Fabrication de dispositifs d'analyse de coton

Résumé

Pour étudier des approches de fabrication simples répondant à de multiples besoins de dosage, nous avons créé un système de canaux absorbant les fluides en coton. Ce dispositif a été utilisé pour établir une plate-forme de détection multiple et résoudre les problèmes de contamination qui affectent généralement les dispositifs biomédicaux à flux latéral, pour l’analyse d’urine clinique de nitrite, de protéines totales et d’urobilinogène.

Résumé

Un dispositif d'analyse robuste, à faible coût devrait être rapide et abordable et facile à utiliser. De tels dispositifs devraient également être en mesure de fonctionner avec des échantillons rares et fournir des informations pour le suivi du traitement. Ici, nous démontrons le développement d'une analyse d' urine à base de coton (c. -à- nitrite, protéines totales, et urobilinogène essais) dispositif d' analyse qui utilise un format basé sur l' écoulement latéral, et est peu coûteux, facile à fabriquer, rapide, et peut être utilisé pour effectuer plusieurs tests sans soucis de contamination croisée. Coton se compose de fibres de cellulose possédant des propriétés absorbantes naturelles qui peuvent être mises à profit pour l'analyse basée sur les flux. Le processus simple mais élégante fabrication de notre dispositif d'analyse à base de coton est décrite dans cette étude. L'agencement de la structure de coton et de test de tampon tire profit de l'hydrophobie et la résistance d'absorption de chaque matériau. En raison de ces caractéristiques physiques, les résultats colorimétriques peuvent adhérer constamment à l'épreuvetampon. Ce dispositif permet aux médecins de recevoir des informations cliniques en temps opportun et montre un grand potentiel comme outil d'intervention précoce.

Introduction

Le développement du point-of-care (POC) Les dispositifs de diagnostic qui sont abordables, robuste et facile à utiliser est impératif pour l' amélioration de ^1,2 mondiale de la santé. En particulier, des dispositifs constitués de substrats de cellulose (par exemple, papier, fil, et coton) fournir des plates - formes analytiques prometteuses pour l' analyse à faible coût en raison de leur omniprésence, l' abordabilité, la facilité d'utilisation, la robustesse et la capacité à fournir des résultats rapides ^3-7.

Ici, nous dévoilons le développement d'un dispositif d'analyse à base de coton qui utilise un format basé sur des flux latéral pour urinalysis. Ce dispositif d'analyse à base de coton fournit une approche de détection alternatif avec plusieurs avantages clés: i) la fabrication avec l'effort humain minimal; ii) un faible coût; iii) la capacité à utiliser pour effectuer de multiples dosages différents sans contamination croisée des préoccupations; iv . ) l' indépendance du dispositif, à savoir la capacité à fonctionner sans l' équipement et / ou d' électricité supplémentaire; et v) Vitesse (essais colorimétriques peut être complété en 10 min).

La structure de ce dispositif d'analyse à base de coton peut être divisé en quatre parties: i) le coton qui est naturellement hydrophobe sur sa couche externe hydrophobe; ii) coton hydrophile qui est à l'intérieur et sert de canal de transport pour évacuation de liquide; iii) un film de stratification qui se lie et comprime le coton utilisé, mais qui contient des trous forés pour le placement de tampons de réaction / test; et iv) des tampons d'essai du papier de Chromatographie, qui sont revêtues / intégrés avec les réactifs, placés sur la surface extérieure du coton ( plus précisément, dans l'espace foré sur le film de lamination) en tant que zones de réaction pour les essais colorimétriques ( par exemple, un nitrite, la protéine totale, le pH et des tests de urobilinogène) et l'affichage des résultats.

