Clonage fonctionnelle en utilisant un Xenopus Système d'expression de l'ovocyte

Summary

Nous décrivons un système d’ovocytes et de coiffes animales de xénope pour le clonage d’expression de gènes capables d’induire une réponse chez l’ectoderme compétent, et discutons des techniques pour l’analyse ultérieure de ces gènes. Ce système est utile dans l’identification fonctionnelle d’un large éventail de produits géniques.

Abstract

L’identification des gènes responsables de l’induction embryonnaire pose un certain nombre de défis ; pour n’en nommer que quelques-uns, les molécules d’intérêt sécrétées peuvent être peu abondantes, peuvent ne pas être sécrétées mais attachées à la ou aux cellules de signalisation, ou peuvent nécessiter la présence de partenaires de liaison ou de molécules régulatrices en amont. Ainsi, dans la recherche de produits géniques capables d’induire une réponse inductive précoce du cristallin chez l’ectoderme compétent, nous avons utilisé un système de clonage d’expression qui permettrait d’identifier les facteurs paracrines ou juxtacrines ainsi que les protéines transcriptionnelles ou autres protéines régulatrices. Des flaques d’ARNm ont été injectées dans les ovocytes de xénope, et le tissu répondant a été placé directement sur les ovocytes et co-cultivé. Suite au clonage fonctionnel de ldb1 à partir d’une banque d’ADNc au stade de la plaque neurale basée sur sa capacité à susciter l’expression du marqueur précoce de placode du cristallin foxe3 dans un ectoderme de capuchon animal compétent pour le cristallin, nous avons caractérisé le profil d’expression de l’ARNm et analysé la progression du développement après surexpression ou knockdown de ldb1. Ce système est adapté à une très grande variété de contextes où l’identification d’un inducteur ou de ses molécules régulatrices en amont est recherchée à l’aide d’une réponse fonctionnelle dans un tissu compétent.

Introduction

Les approches génétiques avancées pour identifier les gènes d’intérêt par leur fonction ou leur perte de fonction^1,2 font partie intégrante de la compréhension des événements complexes de structuration du développement. Associé à de puissantes techniques de génétique inverse disponibles pour un éventail toujours plus large de systèmes et de chercheurs^{3 à 5}, il est maintenant possible d’identifier des gènes ayant un rôle fonctionnel clé dans une voie, puis d’élucider cette fonction au niveau cellulaire et en interaction avec d’autres produits géniques. Une approche d’identification fonctionnelle des gènes d’intérêt qui a donné lieu à de nombreuses découvertes clés dans le passé est le clonage d’expression^6,7.

Notre objectif récent⁸ était d’identifier les facteurs précoces d’induction du cristallin, car il a été démontré que les premières étapes du processus d’induction du cristallin chez les vertébrés se produisent dès les stades de gastrula. À cette fin, nous avons utilisé l’ectoderme de la cape animale⁹ (stade 11-11,5¹⁰) d’embryons de xénope comme tissu répondant pour l’induction, et l’ovocyte de xénope de stade VI comme source de production des facteurs inducteurs.

Le protocole suivant s’appuie sur les protocoles de clonage d’expression et de sélection de la fratrie de Smith et Harland^6,7, également utilisés avec succès par d’autres^11-13. Dans notre système d’expression ovocytaire (utilisé pour la première fois pour la production de facteurs inducteurs par Lustig et Kirschner¹⁴), des pools de transcrits injectés capables d’amener directement ou indirectement les ovocytes à produire des facteurs qui provoquent une réponse inductive du cristallin dans l’ectoderme du chapeau animal sont sélectionnés et identifiés. Étant donné que le système est utile pour exprimer directement les molécules inductrices sécrétées (l’ARNm INHBB injecté dans l’ovocyte provoque l’induction du mésoderme dans l’ectoderme⁸ du chapeau animal compétent pour le mésoderme), nous nous attendions à l’origine à ce que la procédure de dépistage soit principalement utile pour l’identification des facteurs paracrines. Cependant, depuis que nous avons identifié un facteur nucléaire dans notre crible (ldb1⁸), il est clair que le système peut être utilisé pour identifier une grande variété de molécules telles que les facteurs régulateurs transcriptionnels ou translationnels, les miARN, les cofacteurs ou les facteurs juxtacrines.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par l'Université de Virginie institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

Remarque: La figure 1 montre une vue d'ensemble schématique des modes opératoires expérimentaux.

