Afin d’identifier de nouvelles mutations affectant la mécanosensation, nous avons conçu un test qui mesure la réponse comportementale à la stimulation tactile des poils de mouches chez des clones mutants générés par la méthode MARCM. La combinaison de techniques permet d’identifier des mutations mécanosensibles qui seraient autrement mortelles.
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Article de méthode
A Behavioral Essai pour mécanosensibilité de marcm-fondé clones dans
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Résumé
Résumé
En raison de l'homologie structurelle et fonctionnelle des cellules ciliées de l'oreille interne chez les mammifères, les neurones qui innervent les organes sensoriels externes Drosophila constituent un excellent système modèle pour l'étude de mécanosensibilité. Ce protocole décrit un comportement simple tactile dans les mouches des fruits qui peuvent être utilisés pour identifier les mutations qui interfèrent avec mécanosensibilité. La stimulation tactile d'un macrochaete poils sur le thorax de mouches déclenche un réflexe de damage de la première ou la troisième branche. Les mutations qui interfèrent avec la mécanotransduction (comme NOMPC), ou avec d'autres aspects de l'arc réflexe, peuvent inhiber la réponse de toilettage. Un écran traditionnel de comportements adultes aurait manqué mutants qui ont des rôles essentiels au cours du développement. Au lieu de cela, ce protocole combine l'écran tactile avec l'analyse de la mosaïque avec un marqueur de cellule répressible (marcm) pour permettre seules régions limitées de cellules mutantes homozygotes pour être généré et marqué par l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP). En testant clones marcm des réponses comportementales anormales, il est possible de cribler une collection de mutations létales p-éléments à chercher de nouveaux gènes impliqués dans mécanosensibilité qui auraient été manqués par des méthodes plus traditionnelles.
Introduction
Les humains dépendent de la capacité de convertir les stimuli mécaniques de leur environnement, tels que le toucher, la pression, les vibrations ou les ondes sonores, en informations sensorielles qui peuvent être traitées par le système nerveux, dans un processus appelé mécanotransduction. De nombreuses caractéristiques mécanistes globales de la mécanotransduction entre les humains et les invertébrés sont les mêmes1, ce qui fait de la drosophile un modèle utile pour étudier les mécanismes moléculaires de la mécanotransduction. Drosophila melanogaster contient deux ensembles d’organes sensoriels spécialisés (type I et II) qui sont capables de convertir des stimuli mécaniques en potentiels d’action. Les mécanorécepteurs de type I ont un neurone avec une seule dendrite ou processus sensoriel, entouré de trois cellules de soutien2. Les mécanorécepteurs de type I comprennent les mécanorécepteurs des poils, les organes chordotonaux sensibles à l’audition (l’organe de Johnston) et les sensilles campaniformes qui transmettent des informations sur les battements d’ailes3. Les poils qui recouvrent la face dorsale de la mouche sont les plus abondants et les plus facilement accessibles des organes de type I. Semblable à l’environnement extracellulaire des cellules ciliées associé à l’audition et à l’équilibre chez les vertébrés, les cellules de soutien entourant les neurones mécanosensibles aux mouches sécrètent une endolymphe riche en potassium qui crée un gradient de concentration inhabituel pour le potassium1. Les neurones mécanosensibles, des systèmes des mammifères et des mouches, utilisent ce potassium extracellulaire élevé pour dépolariser la cellule. En réponse à la stimulation mécanique des poils des macrochètes vers la paroi corporelle, les neurones sensoriels répondent par une explosion de potentiels d’action entraînés par cette dépolarisation potassique de la membrane cellulaire4. Les neurones sensoriels de la drosophile qui innervent les poils ressemblent aux cellules mécanosensibles d’autres organismes, y compris les cellules ciliées des vertébrés, à la fois dans leur structure et leur fonction1,5. L’accessibilité des organes sensoriels externes de la drosophile à la manipulation expérimentale et l’abondance de techniques génétiques à la disposition des chercheurs font de la drosophile un excellent système modèle pour étudier les fondements moléculaires de la mécanosensation.