Le mécanisme sous-jacent de l'essai est le suivant. Le dispositif d'analyse à base de coton est marqué avec des lignes qui pénètrent à mi-chemin à travers le départementh du matériau en coton pour créer un canal d'écoulement qui permet au fluide d'échantillon pour atteindre les tampons réactifs utilisés. Le bord d' absorption du dispositif d' analyse est immergée dans l'échantillon cible, après quoi la solution est mauvais le long du canal fluidique depuis l'extrémité d'absorption aux plots de test (figure 1). Parce que la force d'absorption du tampon d'essai est supérieure à celle du coton, des solutions absorbés par les plots de test sont bien contenus à l'intérieur du papier de tampon d'essai de sorte qu'il n'y a pas de refusion dans le canal fluidique, ainsi que les résultats colorimétriques deviennent ensuite fixés sur la matière de tampon de test. A la fin de la réaction, les résultats colorimétriques sont enregistrés au moyen d'un scanner de bureau, et analysées au moyen du logiciel d'analyse d'images.

Protocole

ATTENTION: la pratique de l'hygiène de laboratoire appropriée est requise. Les gants et les précautions universelles sont nécessaires lors de l'utilisation de ce dispositif de POC. La contamination des résultats ou l'infection peut se produire si les procédures de stérilisation adéquates ne sont pas effectuées correctement.

1. Préparer dispositifs de bandelettes de test

1. Déterminer le caractère hydrophobe de la couche extérieure du coton de nettoyage par une mesure d'angle de contact ⁸ (figure 3).
2. Fabriquez le dispositif d' analyse à base de coton en coupant le nettoyage coton dans 5,5 cm x 1 cm avec un coupe-papier (figure 2A).
3. Percer des trous (ø = 0,5 cm) dans une feuille standard de film de lamination en rangées de trois; la distance séparant deux trous suivants est de 1 cm.
   NOTE: Jusqu'à 36 bandelettes de test individuelles avec trois zones d'essai chacun peuvent être réalisés en utilisant une feuille standard de film de plastification (5,5 cm x 2 cm) (figure 2B).
4. Sandwich du coton de nettoyage (characterized par hydrophobie extérieur et hydrophilie intérieur) entre deux morceaux de film de lamination, à savoir, la feuille de trou percé d' un film de lamination sur un côté, et une feuille non forée du film de lamination (pas de trous) de l'autre côté. Placez l'ensemble dans une plastifieuse pour emballer l'appareil. Cela améliore la résistance mécanique de l'appareil, et fournit, une couche imperméable externe.
   NOTE: Les diamètres des trous se contracteront de 0,5 cm à 0,47 cm ~ après stratification. Quelques légers écarts demeurent entre le coton de nettoyage et le film de stratification sur le pourtour de chaque trou. Ces légères lacunes facilitent la mise en place de cercles de plaquettes de test réalisés dans une étape ultérieure.
5. Utilisez une paire de ciseaux pour couper des appareils individuels de bandelettes de test 5,5 cm x 1 cm de l'ensemble, à savoir, la feuille de lamination foré / coton / feuille de lamination non forée "sandwich" (figure 2C). Faire 48 appareils au total pour créer des courbes standards comme décrit plus loin (18 appareilspour l'essai de nitrite, de 15 dispositifs pour l'essai de BSA, et 15 dispositifs pour le dosage de l'urobilinogène).
6. Utilisez un couteau ou un rasoir tranchant pour couper une fente (comme un petit canal fluidique) à partir du centre de chaque zone d'essai (non couvert par le film de lamination), à travers et à travers la couche hydrophobe de la zone d'essai à la couche hydrophile du dispositif longitudinal, être prudent pour couper la moitié de la profondeur de l'appareil pris en sandwich (figure 2D).
7. Appliquer des plages d'essai de papier (ø = 0,5 cm) en les faisant glisser dans les fentes sur le périmètre de chaque trou dans la tôle (figure 2E).

