Simultanée à deux photons In Vivo Imagerie d'entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

Summary

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée transgénique Thy1-GFP. Cette approche est combinée à l’injection d’un virus adéno-associé exprimant mCherry dans l’hippocampe dorsal. Ces techniques permettent un suivi à long terme de la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Abstract

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones du cortex rétrosplénial (RSC) de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée de souris transgéniques Thy1-GFP. Cette approche permet d’étudier la corrélation entre les manipulations comportementales et les modifications de la morphologie neuronale in vivo.

La procédure d’implantation de la fenêtre crânienne a été considérée comme limitée uniquement aux régions du cortex facilement accessibles telles que le champ du tonneau. Notre approche permet de visualiser les neurones dans le RSC hautement vascularisé. La RSC est un élément important du circuit cérébral responsable de la mémoire spatiale, auparavant considéré comme problématique pour l’imagerie à deux photons in vivo.

L’implantation de la fenêtre crânienne sur le RSC est associée à une injection du virus adéno-associé recombinant exprimant mCherry (rAAV^mCherry) dans l’hippocampe dorsal. La mCherry exprimée se propage aux projections axonales de l’hippocampe vers la RSC, permettant de visualiser les changements dans les boutons axonaux présynaptiques et les épines dendritiques postsynaptiques dans le cortex.

Cette technique permet de surveiller à long terme la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Introduction

La microscopie à deux photons a révolutionné l'observation de l'activité cérébrale dans la vie et de se comporter animaux. Depuis son introduction en 1990 , il a rapidement gagné en popularité et est maintenant mis en œuvre comme l' une des approches les plus intéressantes et novatrices en vue de l' examen de nombreux aspects de l' activité cérébrale in vivo ^1,2. Ces applications comprennent des mesures du flux sanguin, l' activation des neurones (par exemple, en utilisant des indicateurs de niveau de calcium ou des gènes précoces immédiats expression) et la morphologie des cellules neuronales. Un nombre croissant de laboratoires utilisent des microscopes à deux photons, la mise en œuvre de la technique à travers le monde scientifique comme une nouvelle norme pour l'imagerie in vivo du cerveau.

L'approche standard consiste à l' implantation de la fenêtre crânienne (un trou rond dans le crâne recouvert d'un couvercle en verre) sur le canon ou le cortex visuel du cerveau de la souris ^3. Ensuite, selon le protocole expérimental, le MOUSE subit une série de visualisation et des séances de formation de comportement, ce qui permet de suivre l'évolution de l'activité du cerveau et de la morphologie neuronale au cours du temps ^4,5. Dans les deux cas, la craniotomie affecte uniquement l'os pariétal, sans traverser les sutures. Il est notoire que le principal inconvénient de cette technique est limitée à son application cortexes facilement accessible tel que le canon ou le cortex visuel. Implantation de la fenêtre crânienne par rapport aux autres régions pose beaucoup de difficultés, en raison de saignements excessifs et / ou entrave spatiale.

Dans cet article , nous proposons l'implantation de la fenêtre crânienne au- dessus du cortex rétrosplénial (RSC) comme une autre région d'intérêt possible pour les deux photons en microscopie in vivo ^6. RSC est un élément important du circuit responsable de la formation de la mémoire spatiale du cerveau. Anatomiquement, RSC est une partie d'un réseau neuronal de connexion corticale, hippocampique et régions thalamiques ^7. C'estfortement impliqué dans une gamme de comportements, tels que l' apprentissage spatial et de l' extinction, ainsi que la navigation spatiale ^6.

Afin de visualiser les changements morphologiques des neurones , nous utilisons une lignée de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur de Thy1. Chez ces souris, la GFP est exprimée dans environ 10% des neurones dans le cerveau permettant une visualisation claire des axones et des dendrites corticaux utilisant microscopie à deux photons ^8. Une autre innovation que nous proposons est l'injection d'un virus adéno-associé recombinant de sérotype 01/02 (rAAV2 / 1) codant pour une protéine fluorescente rouge (mCherry) sous une CaMKII promoteur spécifique des neurones ⁹ dans les structures plus profondes du cerveau faisant saillie vers le RSC telles que l'hippocampe. L'expression de rAAV2 / 1 ^mCherry dans l'hippocampe de souris Thy1-GFP permet la visualisation simultanée des éléments de pré- et post - synaptiques de la hippocampo-cortical synapses ^10. L'expression rAAV mécanique de mCherry nécessite deux à trois semaines pour la protéine d'atteindre un niveau suffisant dans les terminaisons axonales. Cette période est conforme à l'heure habituelle nécessaire pour la récupération de craniotomie.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le comité d'éthique local à l'Institut Nencki de biologie expérimentale, Académie polonaise des sciences.

