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Article de méthode

Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

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DOI :

10.3791/53494

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28 janvier 2016

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1Center for Nano Science and Technology @PoliMi, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano

Dans cet article

Résumé

Une méthode de stimulation de cultures cellulaires in vitro avec l’activité électrique avec la lumière visible, basée sur l’utilisation de polymères semi-conducteurs organiques, est décrite.

Résumé

Les interfaces hybrides entre semi-conducteurs organiques et tissus vivants représentent un nouvel outil pour les applications in-vitro et in-vivo. En particulier, les polymères conjugués présentent plusieurs propriétés optimales en tant que substrats pour les systèmes biologiques, telles qu’une bonne biocompatibilité, d’excellentes propriétés mécaniques, une technologie de traitement peu coûteuse et facile et la possibilité de dépôt sur des substrats légers, minces et flexibles. Ces matériaux ont été utilisés pour des interfaces cellulaires telles que des sondes neuronales, des transistors pour l’excitation et l’enregistrement de l’activité neuronale, des biocapteurs et des actionneurs pour la libération de médicaments. Des expériences récentes ont également démontré la possibilité d’utiliser des polymères conjugués pour la modulation tout optique de l’activité électrique des cellules. Plusieurs cas d’études in vitro ont été rapportés, notamment des réseaux neuronaux primaires, des astrocytes et des cellules de lignées secondaires. De plus, il a été démontré que la photo-transduction du signal médiée par les polymères organiques restaure la sensibilité à la lumière dans les rétines dégénérées, ce qui suggère que ces dispositifs pourraient être utilisés pour les prothèses rétiniennes artificielles à l’avenir. Dans l’ensemble, les polymères conjugués sensibles à la lumière représentent une nouvelle approche pour la modulation optique de l’activité cellulaire.

Dans ce travail, toutes les étapes nécessaires à la fabrication d’une interface biopolymère pour l’excitation optique de cellules vivantes sont décrites. La fonction de l’interface active est de traduire le stimulus lumineux en une modulation du potentiel de la membrane cellulaire. À titre de cas d’étude, utile pour les études in vitro, un film mince de polythiophène est utilisé comme couche fonctionnelle absorbant la lumière, et les cellules de rein embryonnaire humain (HEK-293) sont utilisées comme composant biologique de l’interface. Des exemples pratiques de contrôle réussi du potentiel de la membrane cellulaire lors d’une stimulation avec des impulsions lumineuses de différentes durées sont fournis. En particulier, il est démontré que des effets dépolarisants et hyperpolarisants sur la membrane cellulaire peuvent être obtenus en fonction de la durée du stimulus lumineux. Le protocole rapporté est d’une validité générale et peut être directement étendu à d’autres préparations biologiques.

Introduction

La possibilité de manipuler l'activité cellulaire avec une résolution spatiale et temporelle précise représente une stratégie importante dans la recherche neuroscientifique et dans le traitement de troubles neurologiques et psychiatriques. 1 Les méthodes traditionnelles sont basés sur la stimulation électrique des cellules en utilisant des électrodes positionnées à proximité ou en contact avec le système cible, 2 qui peut être différent de complexité (cellule unique, le réseau cellulaire, des tranches de cerveau, in vivo des tissus cérébraux). Au cours du siècle passé, l'utilisation de patch-clamp, le métal et les électrodes de substrat intégré ont fourni une image détaillée de la physiologie et la physiopathologie de neurones simples et des mécanismes de réseaux de neurones de fonctionnement. Toutefois, la stimulation électrique souffre de limitations importantes. Le premier est lié à une résolution spatiale généralement médiocre en raison des dimensions physiques des électrodes et leur géométrie fixe, ce qui ne peut pas être facilement adaptésà des systèmes organisés complexes comme les tissus biologiques. En outre, les problèmes liés à l'impédance des électrodes et de diaphonie entre les systèmes de stimulation et d'enregistrement peuvent se détériorer le rapport signal final à bruit des mesures. 3 D'autre part, l'utilisation de la lumière pour la stimulation peut aider à surmonter de nombreuses limitations de l'approche électrique. Tout d'abord, elle offre sans précédent spatiale (<1 um) et la résolution temporelle (<1 ms), ce qui permet de cibler des types cellulaires spécifiques, voire des compartiments sub-cellulaires. En outre, il est hautement non invasif car il évite tout contact physique avec le tissu d'intérêt et se démêlent stimulation de l'enregistrement. En outre, à la fois l'intensité lumineuse et la longueur d'onde peuvent être précisément réglementés et protocoles de stimulation ainsi diverses peuvent être appliquées. 3,4