1. Préparation d'ovocytes

1. X. Pré-prime laevis femelles avec 150 U de jument gravide gonadotrophine sérique (PMSG) environ une semaine à l'avance de l'isolement de l'ovocyte. Injecter 1 ml 150 U / ml PMSG dans dorsale lymphatique sac avec 1 cc seringue stérile avec aiguille 29 G.
2. Préparer des solutions pour l'injection d'ovocytes et le Cap-dosage ovocyte animal.
   1. Préparer Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ exempt OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, 2,5 mM de KCl, 1,5 mM Na _{2 HPO 4,} HEPES 50 mM pH 7,2.
   2. Préparer OR2: OR2- plus 1 _mM de CaCl2 et 1 _mM de _MgCl2.
   3. Préparer OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml de BSA, 100 ug / ml de gentamycine à pH 7,8.
   4. Pré1x pare MBS: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,7 _mM de CaCl2, 1 mM de MgSO _4, 5 mM de HEPES (pH 7,8), 2,5 mM de NaHCO _3.
   5. Préparer 3% de Ficoll en 1x MBS.
   6. Préparer NAM 1x: 110 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO _{3) 2,} 1 mM de MgSO _4, 0,1 mM d'EDTA, 1 mM de NaHCO _3, 2 mM de Na _{3 PO 4} à pH 7,4.
3. Anesthésier la femelle dans une solution à 0,03% de sel de méthanesulfonate d'éthyle 3-aminobenzoate (MS222) à 0,1x MBS (première dissoudre 0,3 g dans 10 ml MS222 95% d'éthanol, puis diluer à 1 L 0,1x MBS) en plaçant grenouille solution pour 10 - 15 min ou jusqu'à ce que ne répond pas.
   1. Vérifiez que l'anesthésie est complète en tournant grenouille anesthésié sur le dos pour vous assurer qu'il ne répond pas (incomplètement grenouilles anesthésiés déplacer membres ou du corps au verso).
4. Isoler des fragments de l'ovaire par voie chirurgicale en faisant une incision abdominale à travers la peau et la paroi du corps de lame de scalpel, l'isolement du tissu ovarien avec une pinceet ciseaux. Placez fragments ovariens dans OR2-. Fermez la paroi du corps avec une suture 3-0 en soie sur une aiguille courbe de 24 mm et fermer la peau séparément avec les mêmes points de suture. Permettre la récupération des femmes dans 1 g / L aquarium sel dans l'eau.
5. En utilisant des pinces fines, tissu ovarien lacrymogènes dans les petites (10 - 20) pièces ovocytes et transfert à OR2- frais.
6. Defolliculate fragments ovariens dans 2,0 mg / ml de collagénase A en agitant doucement par OR2- sur agitateur pendant 1 heure, le transfert de la collagénase fraîche et en agitant pendant une heure supplémentaire.
7. Laver ovocytes 10 fois dans OR2 [contenant Ca ⁺⁺ / Mg ^++] en rejetant les petits ovocytes.
8. Laver ovocytes dans OCM deux fois et transférer à nouveau OCM. Isoler ovocytes Etape VI selon la taille de l'inspection visuelle des ovocytes immatures et le jeter (plus petits): Etape VI ovocytes sont plus grandes que ovocytes immatures avec même pigmentation dans l'hémisphère des animaux et sont d'environ 1,2-1,4 mm de diamètre.
9. Maintenir ovocytes à 18 - 20 ° C in OCM avant l'injection. Remarque: Les boîtes de Petri enrobées d'agarose-peuvent être utilisés pour réduire le collage des ovocytes à plat.

