Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

Résumé

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée transgénique Thy1-GFP. Cette approche est combinée à l’injection d’un virus adéno-associé exprimant mCherry dans l’hippocampe dorsal. Ces techniques permettent un suivi à long terme de la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Résumé

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones du cortex rétrosplénial (RSC) de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée de souris transgéniques Thy1-GFP. Cette approche permet d’étudier la corrélation entre les manipulations comportementales et les modifications de la morphologie neuronale in vivo.

La procédure d’implantation de la fenêtre crânienne a été considérée comme limitée uniquement aux régions du cortex facilement accessibles telles que le champ du tonneau. Notre approche permet de visualiser les neurones dans le RSC hautement vascularisé. La RSC est un élément important du circuit cérébral responsable de la mémoire spatiale, auparavant considéré comme problématique pour l’imagerie à deux photons in vivo.

L’implantation de la fenêtre crânienne sur le RSC est associée à une injection du virus adéno-associé recombinant exprimant mCherry (rAAV^mCherry) dans l’hippocampe dorsal. La mCherry exprimée se propage aux projections axonales de l’hippocampe vers la RSC, permettant de visualiser les changements dans les boutons axonaux présynaptiques et les épines dendritiques postsynaptiques dans le cortex.

Cette technique permet de surveiller à long terme la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Introduction

La microscopie à deux photons a révolutionné l'observation de l'activité cérébrale dans la vie et de se comporter animaux. Depuis son introduction en 1990 , il a rapidement gagné en popularité et est maintenant mis en œuvre comme l' une des approches les plus intéressantes et novatrices en vue de l' examen de nombreux aspects de l' activité cérébrale in vivo ^1,2. Ces applications comprennent des mesures du flux sanguin, l' activation des neurones (par exemple, en utilisant des indicateurs de niveau de calcium ou des gènes précoces immédiats expression) et la morphologie des cellules neuronales. Un nombre croissant ....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le comité d'éthique local à l'Institut Nencki de biologie expérimentale, Académie polonaise des sciences.

Note: Certaines des scènes dans la vidéo associée sont accélérés. Facteur de vitesse est indiqué dans ces scènes.

1. Chirurgie Préparation

1. Stériliser tous les outils, les récipients en verre pour les liquides et les tampons de coton dans l'autoclave. Utiliser des gants dispensables. Nettoyer la table chirurgicale, le cadre stéréotaxique et toute la zone environnante avec 70% d'éthanol. Utiliser un tamp....

Résultats

L'expression de la GFP dans un sous - ensemble de neurones dans le reporteur souris Thy1-GFP permet l'imagerie in vivo des dendrites corticales et les projections axonales locales dans le RSC. La figure 1A montre la projection maximale d'une pile d'images avec de multiples dendrites GFP-positives visibles. Le corps cellulaire est obscurcie par une artère. Figure 1B montre une image plane unique zoom (zoom numérique 3x) de la bran.......

Discussion

Dans le présent document , nous présentons un protocole pour l'utilisation simultanée de deux photons dans l' imagerie in vivo des entrées synaptiques et des cibles postsynaptiques dans RSC à travers une fenêtre crânienne. La procédure d'implantation se composent de plusieurs étapes clés. Tout d'abord, l'animal est profondément anesthésié et fixé dans le cadre stéréotaxique, puis le crâne sur le RSC est amincie avec un foret le long des lignes circulaires marquées et l'os circul.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2 % préopératoire
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2 % pendant la chirurgie
Dexaméthasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2 mg/kg intramusculaire
Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg par voie sous-cutanée
Tolfedine	Vetoquinol	4%	4 mg/kg par voie sous-cutanée
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg par voie sous-cutanée
Carprofène	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg par voie sous-cutanée
Lidocaïne	Jelfa	Lignocainum	par voie topique
Lidocaïne	Jelfa	20 mg/g	par voie topique
Chirurgie
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dentaire ; REF MS0005
Pommade pour les yeux	Dedra	Lubrithal	colle topique
CA	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental	acrylique SpofaDental	Duracryl Plus
Cadre stéréotaxique	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Appareil	HSE-64-0720	de 3 mm de diamètre
	Sigmed	Keystone KVet
Barre de fixation	N/A	M2 ou M3 sur mesure peuvent être utilisés
Pince	Renex	PN-7B-SA
Micro-ciseaux	Falcon	BM.183.180
Microscope de dissection	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder Cadre de support	N/A		sur mesure
	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Unité laser : Coherent Chameleon 690-1040nm avec oscillateur paramétrique optique 1050-1300nm. Objectifs : EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 et LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Détection : les filtres passe-bande Zeiss BP 500-550 (GFP) et BP 570-610 (mCherry) séparés par un séparateur de faisceau à 560 nm et couplés à deux photodétecteurs GaAsP.
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Virus	de K. Deisseroth		Virus adéno-associé recombinant (rAAV) exprimant la protéine fluorescente mCherry sous le contrôle du promoteur CaMK

Foret dentaire Des écrous de vis Microscope à deux photons Cadeau du virus