2. Préparer les normes et indicateurs Solutions pour Urinalysis

1. Préparer 10,0 mM solution mère nitrite en dissolvant le nitrite de sodium 69,0 mg dans 100 ml d'eau désionisée (DI). Diluer la solution de nitrite de stocks dans de l' eau DI pour créer une série de solutions de nitrite standard de concentration (2.500, 1.250, 625, 312, 156, et 78 uM) (Figure4A).
2. Préparer l'albumine de sérum bovin (BSA) solution mère de 60 pM bovine en dissolvant 415 mg de BSA dans 100 ml d'une solution de PBS (tampon phosphate 10 M, 0,0027 M de chlorure de potassium et 0,137 M de chlorure de sodium; pH 7,0). Diluer la solution mère de BSA dans de l' eau DI pour créer une série de solutions BSA standard de concentration (30, 15, 7,5, 3,75 et 1,875 uM) (figure 4B).
3. Préparer 25 g / L urobilinogène solution mère en dissolvant 2,5 g urobilinogène dans 100 ml d'eau DI. Diluer la solution stock urobilinogène dans l' eau DI pour créer une série de solutions de concentration de urobilinogène standard (7,8, 15,6, 31,2, 62,5 et 125 mg / L) (figure 4C).
4. Préparer une solution contenant du nitrite d'indicateur sulfanilamide 50 mM, acide citrique 330 mM, et 10 le N- (1-naphtyl) éthylènediamine.
5. Préparer une solution d'indicateur BSA contenant 250 mM de solution de citrate de tampon (pH 1,8) et une solution 3,3 mM de bleu de tétrabromophénol dans 95% d'éthanol.
6. Préparer une solution d'indicateur contenant urobilinogène 0,1 M benzaldéhyde 4-diméthylamine.

3. Préparer Pads Indicateur

1. Couper trois plaquettes de forme circulaire ou disques (ø = 0,5 cm) de papier chromatographique et insérer chacun d'eux (un pour chaque essai sur la bande de trois test) sur chaque dispositif de bande de test pour créer une courbe standard de la solution (section 4).
2. A chacun des trois trous de film de stratification de l'ensemble, observer un léger décalage entre le film de stratification et le tampon de test de coton sur les bords mêmes du trou découpé. A noter, le trou dans le film de stratification est légèrement plus petit en diamètre que le tampon de test de papier.
   NOTE: Ensemble, ces caractéristiques permettent au tampon d'essai de papier à appliquer contre la partie de tampon de test de coton de l'appareil afin que les bords de l'essai de papier pad glisser dans la fente mince mentionnée, à savoir, sous les bords du trou de film de lamination. Cela maintient les plots de test de papier en place.
3. Préparer le Nitrite Assay partie du dispositif.
   1. Enduire le tampon de dosage de nitrite avec 4 pi de solution de nitrite d'indicateur (préparé à l'étape 2.4) et laisser sécher complètement à température ambiante.
4. Préparer le total Portion Protein Assay de l'appareil de détection.
   1. Enduire le pad totale d'essai de protéine avec 4 pi de solution BSA indicateur (préparé à l'étape 2.5) et laisser sécher complètement à température ambiante.
5. Préparer la Portion Uroblinogen Dosage de l'appareil de détection.
   1. Enduire le tampon de dosage uroblinogen avec 4 pi d'indicateur de uroblinogen (préparé à l'étape 2.6) et laisser sécher complètement à température ambiante.

