Article de méthode

Radiomarquage et la quantification des niveaux cellulaires de phosphoinositides par chromatographie liquide haute performance couplée flux scintillation

DOI :

10.3791/53529

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6 janvier 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Phosphoinositides sont des lipides dont l'abondance relative change rapidement en réponse à divers stimuli de signalisation. Cet article décrit une méthode pour mesurer l'abondance des phosphoinositides par les cellules métaboliquement étiquetage avec 3 H- myo-inositol, suivie par l'extraction et la désacylation. Glycéro-inositides extraites sont ensuite séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance et quantifiés par scintillation de flux.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les phosphoinositides (PtdInsPs) sont des lipides de signalisation essentiels responsables du recrutement d’effecteurs spécifiques et de l’attribution d’une identité et d’une fonction moléculaires aux organites. Chacun des sept PtdInsP varie dans sa distribution et son abondance, qui sont étroitement régulées par des kinases et des phosphatases spécifiques. L’abondance des PtdInsP peut changer brusquement en réponse à divers événements de signalisation ou à une perturbation de la machinerie réglementaire. Pour comprendre comment ces événements entraînent des changements dans la quantité de PtdInsP et leur impact qui en résulte, il est important de quantifier les niveaux de PtdInsP avant et après un événement de signalisation ou entre le contrôle et les conditions anormales. Cependant, en raison de leur faible abondance et de leur similitude, il peut être difficile de quantifier les quantités relatives de chaque PtdInsP. Cet article décrit une méthode de quantification des niveaux de PtdInsP en marquant métaboliquement les cellules avec du3-H-myo-inositol, qui est incorporé dans PtdInsPs. Les phospholipides sont ensuite précipités et désacylés. Les 3-glycéro-inositides solubles qui en résultent sont ensuite extraits, séparés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et détectés par scintillation en flux. L’étiquetage et le traitement des échantillons de levure sont décrits en détail, ainsi que la configuration instrumentale de la HPLC et du scintillateur à flux. Malgré la perte d’informations structurelles concernant le contenu de la chaîne acyle, cette méthode est sensible et peut être optimisée pour quantifier simultanément les sept PtdInsP dans les cellules.

Introduction

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Les phosphoinositides (PtdInsPs) sont des phospholipides de signalisation importants qui aident à réguler une variété de fonctions cellulaires, y compris la transduction du signal, le trafic membranaire et l’expression génique, qui modulent ensuite le comportement cellulaire d’ordre supérieur tel que la division cellulaire, l’identité des organites et l’activité métabolique1-3. Il existe sept espèces de PtdInsP qui sont dérivées de la phosphorylation des positions 3, 4 et/ou 5 du groupe de tête de l’inositol du phosphatidylinositol (PtdIns), le phospholipide parent. Il est important de noter que les sept PtdInsP sont inégalement répartis et que la concentration locale de chaque espèce de PtdInsP peut augmenter ou diminuer à des sites subcellulaires spécifiques où elles se lient à un ensemble distinct d’effecteurs protéiques, ce qui permet à chaque PtdInsP de contrôler l’identité et la fonction de sa membrane hôte3,4. De plus, les niveaux de chaque PtdInsP doivent être étroitement contrôlés, car cela peut avoir un impact significatif sur l’intensité du signal produit par un PtdInsP. La localisation et les niveaux de chaque PtdInsP dépendent du ciblage et de l’activité de nombreuses kinases lipidiques, phosphatases et phospholipases qui interviennent dans la synthèse et le renouvellement de chaque PtdInsP3,4. Par conséquent, une mauvaise régulation de la machinerie régulatrice PtdInsP peut perturber la fonction cellulaire, entraînant des maladies telles que le cancer et les maladies dégénératives2,5,6. Pour bien comprendre les rôles et les fonctions des PtdInsP et de leur mécanisme de régulation, des techniques basées sur la microscopie et la biochimie ont été développées pour suivre et quantifier les PtdInsP.