2. Injection d'Bibliothèque Transcriptions

1. Préparer une banque d'ADNc directionnelle ¹⁵ en utilisant l'ARN extrait à un stade approprié de développement (par exemple, stade de la plaque neurale 14 ^10). Achetez une banque d'ADNc ou de construire un utilisant un kit commercial par la liste dans les quatre étapes ci-dessous.
   1. Isoler environ 5 pg de l'ARNm en utilisant un produit pour enrichir en poly (A) + ARN (voir le tableau des matériaux) et en suivant les instructions du fabricant. Remarque: Les relevés de notes à être utilisés pour produire la banque d'ADNc peut être limitée à un tissu induire (comme la plaque neurale, après microdissection des tissus désiré), ou peuvent être à partir d'embryons entiers à un stade particulier.
   2. Produire de l'ADNc avec un kit commercial, suivant les instructions du fabricant.
   3. Ligaturer environ 20 ng d'ADNc dans un vector inclus avec le kit commercial ou d'un autre vecteur approprié. Un vecteur plasmidique approprié comprend des séquences de stabilité de l'ARNm tel que 5 'et β-globine 3 poly (A) + pCS2 (séquences, pTnT, pCS105).
   4. Transformez ligature dans des cellules bactériennes compétentes en utilisant le protocole recommandé de fournisseur pour la transformation de choc thermique.
      Remarque: Alternativement, une collection de cadre de lecture ouvert (ORFéome) clones est disponible dans le commerce et peut être utilisé pour générer des transcriptions pour injection.
2. Préparer 10 pools de plasmides sur 10 ^trois à ^quatre complexité dix (10 ^quatre à dix complexité de ^cinq au total). Cela représente 10 plaques avec 1.000 - 10.000 colonies chacun.
   1. Bibliothèque de plaque de culture sur 10 plaques de 15 cm LB-ampicilline, grandir 12 - 18 h à 37 ° C, et de recueillir des colonies de chaque par une légère pression avec un épandeur de verre dans 7 ml LB.
   2. Préparer un stock de glycérol de 0,5 ml (ajouter à 0,2 ml de glycérol stérile et conserver à -20 &# 730; C), et d'utiliser les 6,5 ml restants pour préparer l'ADN avec un standard du commerce kit ADN miniprep en suivant les instructions du fabricant.
3. Linéariser l'ADN plasmidique groupé (1.0 - 2.0 ug) avec restriction appropriée enzyme digérer ¹⁶ à 37 ° C pour les 1 - 1,5 h. Isoler l'ADN linéarisé par extraction au phénol / chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol et remise en suspension dans de l'eau selon les spécifications de la trousse d'ARN polymérase utilisée. Synthétiser l'ARN sens avec un kit d'ARN polymérase commerciale suivant les instructions du fabricant.
4. Préparer aiguilles pour la micro-injection (à l'aide d'un extracteur d'aiguille avec un tube capillaire en verre) d'environ 20 um de diamètre; mesurer pointes d'aiguille sur un microscope composé avec un micromètre oculaire calibré. Remarque: Les paramètres de traction aiguille doit être déterminée empiriquement pour produire une aiguille avec une pointe fine telle que lorsque rompu avec une pince fine donne la taille de la pointe souhaitée.
5. Préparer (pousser argile danscouche uniforme sur le fond du plat) argile bordée 35 x 10 mm boîtes de Pétri avec des rainures parallèles pour tenir ovocytes en place lors de la micro-injection; produire des rainures avec une sonde de centre commercial ou pipette Pasteur fusionné à la pointe de la flamme. Comme alternative à l'argile, de préparer des plats agarose faisant indentations avec un moule en élastomère ^17. Ovocytes de transfert avec une pipette de gros calibre à 3% de Ficoll dans 1X MBS (environ 2 ml) en rangées dans les plats d'argile bordée.
6. Utilisation microinjecteur, remplissez aiguille avec 1 ng / nl ARN et de régler la balance pour produire une légère pression positive (pour empêcher l'élaboration de cytoplasme de l'ovocyte).
7. Injecter ovocytes avec environ 20 nl d'ARN dans la région équatoriale. Comptez 1 h pour les ovocytes injectés de rester dans Ficoll-MBS, puis transférer doucement pour 1x MBS. Incuber pendant 8-24 heures à 20 ° C avant l'essai de coiffe animale.