4. Créer des courbes standard pour l'appareil d'analyse à base de coton

1. Pour chaque norme préparée, trempez la fin d'absorption d'un dispositif préparé (préchargé avec des indicateurs d'essai (voir section 3.4)) dans la solution standard pendant 10 secondes (le volume d'absorption ~200 - 300 pi) (figure 2f).
2. Placez le dispositif à base de coton dans un environnement ambiant pendant 10 min pour compléter les réactions colorimétriques (Figure 2F). Répétez chaque expérience en triple.
3. Balayez l'appareil pour analyser le changement colorimétrique se produisant à chaque plot de test (Figure 2G). Lieu résultant plots de test sur la vitre d'un scanner de bureau et de plots de test de numérisation en mode RVB avec 600 dpi de résolution d'image. Enregistrer chaque image au format jpeg.
4. Analyser l'image numérisée sur un ordinateur en utilisant un logiciel d'analyse d'image pour déterminer les intensités de couleur respectives (figure 2H).
   1. Télécharger le logiciel ImageJ à http://imagej.nih.gov/ij/. Ouvrez les fichiers d'images numérisées. Sélectionnez l'image dans les commandes de menu, puis sélectionnez "Type" pour convertir les images RVB à 8 bits en niveaux de gris.
   2. Utilisez l'outil "Oval" dans la barre d'outils pour sélectionner la zone d'analyse de tampon d'essai. Sélectionnez "Analyser" dans le menu commands, et sélectionnez "Mesure" pour analyser l'intensité des couleurs. Enregistrement signifie résultats d'intensité.
5. Établir les courbes standard de nitrite, des protéines totales, et des essais de urobilinogène (figure 2I).
   1. Indiquer différentes concentrations de nitrite standard, les protéines totales et les solutions de corrélation urobilinogène et les résultats moyennes d'intensité sur un système de coordonnées à deux dimensions en utilisant un logiciel stastical.
   2. Monter la courbe standard pour un essai de nitrite par un modèle quadratique et les courbes standard pour protéines et urobilinogène totaux des essais par des modèles de régression linéaire.

5. Déterminer inconnu exemples Concentrations Utilisation établi des valeurs standard Courbe

1. Pour déterminer le nitrite, des protéines totales, et les concentrations de urobilinogène dans des solutions inconnues, utiliser l'appareil comme décrit pour la mesure des concentrations de solution standard et de substitution mesuré les résultats d'intensité pour le nitrite, les protéines totales, et urobiessais de linogen dans les équations des modèles construits à l'étape 2.

Résultats

Nous avons démontré avec succès le développement de dispositifs d' analyse à base de coton à l'aide disponible dans le commerce de coton de nettoyage caractérisée par hydrophile (partie intérieure) et (partie extérieure) des propriétés hydrophobes (Figure 1A). La figure 3 montre les résultats de mesure d'angle de contact. L'interface hydrophobe de coton extérieur était 127,35 ° ± 4,73 °. Du point de vue conviviale, les tests colorimétriques utilisés ici ...

Discussion

Les étapes critiques dans ce protocole inclus déterminer la combinaison appropriée de tissu de coton (avec plus ou moins hydrophobie / hydrophilie) et du papier filtre (papier filtre de chromatographie ou papier filtre quantitatif). Une conception de dispositif bien planifié et exécuté rend les meilleurs attributs de performance pour les essais colorimétriques. De nos résultats d'analyse colorimétriques, le dispositif d'analyse à base de coton présentée ici démontre un grand potentiel en tant que plate-forme pou...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich, n	° US 9048468	&ge ; 99 %
nitrite  ;	Sigma-Aldrich, n° US	7632000	&ge ; 99 %
urobilinogène  ;	Biographie de Santa Cruz,	n° US SC-296690
citrate	Sigma-Aldrich	N° U.S. 6132043	&ge ; 99 %
bleu tétrabromophénol	Sigma-Aldrich	N° U.S. 4430255	&ge ; 99 %
sulfanilamide	Sigma-Aldrich N° U.S	. 63741	&ge ; 99 %
d’acide citrique  ;	Sigma-Aldrich U.S	. n° 77929	&ge ; 99,5 %
; Chlorhydrate de N-(1-naphtyl)éthylènediamine	Sigma-Aldrich	N° 1465254	&ge ; 98%
4-(Diméthylamine)benzaldéhyde	AlfaAesar, n° U.S	. A11712	&ge ; 98 %
Sel sodique rouge de méthyle	sigma,	n° U.S. 114502	&ge ; 95 %
Bromothyle blue	sigma,	n° 114413	&ge ; 95 %
Shiseido Cleansing Cotton	Shiseido, Japon	n° 79014
papier de chromatographie	GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK	n° 30306132
film de laminage	de substrat plastique	A4	216 mm x 303 mm
scanner	microtek scanmaker	; Coupe-papier i2400
	Coupe-papier Life	No.306
plastifieuse	AURORA  ;
film laminateur	UNI LAMI  ;	4A