Dans de nombreux cas, les PtdInsPs se lient à leurs effecteurs protéiques via un domaine protéique spécifique7-9. Ces modules protéiques conservent souvent leurs propriétés de repliement et de reconnaissance des lipides lorsqu’ils sont exprimés séparément de la protéine entière. Cela a donné naissance à des sondes PtdInsP en fusionnant un domaine protéique spécifique de liaison à PtdInsP avec une protéine fluorescente (FP) comme la protéine fluorescente verte (GFP) pour la détection subcellulaire des PtdInsP par microscopie. En effet, de nombreuses études ont utilisé des modules de protéines de liaison à PtdInsP fusionnés à FP pour identifier la localisation et la dynamique d’espèces spécifiques de PtdInsP par imagerie de cellules vivantes1,10. Par exemple, le domaine d’homologie de Pleckstrin (PH) de la phospholipase C δ1 (PLCδ1) fusionnée à la GFP reconnaît spécifiquement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] sur la membrane plasmique, tandis que des copies en tandem du domaine FYVE de l’antigène endosomique précoce 1 (EEA1) ont été utilisées pour suivre le phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) sur les endosomes10-13. Dans l’ensemble, les techniques basées sur la microscopie sont excellentes pour visualiser la localisation et la dynamique de PtdInsP, mais il y a plusieurs mises en garde, notamment que les domaines de liaison à PtdInsP peuvent également interagir avec d’autres facteurs autres que l’espèce cible de PtdInsP et qu’ils ne peuvent pas détecter les changements en dessous de la fluorescence cytosolique des sondes FP.

Les techniques biochimiques, y compris la chromatographie sur couche mince, la spectrométrie de masse et le marquage radio-isotopique, peuvent également être utilisées pour caractériser et quantifier les niveaux de chaque PtdInsP14-16. Ces méthodes nécessitent l’isolement des lipides pour la détection des niveaux cellulaires de PtdInsPs. La spectrométrie de masse peut être utilisée pour caractériser les phospholipides à partir d’extraits de lipides et est inestimable pour déterminer la composition de la chaîne acyle de PtdInsPs14,17. Cependant, la spectrométrie de masse est principalement semi-quantitative et il reste difficile de résoudre et de quantifier simultanément les espèces PtdInsP de même poids moléculaire14,17. En comparaison, le marquage radio-isotopique des PtdInsPs suivi d’une scintillation en flux couplée à la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est utile pour la séparation et la quantification simultanée des sept espèces de PtdInsPs18. L’utilisation de la HPLC avec une colonne d’échange d’anions forts (SAX) permet d’obtenir une séparation basée sur le poids moléculaire, la charge et la forme, fractionnant ainsi les PtdInsP désacylés (Gro-InsPs) même de même poids moléculaire et de même charge. Le couplage de l’éluant HPLC à un scintillateur de flux génère ensuite des pics de signal radioactifs pour chaque espèce de Gro-InsPs par rapport au glycérol-inositol parent d’origine (Gro-Ins)18. Cela correspond finalement aux niveaux relatifs de PtdInsP dans les cellules.

Le radiomarquage des PtdInsP et la scintillation d’écoulement couplée à la HPLC sont un outil utile pour étudier la régulation et la fonction du phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], un PtdInsP qui ne constitue que ~0,1-0,3 % des PtdIns16,19,20. La synthèse de PtdIns(3,5)P2 est réalisée par la 5-kinase PtdIns3P appelée Fab1 chez la levure et PIKfyve chez les mammifères21. Cette réaction est contrecarrée par une 5-phosphatase PtdIns(3,5)P2 appelée Fig4 chez la levure ou mFig4/Sac3 chez les mammifères22-24. Il est intéressant de noter que PIKfyve/Fab1 et mFig4/Fig4/Sac3 existent dans un seul complexe et sont régulés par la protéine d’adaptation d’échafaudage, Vac14 chez la levure ou mVac14/ArPIKfyve chez les mammifères25,26. Dans les cellules de levure supprimées par VAC14, Fab1 ne fonctionne pas efficacement, ce qui entraîne une diminution de 90 % des niveaux27,28 de PtdIns(3,5)P2. D’autre part, Atg18 est une protéine effectrice de PtdIns(3,5)P2 qui peut contrôler la fission vacuolaire 29. Atg18 est également un régulateur négatif de PtdIns(3,5)P2 puisque la délétion de son gène, ATG18, provoque une augmentation de 10 à 20 fois des niveaux29,30 de PtdIns(3,5)P2. Dans l’ensemble, les changements dans les niveaux de PtdIns(3,5)P2 ont un impact sévère sur la fonction de la vacuole de levure et des lysosomes de mammifères, affectant par conséquent des processus tels que le trafic membranaire, la maturation des phagosomes, l’autophagie et le transport d’ions 6,19,21,31.