3. Animal Cap Assay

1. Préparer 3 / 4x NAM et obtenir des pinces fines, boucle de cheveux, des fragments de lamelle incurvée, dis d'argile bordéehes avec indentations en forme de coupe de tenir ovocytes. Assurez fragments lamelle courbes par briser des lamelles de verre en petits fragments (environ 1 - 2 mm x 2 - 4 mm) et passant par flamme jusqu'à ce que les bords polonais et statisme, la production d'une pièce courbe.
2. Fertiliser X. laevis oeufs ¹⁸ in vitro ou par accouplement naturel et de la culture à Gastrula stades (10 - 11 h après la fécondation à la température ambiante) à 0,1x MBS avant le tri par étape; recueillir mi-gastrula (stade de 11 à 11,5) ¹⁰ embryons.
3. Embryons de transfert à une boîte de Pétri environ à moitié plein avec 3 / 4x Nam. L'utilisation de deux paires de pinces fines, retirez la fécondation (vitelline) membrane de gastrulas.
4. Transfert ovocytes à 3 / 4x NAM (environ 2 ml) dans les plats d'argile bordée et d'immobiliser des impressions individuelles dans l'argile, la production d'impressions pour accueillir embryons individuels que des rainures ont été décrits ci-dessus.
5. Embryons de transfert aux plats d'argile bordée et coupés calottes animales hors gastrulae utilisant deux paires de pinces fines. Prenez soin d'isoler l'animal bouchon ectoderme seulement et pas les tissus équatoriale ^18.
6. Placez un bouchon d'animaux sur l'hémisphère animal de chaque ovocyte avec la surface intérieure de la coiffe des animaux en contact avec l'ovocyte. Maintenir recombinants ensemble en appliquant fragment de lamelle de verre incurvée et en appliquant une pression vers le bas sur le verre, aplatissant l'ectoderme que les contacts de la lamelle de l'argile (calottes animales peut rester ouvert avec la couche intérieure exposée à la surface de l'ovocyte pour 6-8 heures ou plus ).
   Remarque: vous pouvez placer le capuchon de l'animal dans une indentation d'argile avec sa surface intérieure orientée vers le haut et placez un ovocyte sur le bouchon; sécuriser le recombinant avec de petites extensions d'argile.
7. Culture à 20 ° C jusqu'à ce que les embryons de contrôle atteignent les désire étape pour le dosage.
8. Recombinant séparée en enlevant lamelle / argile et l'isolement de l'ectoderme avec une pince et une boucle de cheveux.
9. Fixer fragments ectodermiques pendant 1 h dans MEMFA (3,8%formaldehyde dans du MEM [0,1 M de MOPS, pH 7,4, 2 mM d'EGTA, 1 mM de MgSO et _4]).
10. Fragments de transfert (et d'embryons de contrôle) de MEMFA en éthanol et conserver à -20 ° C.