Cependant, la grande majorité des cellules animales ne présentent aucun sensibilité particulière à la lumière. Plusieurs stratégies pour stimulatio optiquen ont donc été proposées, soit l'exploitation de médiateurs moléculaires sensibles à la lumière à proximité ou à l'intérieur des cellules, ou en utilisant un dispositif photosensible placé à l'extérieur, à proximité de la cellule. La première catégorie se réfère aux mécanismes endogènes comme la stimulation par l'intermédiaire (IR) lumière visible ou infrarouge, ainsi que l'utilisation soit de composés photoisomérisables / photoclivable ou l'expression génétique des actionneurs moléculaires photosensibles (optogénétique). Cette dernière catégorie comprend les techniques de stimulation exogène obtenue avec l'utilisation de nano / micro-particules inorganiques ou des substrats de silicium photoconducteur. 5 Cependant, tous ces systèmes ont des côtés lumineux et des inconvénients. En particulier, l'absorption endogène de cellules dans le domaine visible est faible et non fiable, et la génération concomitante d'espèces réactives de l'oxygène peut être nuisible à la cellule. En général, les IR est utilisé pour induire chauffage thermique local du fait de l'absorption d'eau, mais le coefficient d'extinction de l'eau est faible, ce qui nécessite stlumière infrarouge rong (de quelques dizaines à des centaines de W / mm 2) qui est difficile à livrer via optique du microscope standard et peut poser des problèmes de sécurité pour les applications in vivo. D'autre part, les composés de cages photo-commutables ont une action limitée dans le temps et nécessitent souvent la lumière UV qui est difficile à remettre en raison de la pénétration tissulaire limitée. De plus, ils souffrent de problèmes de diffusion des composés activés lors de la photolyse en dehors de la zone éclairée. Enfin, des outils optogénétiques ont permis aux scientifiques de cibler sous-population cellulaire spécifique et des sous-compartiments et sont rapidement en train de devenir l'une des technologies clés dans la recherche neuroscientifique. Cependant, l'insertion d'un segment d'ADN exogène via un vecteur viral soulève des questions importantes sur la sécurité, notamment en vue de l'adoption sur des patients humains. 5,6 Pour ces raisons, la recherche sur de nouveaux matériaux et dispositifs capables de manipulation optique de la cellule est un sujet extrêmement chaud.

Récemment, un romanapproche basée sur l'utilisation de polymères conjugués sensibles à la lumière, capable de transduire efficacement un stimulus optique en une modulation de l'activité électrique de la cellule, a été proposée. La cellule de stimulation par Polymer photoexcitation (CSPP) technique exploite de nombreuses fonctionnalités clés génériques, typique de semi-conducteurs organiques: ils sont intrinsèquement sensibles à la lumière dans le domaine visible; 7 ils sont biocompatible, souple et adaptable et leur flexibilité mécanique permet une interface intime avec le tissu à la fois in vitro et in vivo 10.8. En dehors de cela, ils peuvent être facilement fonctionnalisés de mieux adapter à l'interface avec les cellules vivantes, et de permettre à excitation spécifique, sonder et de détection des capacités. 11,12 De plus, ils support électronique ainsi que le transport ionique, ce qui les rend idéal pour la combinaison de l'électronique annonce la biologie. 13,14 intéressant, ils peuvent fonctionner en mode photovoltaïque, évitant la nécessité d'appliquer un biais f extérieurou la stimulation de la cellule optique efficace. 15

La fiabilité de la technique CSPP a déjà été démontré dans plusieurs systèmes, y compris les neurones primaires, 15,16 astrocytes, 17 lignées cellulaires secondaires 18 et tissus rétiniens explantées. 16 Dans ce travail, toutes les mesures nécessaires pour fabriquer un bio-polymère sensible à la lumière interface 19 pour la stimulation optique de systèmes in vitro sont décrits en détail. Comme une étude de cas, un système photovoltaïque mélange organique prototypique de la région régulière poly (3-hexylthiophène) (rr-P3HT), fonctionnant comme le donneur d'électrons, et d'ester phényl-C61-butyrique-acide-méthyle (PCBM), agissant en tant que accepteur d'électrons est utilisé. Comme le système biologique, des cellules de rein embryonnaire humain (HEK-293) sont utilisées. Un exemple d'un protocole de photostimulation avec l'enregistrement relatif de l'activité des cellules par l'intermédiaire de mesures électrophysiologiques est fourni.