Cet article décrit le processus de marquage radio-isotopique des PtdInsPs avec 3H-myo-inositol dans la levure pour détecter les niveaux relatifs de PtdIns(3,5)P2 dans les souches de levure de type sauvage, vac14Δ et atg18Δ. À l’aide de cet exemple, les capacités de résolution de la HPLC pour la séparation des PtdInsP individuels ainsi que la sensibilité de la scintillation en flux pour la détection de traces de 3H-myo-inositol sont démontrées. Nous expliquons également comment on pourrait optimiser la méthodologie de marquage et de séparation des PtdInsP marqués 3 H des cellules de mammifères, dont les échantillons ont tendance à être plus complexes puisque ces cellules possèdent les sept espèces de PtdInsP.

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Protocole

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Note: Le texte ci-dessous décrit en détail une méthode pour mesurer PtdInsPs dans la levure. Il fournit les détails expérimentaux pour les cellules d'étiquetage de levure avec 3 H- myo-inositol, l'extraction et désacylante lipides et un protocole HPLC-élution de fractionner et de quantifier PtdInsPs désacylés. S'il vous plaît noter que l'étiquetage, la désacylation, la résolution et la quantification des PtdInsPs dans des cellules mammifères exiger optimisation et profils plus longs HPLC-élution. Ces détails peuvent être trouvés ailleurs, si nous discuter de certains des aspects à la discussion. Dans l'ensemble, la méthode pour extraire les lipides, désacyler et extrait soluble dans l'eau le Gro-InsPs de levure est donnée et est illustré sur la figure 1.