Note: Certaines des scènes dans la vidéo associée sont accélérés. Facteur de vitesse est indiqué dans ces scènes.

1. Chirurgie Préparation

1. Stériliser tous les outils, les récipients en verre pour les liquides et les tampons de coton dans l'autoclave. Utiliser des gants dispensables. Nettoyer la table chirurgicale, le cadre stéréotaxique et toute la zone environnante avec 70% d'éthanol. Utiliser un tampon chirurgical stérile pour créer un espace stérile pour tout l'équipement stérilisé. Couper Gelfoam en petits morceaux et les faire tremper dans une solution saline stérile.
   Remarque: Selon le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, l'éthanol est ni un stérilisant ni un désinfectant de haut niveau. Il ne doit être utilisé comme agent de nettoyage / de dégraissage sur des surfaces préalablement stérilisés.
2. Mettre l'animal dans echambre d'induction de e et définir le niveau de l'isoflurane à 5% et le débit d'oxygène à 2 L / min. Cette procédure devrait prendre environ 3 min.
3. Prenez l'animal hors de la chambre d'induction. Utilisez la queue ou orteil pincements afin de veiller à ce que l'animal est complètement sous sédation.
4. L'utilisation d'un trimmer précis raser les cheveux à l'arrière de la tête (entre les oreilles) jusqu'aux yeux.
5. Placer l'animal dans le cadre stéréotaxique et à stabiliser la tête avec des barres d'oreilles.
6. Définir les niveaux d'anesthésie à 1,5-2% d'isoflurane et de 0,3 L / min d'oxygène.
7. Appliquer la pommade oculaire.
8. Injecter le animale sous-cutanée avec Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) et Baytril (5 mg / kg) pour prévenir l'inflammation, de la douleur et de l'infection, respectivement.
9. Injecter la voie intramusculaire des animaux avec la dexaméthasone (0,2 mg / kg) pour empêcher un gonflement du cerveau.
   Note: Il est possible d'injecter dexaméthasone sous - cutanée ou intrapéritonéale pour prévenir les dommages musculaires.
10. Nettoyer la peau à l'aide dedes tampons de coton avec de la bétadine terile suivies de 70% d'éthanol.
11. Changez les gants et les pulvériser avec 70% d'éthanol.
    Remarque: Lors de l' utilisation des gants jetables ne pas toucher le champ stérile. Touchez l'animal seulement avec les pointes des instruments chirurgicaux stériles et des écouvillons stériles.

Chirurgie 2. Cranial Fenêtre

1. Soulever la peau avec une pince et l'aide de micro ciseaux incise la peau horizontalement le long de la base de la tête, puis oblique vers le point de front entre les yeux. Retirez le lambeau de peau.
2. Appliquer une pommade lidocaïne avec un écouvillon stérile sur le périoste pour prévenir les saignements excessifs et la douleur.
3. Utilisez des cotons-tiges stériles ou un scalpel pour enlever le périoste. Sécher le crâne avec des écouvillons stériles.
4. À l'aide d'une aiguille stérile appliquer la colle cyanoacrylate dense sur les bords de la peau pour les immobiliser afin de prévenir tout contact avec le ciment dentaire. Attendez que la colle sèche.
5. Posez une stérile de 3 mm sur lamelle til crâne en avant de la suture lambdoïde. Centre de la lamelle au RSC coordonne: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Marquez les bords de lamelle en grattant la surface du crâne avec une aiguille stérile. Mettez la lamelle dans le récipient stérile avec 70% d'éthanol.
6. Utilisez une perceuse dentaire à haute vitesse avec une petite fraise de diamètre pour décrire un cercle de 3 mm de diamètre. Nettoyer le site de forage à partir de la poussière d'os avec une solution saline stérile écouvillons trempés. Utilisez le Gelfoam et tampons pour arrêter le saignement occasionnel et nettoyer l'os.
7. Entre forage vérifier l'épaisseur de l'os avec une pince fine en touchant légèrement le cercle d'os et de vérifier sa mobilité. Gardez à l'esprit que l'os est plus épaisse sur la zone de la suture. Arrêtez le forage lorsque le cercle des os est mobile et seulement encore, mince couche d'os est laissé sur la circonférence. Nettoyez le champ opérationnel de tout le reste de la poussière de l'os avec une solution saline trempé écouvillons.
8. Déposez la solution saline stérile sur la zone de forage, couvrant la cir forécle. Retirez délicatement le cercle de l'os avec une pince fine et puis doucement mais fermement retirer l'os en le soulevant vers le haut. Veillez à ne pas fausser le cercle de l'os en le soulevant pour éviter d'endommager la dure.
9. Appliquez doucement le Gelfoam trempé dans une solution saline stérile sur la dure-mère pour aider à arrêter le saignement. Attendre jusqu'à ce que tout saignement est complètement arrêté. Retirez délicatement le Gelfoam de ne pas perturber le processus de coagulation.
   Remarque: La zone de suture est très vascularisé, de sorte que le saignement à ce point pourrait se révéler être profonde. Il est essentiel d'attendre que le temps suffisant pour que le saignement cesse complètement. Il est utile de garder le Gelfoam saline imbibés refroidi en le plaçant sur la glace.