La plate-forme décritest cependant de validité générale, et il peut facilement être étendue à l'utilisation d'autres polymères conjugués (en ajustant convenablement le procédé en solution de préparation et les paramètres de dépôt), différents types de cellules (par correctement changeant le protocole de culture de cellules, la procédure et le temps requis placage pour l'ensemencement et la prolifération cellulaire) et des protocoles de stimulation différentes (longueur d'onde de la lumière, la fréquence et la durée des stimuli, densité de photoexcitation).

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Protocole

1. Préparation des substrats photoactifs

  1. Préparer une P3HT: PCBM solution (1: 1 en poids / poids) dans du chlorobenzène à une concentration de P3HT de 20 g / L. Mélanger la solution avec un agitateur magnétique pendant au moins 4 heures à 60 ° C. Considérons un volume de 150 ul de solution de substrat à chaque être préparé.
  2. Lames propres de ITO verre (= 10 Ω / m² de R, 18x18 mm 2, 170 um d'épaisseur) avec bains consécutifs d'eau déminéralisée, l'acétone et l'isopropanol dans un appareil à ultrasons (10 min pour chaque étape). Sécher les lamelles avec un pistolet d'azote. Mettre les échantillons dans un nettoyeur à plasma à 100 W pendant 10 min.
  3. Déposer un film mince de la couche active sur les substrats nettoyés par spin-coating.
    1. Avec une pointe de diamant, couper une lame de verre de microscope, (épaisseur ≈ 1 mm) pour les mêmes dimensions latérales des substrats ITO. Retirez le P3HT: PCBM solution de la plaque de cuisson et laisser refroidir à température ambiante.
    2. Définir un deux-steps programme spin-coucheuse: i) 30 secondes à 800 tours par minute; ii) 30 secondes à 1600 tours par minute. Placer la lame sur le mandrin de la spin-coucheuse et commencer le vide pour le fixer. Mettre une goutte d'acétone sur la diapositive et ensuite le substrat nettoyé, avec le côté revêtu d'ITO vers le haut. Commencez la rotation de spin-coucheuse pour se débarrasser de l'excès d'acétone.
    3. Mettez 150 pi de P3HT: PCBM solution sur les substrats et recommencer le spin-coucheuse (utiliser le même protocole décrit dans 1.3.2).
    4. Après le spin-laqueur a terminé, retirez l'échantillon et détachez soigneusement le substrat revêtu de la lame de verre. Nettoyez l'arrière du substrat avec un tampon de salle blanche trempée dans de l'acétone.
      Remarque: Les supports photosensibles peuvent être stockés pendant quelques jours dans une boîte sombre jusqu'à utilisation. Pour de plus longues périodes, les maintenir dans une boîte à gants avec un gaz inerte.

2. Préparation du milieu de culture cellulaire et l'électrophysiologie Solutions

  1. Préparation du milieu de croissance complet (CGM) pourCellules HEK-293: Dulbecco modifié Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) inactivé à la chaleur non, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Stériliser le moyen d'un système de filtration de 0,2 um et conserver à 4 ° C.
  2. Préparer la solution extracellulaire dans l'eau ultra-pure (concentrations en mM): 135 NaCl, KCl 5,4, 5 HEPES, 10 glucose, 1,8 CaCl2, MgCl2 1. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser la solution avec un système de filtration de 0,2 um et conserver à 4 ° C.
  3. Préparer la solution intracellulaire dans l'eau ultra-pure (concentrations en mM): 12 KCl, 125 K-gluconate, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Notez que l'ATP Na 2 est sensible à la chaleur et ajouter en dernier. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser la solution avec un système de filtration de 0,2 um, aliquote de 1 ml tubes et conserver à -20 ° C.