1. Protocole pour l'étiquetage et Analyse PtdInsPs dans la levure

  1. Culture cellulaire et radiomarquage
    1. Cultiver un 20 ml culture liquide de la souche de levure SEY6210 à 30 ° C avec agitation constante en synthétique completles médias à la phase mi-log ou une densité optique à 600 nm (DO600) d'environ 0,6-0,7.
      Note: Ne pas utiliser les médias YPD car cela peut affecter 3 H- myo-inositol incorporation. Cette taille de la culture devrait fournir suffisamment de matériel pour 2-3 HPLC pistes.
    2. Pellet un total de 10 à 14 DO des cellules de levure (à noter que 1 ml de culture avec une OD 600 = ~ 1 contient 1x10 7 cellules) par centrifugation à 800 xg pendant 5 min dans un tube de 12 ml à fond rond. Remettre en suspension avec 2 ml de milieu sans inositol (IFM) (voir le tableau 1 pour la composition IFM).
    3. Répétez centrifugation et aspirer les médias. Reprendre le culot avec 440 ul d'IFM et incuber à température ambiante pendant 15 min.
    4. Ajouter 60 ul de myo-inositol 3 H- (1 pi = 1 uCi) à chaque échantillon et incuber à la température croissante de 30 ° C pendant 1 à 3 heures avec une agitation constante.
      Attention: 3 H- myo-inositol est une matière radioactiverial qui doit être manipulé après une formation appropriée. En outre, tous les consommables qui font contact avec un matériau contenant 3 H-doivent être éliminés de manière appropriée et désignés comme des déchets radioactifs.
      Note: La température de croissance peut être changé selon les besoins, tant que toutes les souches à comparer sont cultivés à la même température.
    5. Transférer la suspension cellulaire (500 ul) à un tube de microcentrifugation contenant 500 pi d'acide perchlorique à 9% et 200 ul d'acide lavé les billes de verre. Mélanger par inversion et on incube sur de la glace pendant 5 min.
    6. Vortex de l'échantillon à la vitesse supérieure pendant 10 min et transférer les lysats à un nouveau tube en utilisant une pointe de gel de chargement pour éviter les perles de verre.
    7. Pellet l'échantillon à 12 000 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant.
    8. Reprendre le culot par bain sonication dans 1 ml de glace froid 100 mM d'EDTA. Pellet de nouveau comme précédemment.
  2. Désacylation et l'extraction
    1. Fraîchement préparer 5,0 ml du réactif de désacylation en combinant 2,3 ml de methanol, 1,3 ml de méthylamine à 40%, 0,55 ml de 1-butanol et 0,80 ml d'eau. Inversez pour mélanger.
    2. Aspirer le EDTA et sonication du culot dans 50 ul d'eau.
    3. Ajouter 500 pi de réactif de désacylation et soniquer pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
    4. Les lipides de la chaleur pendant 50 minutes à 53 ° C dans un bloc chauffant. Sécher les échantillons complètement par centrifugation à vide de plus de 3 h ou O / N.
      1. Assurez-vous que le piège chimique est installé entre la centrifugeuse sous vide et la pompe à vide pour empêcher les vapeurs d'entrer dans l'air.
    5. Reprendre le culot avec 300 pi d'eau par bain sonication et incubation à température ambiante pendant 20 min. Sécher les échantillons par centrifugation sous vide pendant 3 heures ou O / N. Répétez cette étape une fois de plus.
    6. Soniquer le culot avec 450 pi d'eau. Ceci est la phase aqueuse lors de l'extraction.
    7. Fraîchement préparer 10 ml de la extraction aun réactif par addition de 8,0 ml de 1-butanol, 1,6 ml d'éther éthylique et 0,40 ml de formiate d'éthyle. Inversez pour mélanger.
    8. Ajouter 300 ul de réactif d'extraction de la phase aqueuse. Vortex le mélange à la vitesse supérieure pendant 5 min et séparer les couches par centrifugation à la vitesse supérieure (18.000 xg) pendant 2 min.
    9. Recueillir la phase aqueuse inférieure dans un nouveau tube de centrifugeuse, tout en évitant la couche supérieure organique, l'interface, et le culot. Répéter l'extraction de la phase aqueuse encore deux fois avec le réactif d'extraction frais.
    10. Complètement sécher la couche aqueuse recueillie par centrifugation sous vide. Disperser le culot dans 50 ul d'eau par bain sonication.
    11. Ajouter 2 ul de chaque échantillon de 4 ml de liquide de scintillation dans un flacon à scintillation de 6 ml de polyéthylène. Déterminer le nombre de comptes (en cpm) dans chaque échantillon par scintillation liquide en utilisant une fenêtre ouverte.
    12. Conserver les échantillons à -20 ° C jusqu'au moment de l'HPLC.
  3. Séparation de3 H-glycéro-inositides par HPLC
    1. Préparer le tampon A en filtrant 1 L d'eau ultra-pure avec une bouteille couvre-filtre de 0,22 pm sous vide, suivie d'un dégazage.
    2. Préparer tampon B en faisant une solution à 1 L de 1 M phosphate d'ammonium dibasique (APS, MW 132.06) dans l'eau et ajuster le pH à 3,8 avec de l'acide phosphorique. Filtrer le phosphate d'ammonium avec une bouteille haut de filtre de 0,22 um à vide, suivie par dégazage.
    3. Assemblez le flacon d'injection en équipant un flacon de 2 ml avec un petit volume 250 pi insert à ressort. Chargez 10 millions de CPM et ajouter de l'eau pour un volume total de 55 pi. Préparer un flacon vide avec 55 pi d'eau.