4. Analyse de la réponse dans Ectoderme par hybridation in situ (ISH)

1. Préparer des solutions pour ISH.
   1. Préparer 1x PBS: 0,01 M tampon phosphate salin, NaCl 0,138 M, pH 7,4
   2. Préparer PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20
   3. Préparer la solution de 100x Denhart: BSA 2%, 2% Polyvinylpyrrolidone, 2% de Ficoll
   4. Préparer tampon d'hybridation: 50% de formamide, 5x SSC, 1 mg / ml torula ARN de levure, 1 ug / ml d'héparine, la solution de 1 x Denhart, 0,1% de Tween-20, 0,1% de CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC H ₂ O
   5. Préparer le tampon acide maléique (MAB): acide maléique 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5
   6. Préparer MAB + bloc: MAB, 2% de réactif de blocage (la chaleur à 60 ° C pour dissoudre)
   7. Préparer la phosphatase alcaline (AP) tampon: Tris 100 mMpH 9,5, 50 _mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween, dH ₂ O
2. Préparer l'ARN Probe.
   1. L'utilisation d'un kit d'ARN polymérase commerciale et de creuser-NTP mélange, ajouter à un tube de 1,5 ml (50 de réaction pi): 25,5 pi DEPC H _{2 O,} 10 pl Transcription Buffer 5X, 2,5 ul 10x dig-NTP Mix, 5 pl 100 mM TNT, 2 pl RNAsin, 2 pl linéarisé matrice d'ADN (~ 1 ug / ul), 3 pi ARN polymérase et incuber 37 ° C pendant 90 min.
   2. Ajouter 2 ul ARN polymérase et incuber 37 ° C pendant 60 min.
   3. Vérifiez 2 pi de réaction sur gel d'agarose 1%.
   4. Ajouter 1 ul de DNase RQ1 RNase-Free et incuber 37 ° C pendant 20 min.
   5. Précipiter la sonde en ajoutant 50 ul DEPC-H ₂ O, 25 ul d'acétate d'ammonium 10 M et 313 ul d'éthanol. Conserver à -20 ° C pendant la nuit (O / N), puis récupérer l'ARN par centrifugation à 13 800 g pendant 20 min. Laver avec 500 ul 75% d'éthanol, centrifuger brièvement, retirezéthanol et permettre culot sécher à l'air. Ajouter 50 ul DEPC H ₂ O.
   6. Ajouter tampon d'hybridation à une concentration finale de ~ 0,5 pg / pl.
3. Préparer tissus pour l'hybridation. Sauf indication contraire, remplir les flacons vers le haut à chaque changement de solution décrites (environ 4 ml).
   1. Retirer éthanol à partir de flacons et de transfert d'embryons dans 75% d'éthanol / PTW, puis 50% d'éthanol / PTW chacune pendant 10 minutes, à l'horizontale sur rocker.
   2. Laver trois fois dans PTW pendant 5 min sur chaque bascule.
   3. Transfert à 10 ug / ul de traitement à la protéinase K dans PTW; tubes de roche à la verticale de 15 min.
   4. Rincer deux fois 10 minutes dans chacune des 0,1 M pH 7,8 Triéthanolamine - Rock tubes verticalement.
   5. Ajouter 12,5 pi d'anhydride acétique à des tubes et de la roche verticale 5 min. Répéter l'opération avec 12,5 pi anhydride acétique supplémentaire pour 5 min.
   6. Laver à PTW 5 min verticalement sur rocker.
   7. Refixer dans 4% de paraformaldehyde 20 min à bascule. Chaleur tampon d'hybridationà 60 ° C.
   8. Laver trois fois dans PTW pendant 5 min sur chaque bascule.
   9. Retirez tous mais ~ 1 ml de PTW de chaque tube et ajouter 250 Buffer Hyb ul; agiter doucement tubes pour mélanger. Tubes Rock verticalement 5 min.
   10. Remplacez-le par 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) et agiter doucement à 60 ° C 10 min. Remplacer avec le tampon Hyb frais et agiter à 60 ° C de deux à 4 h.
   11. Sonde thermique (1 ml à 0,5 ug / ul dans du tampon Hyb) à 60 ° C (3 min). Retirer Hyb Buffer et ajoutez sonde pour tubes. Agiter doucement O / N à 60 ° C.
4. Préparer tissus pour anticorps.
   1. Tampons Hyb chaleureux et 2x SSC + 0,1% de Tween-20 solutions à 60 ° C.
   2. Remplacer solution de sonde avec Hyb Buffer (sauf sondes à -20 ° C pendant 2 - 3x réutilisation). Lavage à 60 ° C pendant 10 min.
   3. Laver trois fois à 60 ° C dans 2x SSC-Tween (20 min chacun avec agitation).
   4. Laver trois fois à 60 ° C dans 0,2x SSC-Tween (20 min chacun avec agitation).
   5. Laver deux fois dans MAB (RT) pendant 15 min sur chaque bascule à l'horizontale.
   6. Ajouter 1 ml MAB + bloc. Lavez 2 h verticalement sur rocker.
   7. Transfert à 1 ml MAB + bloc contenant un anti-digoxygénine-AP 1 / 2.000. Roche verticalement à 4 CO / N.
5. Préparer tissus pour Réactif couleur.
   1. Remplacer solution d'anticorps avec le MAB; laver trois fois en 5 min MAB horizontalement sur chaque bascule.
   2. Laver trois fois dans MAB 1 h chaque horizontalement sur rocker.
   3. Laver deux fois dans du tampon AP 10 min chaque bascule à l'horizontale sur.
   4. Transfert tissu à multiples puits plateau en plastique, retirez AP tampon et ajoutez BM réactif Violet (~ 1 ml). Laisser réaction de se dérouler dans l'obscurité 5 min à O / N.
   5. Lorsque coloration appropriée est atteint, transférer le tissu dans des flacons de PTW. Laver deux fois 10 minutes dans chacune des deux-roues motorisés sur rocker.
   6. Fixer dans la solution de Bouin à 4 CO / N sur rocker.
   7. Laver Bouin avec trois éthanol à 70% / 30% lavages PTW à TA. Procéder to capture d'image en utilisant épi-illumination et une caméra de microscope monté, le blanchiment si nécessaire ^18.

5. Sib sélection et clonage

1. Sélectionnez piscine avec l'activité la plus élevée (plus de réponse dans le tissu ectodermique).
2. Titrer (diluer avec LB à une densité adéquate) le stock de glycérol pour la piscine avec l'activité la plus élevée et de la plaque sur dix nouvelles plaques avec environ un dixième des colonies de l'étape précédente (en utilisant l'article 2 dans le protocole ci-dessus).
3. Réduire la taille de la piscine jusqu'à ce que l'activité est imputable à une seule colonie.
4. Obtenir la séquence d'ADN en utilisant des amorces classiques dans le vecteur.