3. Virus Injection

1. Fixer la pompe à perfusion à la tour stéréotaxique et connecter le contrôleur.
2. Insérez l'aiguille 35G dans la seringue. Rincer la seringue 10 fois avec de l'éthanol pour la stériliser et 10 fois avec une solution saline stérile pour éliminer les traces d'ethanol. Retirer les bulles d'air de la seringue. Insérer la seringue dans la pompe.
   Remarque: Pensez à utiliser d'autres désinfectants.
3. Décongeler une dose unique de rAAV2 / 1 ^mCherry préparation (10 ¹² pfu est recommandé) et le garder sur la glace. Remplir la seringue avec la solution de virus.
4. Centrer l'aiguille sur le bregma, puis insérez doucement dans l'hippocampe en utilisant les coordonnées suivantes: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Ces coordonnées seront situés près du bord de la craniotomie. Attendez 5 min pour le tissu se stabiliser.
5. Injecter 0,7 pl de la solution rAAV2 / 1 ^mCherry au taux de 50 nl / min. Attendre 10 min pour que le virus adsorber pleinement. Retirez délicatement l'aiguille. Éponger avec Gelfoam si le saignement se produit. Répéter avec le site controlatéral.

4. Cranial fenêtre Implantation

1. Poser le, lamelle stérile séchée sur le dessus de la dure-mère dans le cadre du cercle percé. Tenir la lamelle avec le forcEPS pour aplatir légèrement la dure-mère et amener coverglass 'des bords plus proche de la surface du crâne.
   Remarque: Il est possible que la lamelle perturbe le caillot et les curriculum vitae de saignement. Si tel est le cas, soulever la lamelle, placez-le dans l'alcool, sec et revenir à l'étape 2.9.
2. En utilisant une aiguille stérile appliquer la colle cyanoacrylate dense sur les bords de la lamelle de les attacher au crâne. Attendez que la colle sèche.
3. Placez une barre de fixation (M2 écrou ou une conception sur mesure) dans la partie avant du crâne. Appliquer la colle cyanoacrylate sur les bords de la barre. Attendez que la colle sèche.
   1. Placez la barre de fixation dans une position qui permettra un positionnement horizontal de la fenêtre crânienne lors de l'imagerie session. Placez-le aussi éloigné que possible de la fenêtre. Si elle est placée trop près de la fenêtre, la barre et la vis de connexion avec le support sur mesure pourrait poser comme un obstacle à l'objectif au cours du processus d'imagerie.
4. Préparer l'acrylique dentaire et l'appliquer sur la surface du crâne autour du verre. Il est utile de former une forme de cratère dans la fenêtre. Il va créer une cavité pour l'eau appliquée plus tard pour l'imagerie avec l'objectif de l'eau.
5. Créer un bouchon avec l'acrylique dentaire, couvrant le reste de la zone opérationnelle, les bords de la peau, barre de fixation, ce qui renforce le cratère autour de la fenêtre crânienne. Attendez que le ciment dentaire à durcir.
6. Retirer l'animal du cadre stéréotaxique et le mettre dans la chambre de récupération.
7. Attendez que l'animal de récupérer de la chirurgie tout en observant les fonctions physiologiques.
8. Appliquer l'analgésie post-opératoire (carprofène, 10 mg / kg) et le traitement des antibiotiques (Baytril, 5 mg / kg) pendant 48 heures.