3. Placage des cellules HEK-293sur les substrats actifs

  1. Placez le substrat photosensible dans un bécher de verre recouverte d'aluminium ou une boîte de Pétri fermée et mis dans un four à 120 ° C pendant 2 heures pour la stérilisation. Partir de ce moment, effectuer toutes les opérations dans des conditions stériles. Mettre les échantillons dans une hotte stérile et laissez-les refroidir.
  2. Revêtir le substrat avec une couche photosensible d'adhérence pour réduire le caractère hydrophobe de la surface et pour favoriser l'adhérence cellulaire.
    1. Placez les substrats actifs dans une boîte de Pétri de P35 ou une plaque multipuits 6. Compte tenu du caractère hydrophobe de la couche de polymère conjugué, Faites un polydiméthylsiloxane (PDMS) et de fixer l'échantillon et confiner les solutions.
      1. Mélanger PDMS et d'un catalyseur à 10: 1 proportion avec une baguette de verre pour obtenir une suspension visqueuse.
      2. Verser la pâte dans une plaque multi-puits 6, distribution d'un montant suffisant pour couvrir la moitié de chaque puits.
      3. Attendez pour la polymérisation PDMS à TA.
      4. Couper les PDMS durcis au milieu pour bénéficier du droit àining une forme carrée de la même dimension de l'échantillon de polymère.
      5. Stériliser les PDMS puits par immersion dans un mélange éthanol-eau de 70% pendant au moins 30 min.
    2. Si vous utilisez bien les PDMS, gratter la couche photosensible long de la frontière du puits avec des pincettes pointues, afin d'éviter le détachement de la totalité de la couche lors du retrait des PDMS bien après la culture de cellules.
    3. Couvrir toute la surface de chaque échantillon avec une solution de fibronectine (2 mg / L dans du PBS). Un volume entre 500-750 ul par échantillon est généralement suffisant si un PDMS puits est utilisée (surface claire du bien: 15x15 mm 2). Sans les PDMS ainsi, environ 2 ml d'une solution de fibronectine sont nécessaires pour immerger complètement l'échantillon; attention à ce que le substrat ne flotte pas, tout en ajoutant la solution. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant au moins 1 heure.
    4. Retirer la solution de fibronectine avec une pipette en verre et laver une fois avec 2 ml de PBS.
  3. Plmangé cellules HEK-293 sur des échantillons de fibronectine traitées à une densité de 15.000 cellules / cm2 dans du milieu de croissance complet. Utiliser un volume de 750-1,000 ul de CGM pour chaque échantillon si un PDMS bien est utilisé, autrement 2-3 ml de CGM sont nécessaires. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 à 48 heures.