    4. Boucher les flacons avec bouchons à vis équipé d'un septum PTFE / silicone (côté rouge face à l'intérieur du flacon). Placez chaque flacon dans la barre d'auto-échantillonnage de l'HPLC, en commençant avec le flacon vide.
    5. Utilisez une HPLC et le logiciel associé qui contrôle le flux de tampon, les tampons et les contrôles dégaze échantillon INJECTIsur. Utilisez un scintillateur de flux en ligne et son logiciel associé pour réguler le débit scintillant et de surveiller le signal 3 H-dentaire.
      1. Utiliser une colonne de chromatographie liquide SAX avec des dimensions de 250 mm x 4,6 mm et contenant de 5 um dans la résine de la silice HPLC. Équipez la colonne avec un garde de la colonne pour éviter l'injection de contaminants.
      2. Installation d'une cellule d'écoulement 500 ul de 3H-compatible dans le scintillateur de l'écoulement.
        NOTE: Le fractionnement peut être effectué avec une série de système HPLC Agilent infinité de 1200 commandé par un logiciel ChemStation ou avec d'autres systèmes HPLC disponibles dans le commerce. Flux de scintillation de l'éluant de CLHP peut être fait avec un débit scintillateur β-RAM commandé par le logiciel ou un autre scintillateur Laura d'écoulement disponibles dans le commerce ou un logiciel compatible.
    6. Initialiser la pompe quaternaire à un débit de 1,0 ml / min avec 100% de tampon A.
    7. Définir un profil d'équilibrage sur la HPLCpour contrôler le gradient de tampons A et B (appelons cela "Protocole Un équilibrage"): 1% de tampon B pendant 5 min, 1-100% de B pendant 5 min, 100% de B pendant 5 min, 100-1% de B pendant 5 min, 1% de B pendant 20 min. Régler la limite de pression à 400 bars, 1,0 ml / débit min, et 30 min le temps d'exécution.
    8. Définir un profil d'élution (figure 2) sur la HPLC pour contrôler le gradient de tampons A et B (appelons cela "Protocole A"): 1% de B pendant 5 min, 1-20% de B pendant 40 min, 20-100% B pendant 10 min, 100% de B pendant 5 min, 100-1% de B pendant 20 min, 1% de B pendant 10 min. Régler la limite de pression à 400 bars, 1,0 ml / débit min, et 90 min le temps d'exécution.
    9. Mettre en place un protocole de détection sur le scintillateur de flux (appeler cette "Un protocole de détection") de fonctionner pendant 60 minutes, avec un taux d'écoulement de fluide de scintillation de 2,5 ml / min et un temps de séjour 8.57 sec.
    10. Programmer une séquence d'injection automatisée sur la HPLC pour commencer l'ébauche de l'eau sur le thème "Un protocole d'équilibrage", suivi par ehaque radiomarqué échantillon sur "Protocole A". Initialisation de la séquence lorsque vous êtes prêt.
    11. Alors que la marche est toujours sur le protocole d'équilibrage, créer un lot sur ​​le scintillateur de flux pour mesurer tous les échantillons avec "Un protocole de détection." L'injection de chaque nouvel échantillon va initialiser la "Protocole A" sur la HPLC tout en déclenchant le scintillateur de débit pour commencer "Un protocole de détection."
    12. À la fin de toutes les courses, rincer la HPLC, la colonne et le débit scintillateur avec 100% de tampon A pendant 30 min à 1,0 ml / débit min.
  4. L'analyse des données
    1. Utilisez un logiciel Laura ou tout autre logiciel qui permet de quantifier les spectres de chromatographie. Les étapes décrites dans cette section sont illustrés dans la Figure 3.
    2. Ouvrez les fichiers en cliquant sur "Fichier", "Ouvrir", et sélectionnez le fichier de données brutes pour chaque échantillon.
    3. Dans l'onglet "chromatogrammes", zoOM pour étirer chacun des pics moindres (environ 1000 chefs d'accusation [axe y]) tout en conservant la résolution de temps. Zoomez sur chaque pic individuelle si nécessaire.
    4. Mettez en surbrillance chacun des pics pour l'analyse en utilisant la fonction "Ajouter ROI". Identifier les pics par le temps d'élution: Parental Gro-Ins à 10 min, Gro-Ins3P à 18 min, Gro-Ins4P à 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 à 29 min et Gro-Ins (4,5 ) P 2 à 32 min.
    5. Dans l'onglet "tables des régions", enregistrer la "zone (chiffres)" de chaque pic. Notez le "commencer (mm: ss)" temps et «fin (mm: ss)" temps de chaque pic.
    6. Pour la soustraction du fond, mettre en évidence une région adjacente à la pointe couvrant la même quantité de temps. Soustraire le nombre de coups de pic correspondant.
    7. Normaliser l'aire de chaque pic contre parentale Gro-Ins (exprimé en "% de Ptdlns totales"). Ensuite, normaliser chacun des pics dans chaque condition expérimentale contre la condition de commande (exprimée en "n-fold augmentation par rapport à contrôler »).
      NOTE: La normalisation de chaque pic peut également être fait contre les coups totaux, mais depuis le parentale Gro-Ins est beaucoup plus abondante que tous les autres PtdInsPs les résultats ont tendance à être similaires.
    8. Exporter les données pour les chromatographes en appuyant sur "Fichier", "Enregistrer sous ...", et choisissez le "CSV (Comma Separated)" format de fichier. Tracer les données sur une feuille de calcul et de présenter, si nécessaire.