5. Imaging

1. Démarrez le laser Ti: saphir, la mise sous tension du microscope. Le système utilisé dans cette expérience est équipée d'un laser à deux photons, un système à double BOA et GaAsP PMT.
2. Mettre l'animal dans le inducchambre de tion et induire une anesthésie.
3. Retirer l'animal de la chambre d'induction et place dans le masque d'anesthésie de gaz sous le microscope. Diminuer le débit d'oxygène à 0,3 L / min et la concentration d'isoflurane à 1,5-2%.
4. Fixer l'animal sur le cadre de microscope personnalisé avec une vis M2 (ou un autre système personnalisé). Niveau de la fenêtre crânienne.
   Remarque: Il est possible d'utiliser le système tête de fixation du fabricant de microscope, bien que le cadre personnalisé spécifique donne de meilleurs résultats (amélioration de la stabilité de la tête, le positionnement constant dans plusieurs sessions au cours d' une expérience chronique).
5. En utilisant les réglages du microscope Widefield et un centre objectif faible grossissement de la vue sur l'un des côtés du cortex rétrosplénial et de se concentrer sur la surface de la lamelle.
6. Appliquer une goutte d'eau dans le puits acrylique cratère. Basculer vers un objectif d'immersion dans l'eau à longue distance. Déplacer l'objectif vers la fenêtre crânienne jusqu'à ce que le ménisque de l'eau conconnecte l'échantillon et objectif.
7. Passez aux réglages à deux photons et commencer à numériser le sommet de l'échantillon vers le bas en utilisant le plus bas zoom. La traversée de la dure-mère sera visible comme un éclat de haute signal non spécifique.
8. Réglez les paramètres d'acquisition du microscope dans les deux canaux (GFP et mCherry) selon la puissance du signal à partir de cellules fluorescentes afin de couvrir toute la gamme dynamique.
9. Après avoir trouvé un neurone approprié (avec l'arbre dendritique séparés des autres cellules) effectuer une analyse initiale en utilisant uniquement le filterset GFP avec zoom plus bas et z-distance de 5 microns.
10. Obtenir une projection maximale de la pile numérisée et l'imprimer pour les annotations (en utilisant des couleurs inversées).
11. Réglez le zoom sur une valeur qui permettra à l'image les détails morphologiques souhaités. Image l'ensemble de l'arbre dendritique dans les canaux GFP et mCherry utilisant la projection maximale de guide.

Results

L'expression de la GFP dans un sous - ensemble de neurones dans le reporteur souris Thy1-GFP permet l'imagerie in vivo des dendrites corticales et les projections axonales locales dans le RSC. La figure 1A montre la projection maximale d'une pile d'images avec de multiples dendrites GFP-positives visibles. Le corps cellulaire est obscurcie par une artère. Figure 1B montre une image plane unique zoom (zoom numérique 3x) de la bran...

Discussion

Dans le présent document , nous présentons un protocole pour l'utilisation simultanée de deux photons dans l' imagerie in vivo des entrées synaptiques et des cibles postsynaptiques dans RSC à travers une fenêtre crânienne. La procédure d'implantation se composent de plusieurs étapes clés. Tout d'abord, l'animal est profondément anesthésié et fixé dans le cadre stéréotaxique, puis le crâne sur le RSC est amincie avec un foret le long des lignes circulaires marquées et l'os circul...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2 % préopératoire
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2 % pendant la chirurgie
Dexaméthasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2 mg/kg intramusculaire
Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg par voie sous-cutanée
Tolfedine	Vetoquinol	4%	4 mg/kg par voie sous-cutanée
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg par voie sous-cutanée
Carprofène	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg par voie sous-cutanée
Lidocaïne	Jelfa	Lignocainum	par voie topique
Lidocaïne	Jelfa	20 mg/g	par voie topique
Chirurgie
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dentaire ; REF MS0005
Pommade pour les yeux	Dedra	Lubrithal	colle topique
CA	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental	acrylique SpofaDental	Duracryl Plus
Cadre stéréotaxique	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Appareil	HSE-64-0720	de 3 mm de diamètre
	Sigmed	Keystone KVet
Barre de fixation	N/A	M2 ou M3 sur mesure peuvent être utilisés
Pince	Renex	PN-7B-SA
Micro-ciseaux	Falcon	BM.183.180
Microscope de dissection	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder Cadre de support	N/A		sur mesure
	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Unité laser : Coherent Chameleon 690-1040nm avec oscillateur paramétrique optique 1050-1300nm. Objectifs : EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 et LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Détection : les filtres passe-bande Zeiss BP 500-550 (GFP) et BP 570-610 (mCherry) séparés par un séparateur de faisceau à 560 nm et couplés à deux photodétecteurs GaAsP.
<>
Virus	de K. Deisseroth		Virus adéno-associé recombinant (rAAV) exprimant la protéine fluorescente mCherry sous le contrôle du promoteur CaMK