4. optique protocole Stimulation et électrophysiologiques Mesures

  1. Mettez la solution extracellulaire dans un bain d'eau à 37 ° C à thermaliser; décongeler la solution intracellulaire, le mettre dans une seringue de 1 ml avec une aiguille 34 gauge et le garder en contact avec de la glace pour éviter la dégradation de l'ATP.
  2. Prenez un substrat revêtu de cellules de l'incubateur, en enlevant soigneusement les PDMS bien si elle est présente. Retirer le milieu de croissance avec une pipette en verre et rinçage de l'échantillon avec la solution extracellulaire. Procéder lentement pour éviter le détachement des cellules.
  3. Mettre l'appareil dans le porte-échantillon de la station d'électrophysiologie avec solutio extracellulairen et l'électrode de référence. Préparer micropipettes de verre frais de patch-clamp avec un extracteur (résistance idéale est dans la gamme 2-4 MQ). Remplissez la moitié de la pipette avec la solution intracellulaire et le monter sur le micromanipulateur.
  4. Cherchez une cellule saine de patcher sur le dispositif. Pour éviter l'excitation involontaire du substrat photosensible, en utilisant un éclairage infrarouge pour l'imagerie, en plaçant un filtre passe-longueur d'onde (par exemple, une longueur d'onde de coupure λ = 750 nm peut être utilisée pour les polymères absorbant dans le visible) devant le dispositif d'éclairage de microscope.
  5. Patch la cellule sélectionnée et appliquer le protocole souhaité pour la stimulation optique en fournissant la lumière à l'échantillon via le trajet d'excitation de fluorescence du microscope (Figure 1). Une description détaillée du protocole de patch-clamp peut être trouvé dans la référence 20.
    1. Positionner la pipette de patch à proximité immédiate de la membrane cellulaire avec un manipulateur micrométrique. Pendant le positionnement, appliquer overpressure à la pipette afin d'éviter la saleté qui adhère à la pointe. La pipette devrait être de quelques microns au-dessus de la cellule.
    2. Commencer à abaisser la pipette vers la membrane cellulaire tout en contrôlant la résistance de la pipette sur le logiciel de contrôle de patch. Lorsque la résistance de la pipette a augmenté d'environ 1 MQ, éliminer la surpression à partir de la pipette tout en appliquant une légère aspiration, afin de former la gigaseal entre la pipette et la membrane cellulaire (par exemple, la résistance mesurée devrait augmenter à des valeurs supérieures à 1 GQ) .
    3. Appliquer un potentiel négatif à la pipette à proximité de la cellule attendue potentiel de repos (pour HEK293 cellule un potentiel de -40 mV peut être utilisé) pour aider à stabiliser le joint. Compenser les transitoires capacitifs en raison de la capacité de la pipette avec les commandes relatives à l'amplificateur de patch et / ou le logiciel de contrôle du patch.
    4. Casser la membrane pour permettre un accès électrique à la cytoplasme de la cellule en appliquant une impulsion d'aspiration brève et intenseà la pipette. Réglez l'amplificateur de patch clamp en mode de courant (I = 0, autrement dit, sans courant injecté dans la cellule) afin de suivre le potentiel de la membrane cellulaire. Attendez quelques minutes pour voir si le potentiel de la cellule est stable.
    5. Appliquer le protocole d'illumination désirée de la cellule et d'enregistrer l'effet sur le potentiel de membrane.
      Remarque: L'éclairage peut être expédié à l'échantillon, soit par le bas ou par le haut, en fonction de l'architecture du microscope.
      1. Sélectionner une longueur d'onde d'excitation qui est bien absorbé par le matériau actif; pour le P3HT: PCBM mélange, une longueur d'onde dans la gamme 450-600 nm peut être utilisé. Densités de photoexcitation appropriées sont dans la gamme 10-100 mW / mm 2.
        Remarque: courtes impulsions de lumière (ci-dessous 10-20 msec) résultat dans une dépolarisation transitoire de la cellule, tout avec un éclairage prolongé (plusieurs centaines de millisecondes ou des impulsions plus longues) une hyperpolarisation soutenue est observée jusqu'à ce que la lumière est éteinte.

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Résultats

Les cellules peuvent être facilement cultivées sur P3HT: PCBM substrats, à condition qu 'une couche d'adhérence est déposée convenable (tel que la fibronectine utilisé dans l'étape 3.2 du protocole décrit). P3HT: PCBM pics d'absorption optique dans la partie verte du spectre visible; cependant, d'autres polymères conjugués sensibles à la lumière peuvent être sélectionnés, en fonction de la gamme de longueurs d'onde de photostimulation préféré (figure 2).

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Discussion

Les étapes critiques du protocole rapporté pour in vitro stimulation optique de cellules concernent principalement le choix du polymère sensible à la lumière, les paramètres de stérilisation thermique, l'intensité et la durée des stimuli lumineux. Un P3HT: PCBM film mince a été choisi ici, car il garantit une bonne stabilité temporelle et électrochimique. Cependant, il faut noter que tous les polymères sensibles à la lumière peuvent offrir des performances analogiques, 22 plus précisément lors de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le travail a été soutenu par l’UE dans le cadre du projet FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA,

Téléthon - Italie (subventions GGP12033 et GGP14022), Fondazione Cariplo (subvention ID 2013-0738).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
rr-P3HTSigma Aldrich698989-5G
Substrats revêtus d’ITONano-CSIT10300100
FibronectineSigma AldrichF1141
chlorobenzèneSigma Aldrich319996
PCBMNano-CNano-CPCBM-BF
acétone  ;Sigma Aldrich270725
alcool isopropyliqueSigma Aldrich563935
cellules HEKLGC standards srlATCC-CRL-1573
HEPESSigma AldrichH0887
PBSSigma AldrichP5244
E-MEMLGC standards srlATCC-30-2003
EDTASigma AldrichE8008-FBS
LGC normes srlATCC-30-2020

Références

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