Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

Summary

Nous décrivons deux méthodes complémentaires utilisant l’indicateur de cycle cellulaire d’ubiquitination de fluorescence (FUCCI) et l’analyse d’images ou la cytométrie en flux pour identifier et isoler les cellules dans les régions internes G1 arrêtées et externes proliférantes des sphéroïdes 3D.

Abstract

Les sphéroïdes tumoraux tridimensionnels (3D) sont utilisés dans la recherche sur le cancer en tant que modèle plus précis du microenvironnement tumoral in vivo, par rapport à la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) traditionnelle. Le modèle sphéroïde est capable d’imiter les effets de l’interaction cellule-cellule, de l’hypoxie et de la privation de nutriments, et de la pénétration des médicaments. L’une des caractéristiques de ce modèle est le développement d’un noyau nécrotique, entouré d’un anneau de cellules arrêtées G1, avec des cellules proliférantes sur les couches externes du sphéroïde. Ce qui est intéressant dans le domaine du cancer, c’est la façon dont les différentes régions du sphéroïde réagissent aux thérapies médicamenteuses ainsi qu’aux manipulations génétiques ou environnementales. Nous décrivons ici l’utilisation du système d’indicateur du cycle cellulaire d’ubiquitination en fluorescence (FUCCI) ainsi que la cytométrie et l’analyse d’images à l’aide d’un logiciel commercial pour caractériser l’état du cycle cellulaire des cellules par rapport à leur position à l’intérieur des sphéroïdes de mélanome. Ces méthodes peuvent être utilisées pour suivre les changements dans l’état du cycle cellulaire, l’expression des gènes/protéines ou la viabilité cellulaire dans différentes sous-régions des sphéroïdes tumoraux au fil du temps et dans différentes conditions.

Introduction

Sphéroïdes multicellulaires 3D ont été connu comme un modèle de tumeur pendant des décennies, mais il est seulement récemment qu'ils sont venus dans l'usage plus fréquent comme un modèle in vitro pour de nombreux cancers solides. Ils sont de plus en plus utilisés dans les écrans de découverte de médicaments à haut débit comme un intermédiaire entre complexe, coûteux et chronophage de modèles in vivo et le simple, le modèle monocouche faible coût 2D ^1-6. Études en culture 2D sont souvent incapables de répliquer in vivo. Modèles sphéroïde nombreux types de cancer sont capables d'imiter les caractéristiques de croissance....

Protocol

1. FUCCI transduction et culture cellulaire

1. FUCCI transduction
   1. Créer des lignées cellulaires exprimant de manière stable le FUCCI construit mKO2-hCdt1 (30-120) et GAM-hGem (1-100) ¹⁵ en utilisant la co-transduction lentivirus ⁷ comme décrit précédemment.
      Remarque: Le système FUCCI est maintenant disponible dans le commerce.
   2. Générer sous-clones avec une vive fluorescence par tri seule cellule. Trier simples cellules positives pour les deux AG et KO (jaune) par fluorescence tri cellulaire activé dans une plaque de 96 puits tel que décrit précédemment ^7,16.
2. Culture de cellules de m....

Results

Il existe plusieurs procédés de production de sphéroïdes de tumeur, ce protocole utilise la méthode de croissance non-adhérente, où les cellules sont mises en culture sur de la gélose ou agarose ^3,7,9. La figure 1 montre un exemple d'un sphéroïde C8161 de mélanome dans les 3 jours sur de la gélose. Sphéroïdes C8161 forment sphéroïdes de taille régulière avec un diamètre de 500 - 600 um (moyenne = 565, SD = 19, n = 3) après 3 jours. D'autres lignées cellulaires de mélanome qui.......

Discussion

Semi-automatisé d'analyse d'image identifié la région intérieure sphéroïde G1 arrêté, et la prolifération des couches externes. Ce procédé peut être utilisé sur des sphéroïdes sous tension au moyen d'un article optique, ou dans des sections de sphéroïdes fixes, afin d'identifier des changements dans non seulement du cycle cellulaire, mais l'expression du marqueur (par immunofluorescence), la mort cellulaire, ou la morphologie des cellules dans les différentes régions. Motilité cellulaire dans les dif.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarose à bas point de fusion	Life Technologies	16520-050	Pour le tronçonnage de
gélose noble.	Sigma	A5431	Pour la fabrication de sphéroïdes
agarose pour sphéroïdes	Fisher Scientific	BP1356-100	Pour la fabrication de sphéroïdes
0,05 % trypsine/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10 % de formol	Sigma	HT5014-1CS	ATTENTION : Nocif, corrosif. Utilisez un équipement de protection individuelle, faites   ; ne pas respirer les fumées (ouvrir dans une sorbonne).
vivant/mort près d’IR	Life Technologies	L10119
vibratome	Technical Products International, Inc
coupelle coulture	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Moule pour la coupe des sphéroïdes
hémocytomètre	Sigma	Z359629
plaque de culture tissulaire à 96 puits	Invitro	FAL353072
collagénase	Sigma	C5138  ;
microscope confocal	Leica	TCS SP5
Analyseur de cytomètre en flux	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocité	PerkinLogiciel	d’imagerie
flowjo	Tree Star		Logiciel de cytométrie en flux Graisse
sous vide	Sigma	Z273554
Média de montage	Vecteur Laboratoires	H1000
FUCCI (constructions commerciales)	Life Technologies	P36238	Transfection transitoire uniquement
Crépine de cellule 70 μ ; m	In Vitro	FAL352350
Tubes de 5 ml à fond rond (stériles)	In Vitro	FAL352003
Tubes de 5 ml (non stériles)	FAL352008		vitro