book of ASTM International Standards. Volume 11.06. , ASTM International. West Conshohocken, PA. SOURCE: http://www.astm.org/Standards/E1241.htm (2014a) 1241-1305 (2013).
  14. Standard guide for measurement of behavior during fish toxicity tests. Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06. , ASTM International. West Conshohocken, PA. SOURCE: http://www.astm.org/Standards/E1711.htm (2014b) 1711(2014).
  15. Standard guide for conducting acute toxicity tests on test materials with fishes, macroinvertebrates, and amphibians. Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06. , ASTM International. West Conshohocken, PA. SOURCE: http://www.astm.org/Standards/E729.htm (2014c) 729-796 (2014).
  16. Brunson,, et al. Assessing bioaccumulation of contaminants from sediments from the upper Mississippi River using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch Environ ConTox. 5, 191-201 (1998).
  17. Brumbaugh, W. G., May, T. W., Besser, J. M., Allert, A. L., Schmitt, C. J. Assessment of elemental concentrations in streams of the New Lead Belt in southeastern Missouri, 2002-05. U.S. Geological Survey Scientific Investigations Report 2007-5057. , (2007).
  18. Kane, A. S., Salierno, J. D., Gipson, G. T., Molteno, T. C. A., Hunter, C. A video-based movement analysis system to quantify behavioral stress responses of fish. Water Res. 38, 3993-4001 (2004).
  19. Sprague, J. B. Avoidance of Copper-Zinc Solutions by Young Salmon in the Laboratory. JWater Pollut Control Fed. 36 (8), 990-1004 (1964).
  20. Saunders, R. L., Sprague, J. B. Effects of copper-zinc mining pollution on a spawning migration of Atlantic salmon. Water Res. 1 (6), 419-432 (1967).
  21. Barron, M. G. Environmental contaminants altering behavior. Behavioural Ecotoxicology. Dell'Omo, G. , Wiley & Sons. Chichester, UK. 167-186 (2002).
  22. Ellgaard, E. G., Guillot, J. L. Kinetic analysis of the swimming behavior of bluegill sunfish, Lepomis macrochirus rafinesque, exposed to copper: hypoactivity induced by sublethal concentrations. J Fish Biol. 33, 601-608 (1998).
  23. Drummond, R. A., Spoor, W. A., Olson, G. G. Some short-term indicators of sublethal effects of copper on brook trout, Salvelinus fontinalis. J Fish Res Board Can. 30, 698-701 (1973).
  24. Hansen, J. A., Rose, J. D., Jenkins, R. A., Gerow, K. G., Bergman, H. L. Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to copper: neurophysiological and histological effects on the olfactory system. Environl Toxicol Chem. 18, 1979-1991 (1999).
  25. Sandahl, J. F., Baldwin, D. H., Jenkins, J. J., Scholz, N. L. A sensory system at the interface between urban stormwater runoff and salmon survival. Environ Sci Technol. 41 (8), 2998-3004 (2007).
  26. McIntyre, J. K., Baldwin, D. H., Beauchamp, D. A., Scholz, N. L. Low-level copper exposures increase visibility and vulnerability of juvenile coho salmon to cutthroat trout predators. Ecol Appl. 22 (5), 1460-1471 (2012).
  27. Green, W. W., Mirza, R. S., Wood, C. M., Pyle, G. G. Copper binding dynamics and olfactory impairment in fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol. 44 (4), 1431-1437 (2010).

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Mots-clés

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