Results

En réponse à l'expression de l'ARNm injecté dans des ovocytes, tissu de coiffe animale répondant a été analysé pour déterminer l'expression de otx2 par hybridation in situ (Figure 2 et tableau 1); otx2 est exprimé dans la lentille présomptif ectoderme (PLE) de fermeture du tube neural grâce à lentille placode épaississement ^19. Cependant, depuis otx2 est également exprimé dans l'ectoderme neural antérieur ainsi que ...

Discussion

Le procédé décrit ici pour le clonage fonctionnel de gènes capables d'induire une réponse dans l'ectoderme compétent peut être utilisée pour identifier une vaste gamme de produits de gènes. Cette méthode se développe sur le travail passé en combinant des analyses de tissus induisant avec des techniques d'expression de clonage. Nous utilisons les voies métaboliques de l'ovocyte de Xenopus en tant que source de production de facteurs induisant, directement ou indirectement, suite à l'injection...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101	Études de développement d’anticorps Banque d’hybridomes	12/101	Anticorps monoclonal pour la détection du tissu musculaire
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	pour ISH
Anhydride acétique	Sigma	A6404	pour ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	pour ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Purification de l’ADN plasmidique
Réactif de blocage	Roche	11096176001	pour ISH
BM Purple	Roche	11442074001	pour
ISH Boekel Four d’hybridation	Fisher Scientific	13-245-121	pour ISH
Bouin’s Solution	Sigma	HT10132	pour ISH
BSA	Sigma	A9647	pour OCM
CHAPS	Sigma	C3023	pour ISH
Collagénase A	Roche	10103578001	Défolliculation des ovocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryons
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	pour ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	pour sondes ISH
Pince Dumont #5	Precision Instruments	500233	pour enveloppe Vitelline
élimination Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthésique
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	pour milieu d’injection
Formamide	Sigma	F9037	pour ISH
Sulfate de gentamicine	Sigma	G1914	pour OCM
Capillaires en verre	World Precision Instruments	4878	3,5" de long, I,D, 0,530 mm
Flacons d’échantillons en verre	Fisher Scientific	06-408B	pour ISH
Boucle			Cheveux fixés dans une pipette pasteur pour la manipulation tissulaire
Héparine sel de sodium	Sigma	H4784	pour
ISH Injecteur Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microinjecteur contrôlé par microprocesseur
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Sel pour la récupération des grenouilles
IRBG XGC Xenopus vérifié caméra pleine longueur ADNc	Source Bioscience	989_IRBG	bibliothèque d’ADNc  ;
Plaques d’agar LB avec 100 & micro ; g/ml Ampicilline	Teknova	L5004	Plaques LB-Amp pré-coulées de 150 mm pour la sélection de la fratrie
LB Luria Broth Teknova		L8650	LB pour la collecte de colonies dans la fratrie Sélection de plaques et dilution des cultures Kit d’isolement
magnétique de l’ARNm	New England BioLabs	S1550S	pour l’isolement de l’ARN enrichi en poly(A)
Acide maléique	Sigma	M0375	pour ISH
Micromanipulateur manuel Microfil	World Precision Instruments	M3310R	Micromanipulateur manuel
Mélangeur à nutation	Fisher Scientific	22-363-152	Bascule pour ISH
Permoplast	Nasco SB33495M		Argile pour boîtes d’injection et de dissection
Saline tamponnée au phosphate	Sigma	P5368	pour ISH
PMSG	Sigma	G4877	pour stimuler le développement des ovocytes
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	pour ISH
Extracteur programmable	World Precision Instruments	PUL-1000	Extracteur d’aiguille de micropipette
Proteinase K	Sigma	P6556	pour ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	Construction d’une bibliothèque d’ADNc
de combinaison de ribosonde Promega		P1450	in vitro transcription
Exposant Full-Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	pour la construction de banques d’ADNc
Sutures, 3-0 soie	Fisher Scientific	19-037-516	Fil de suture et aiguille pour l’ablation post-ovocytaire
Torula RNA	Sigma	R3629	pour ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	pour ISH
Tween 20	Sigma	P9416	pour ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	kit alternatif pour la construction de banques d’ADNc
Clones Xenopus Full ORF Entry - ORFeome	Collaboration Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Cellules ultracompétentes	Agilent Technologies	200150	cellules pour la transformation de l’ADNc bibliothèque