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Résultats

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En utilisant cette méthode, PtdInsPs de levure ont été marquées métaboliquement avec 3 H- myo-inositol. Après marquage, les phospholipides ont été précipités avec de l'acide perchlorique, suivie d'une désacylation phospholipide et l'extraction de la Gro-InsPs soluble dans l'eau (figure 1). A ce stade, il est important de quantifier le signal radioactif total associé avec le Gro-InsPs extraite par scintillation liquide pour assurer un rapport signal à ...

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Discussion

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Cet article détaille le protocole expérimental nécessaire de quantifier les niveaux cellulaires de PtdnsPs par flux scintillation HPLC couplé à de la levure. La méthodologie permet au marquage métabolique avec de PtdInsPs myo-inositol 3 H-, suivi par un traitement d'extraction des lipides et de 3 H-Gro-InsPs, CLHP et fractionnement analyse soluble dans l'eau. En utilisant cette méthode, les niveaux relatifs de PtdInsPs dans les cellules dans diverses conditions peuvent être quantif...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.H. a été financée par une bourse d’études supérieures de l’Ontario du gouvernement de l’Ontario. Cet article a été rendu possible grâce au financement détenu par R.J.B. du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie, du Programme des chaires de recherche du Canada et de l’Université Ryerson.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-ButanolBiobasicBC1800Phosphate
d’ammonium dibasiqueBioshopAPD001Sulfate d’ammonium de qualité ACS
Échantillonneur d’alcool BiobasicADB0060Ultra Pure Agilent
G1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Acide boriqueBiobasicBB0044Chlorure de calcium de qualité biologie moléculaire
BiobasicCT1330Ahydre, qualité industrielle
Pantothénate de calciumSigmaC8731
Sulfate de cuivre(II)Sigma451657Anhydre
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydre, qualité biotechnologique
Modification de Dulbecco Eagle’s MediumLife11995-065Avec 4,5 g/L de glucose, 110 mg/L de pyruate, L-glutamine
La modification par Dulbecco desproduits biomédicaux0916429  ;Avec 4,5 g/L de glucose, sans L-gluatmine, sans inositol
EDTABiobasicEB0107Sans acide, qualité ultra pure
Éther éthylique Caledon labs1/10/4700Anhydre, qualité réactif
Éthyle formiateSigma112682
Sérum fœtal bovinWisent080-450Origine américaine, qualité supérieure, inactivé par la chaleur
Sérum de veau fœtal, vie dialysée26400044États-Unis origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Fluide à scintillation pour scintillation à écoulement  ;
Acide foliqueBiobasicFB0466USP grade HEPES
solutionLife156300801 M
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MCÉthanol 9:1 à l’eau
Insuline-Transferrine-Sélénium-ÉthanolamineLife51500056100x
solution Chlorure de fer(III)Sigma157740Réactif grade
Laura - Logiciel de collecte et d’analyse de données de chromatographieLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Logiciel de scintillateur de flux
L-glutamineSigmaG7513200  ; mM, solution, filtré stérilement, BioXtra, adapté à la culture cellulaire
Chlorurede magnésium SigmaM8266
manganèseBiobasicMB0334Monohydraté, grade ACS
MéthanolCaledon labs6701-7-40Grade HPLC
Solution de méthylamineSigma42646640 % (v/v)
PhosphatemonopotassiqueBiobasicPB0445Anhydre, grade ACS
Acide nicotiniqueBiobasicNB0660Qualité réactif
OpenLAB CSD ChemStation  ;AgilentRev. C.01.03  ;Logiciel HPLC
Acide p-aminobenzoïque (PABA)BioshopPAB001.100Acide libre
Pénicilline-StreptomycineSigmaP4333100X, liquide, stabilisé, filtré stérilement, testé en culture cellulaire
Acide perchloriqueSigma244252réactif ACS, 70 %
PhenoSpher Colonne SAXPhenomenex00G-315-E05 µ ; m, 80 Å ;, 250 x 4,6 mm
Acide phosphoriqueCaledon labs1/29/8425Qualité réactif
Chlorurede potassium BiobasicPB0440Iodure de potassium de qualité ACS
BiobasicPB0443Qualité ACS
Chlorhydrate de pyridoxineSigmaP9755
Pompe quaternaireAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100
Chlorure de sodiumBiobasicDB0483
Molybdate de sodiumSigma243655
Compartiment de colonne thermostatéeAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Chlorhydrate de thiamineSigmaT4625Qualité réactif ; Faire la solution de 0,02 % (p/v), forme une suspension. mélange et congélation aliquotes
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Coctail à scintillation pour comptage à scintillation liquide
Sulfate de zincBiobasicZB2906Heptahydrate, qualité réactif
&beta ;-RAM 4Systèmes IN/USModèle 4Scintillateur à flux - 500 µ ; l cellule d’écoulement ; Analyseur à scintillateur de flux radiomatique alternatif de Perkin Elmer  ;
de qualité réactif Eagle’s Medium MP de qualité réactif Solution Sulfate de anhydre de qualité USP de qualité Biotech

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
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