Chez la mouche, la stimulation d’un seul neurone sensoriel qui innerve un poil conduit à une réponse comportementale observable. La stimulation de différents poils évoque des réponses comportementales spécifiques et reproductibles, en fonction du poil stimulé. Lors de la stimulation tactile, les mouches sauvages décapitées présentent un réflexe de toilettage complexe dans lequel elles nettoient la zone près des poils stimulés avec un ensemble de mouvements de pattes5-7. Lorsqu’elles sont homozygotes pour des mutations monogéniques connues qui interfèrent avec l’apprentissage7 ou la coordination et l’activité locomotrice5, les mouches répondent anormalement à la stimulation mécanique. Ce réflexe de toilettage est donc un outil utile pour étudier les effets des mutations d’un seul gène sur un comportement spécifique et reproductible.
La réponse comportementale robuste à la stimulation d’un seul soie de macrochète a le potentiel d’aider à identifier de nouveaux gènes impliqués dans la mécanotransduction. Ce protocole est utilisé pour tester une collection de mouches mutantes pour l’absence de réponse comportementale afin d’indiquer que la mutation interfère avec la mécanosensation. Dans la collection de mutants sélectionnés pour le dépistage, les mutations provoquent une létalité avant l’âge adulte et seraient donc impossibles à tester à l’aide de dépistages traditionnels du comportement adulte. À l’origine, cette collection d’éléments p létaux a été combinée à des sites de recombinaison FRT pour tester les défauts de croissance cellulaire chez les clones. Les clones ont été fabriqués spécifiquement dans l’œil parce que les mouches adultes peuvent survivre en laboratoire sans vision fonctionnelle8. Cependant, l’élimination de toute mécanosensation peut entraîner une grave déscoordination des adultes ou leur mort avant l’éclosion5. Ce protocole utilise une approche mosaïque pour contourner la létalité des mutations et permettre des tests au stade adulte. Une technique génétique appelée analyse mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible (MARCM)9 est utilisée pour générer des cellules mutantes homozygotes dans un nombre limité d’organes sensoriels de mouches adultes, tandis que le reste de l’organisme reste hétérozygote. Ces mouches MARCM survivent facilement jusqu’à l’âge adulte, mais les poils sont homozygotes pour les gènes létaux d’intérêt.
MARCM permet de générer et de marquer des régions de cellules mutantes homozygotes par l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP), tandis que le reste de l’organisme reste hétérozygote à ce locus particulier et non marqué9. MARCM combine des mutations individuelles de l’élément p avec cinq éléments génétiques communs : la GFP sous le contrôle d’une séquence d’activation en amont (UAS-GFP), la protéine répressive Gal80 sous le contrôle d’un promoteur général (tub-Gal80), le facteur de transcription Gal4 sous le contrôle d’un promoteur général (tub-Gal4), l’enzyme recombinase FRT exprimée par un promoteur contrôlé par choc thermique et un site de recombinaison FRT10. En entraînant la recombinaison mitotique par le biais d’une recombinase activée par choc thermique, un nombre limité de cellules sont rendues homozygotes pour la mutation et marquées par la GFP. L’expression de la GFP est réprimée dans les cellules hétérozygotes par la présence de Gal80 sur la copie de type sauvage du chromosome.
Un protocole de choc thermique pour MARCM a été optimisé pour induire une recombinaison dans les organes sensoriels externes des poils de la mouche, alors qu’une grande partie de l’organisme reste hétérozygote, et donc non marquée par la GFP. Les mouches mosaïques générées à l’aide de ce protocole contenaient des mutations homozygotes le plus souvent dans les poils post-alaires ou centraux dorsaux à la surface du notum.
Nous avons testé l’utilité de cette combinaison de MARCM et de l’écran de comportement de toilettage avec un mutant mécanosensible connu, NOMPC. Le canal ionique, sans potentiel mécanorécepteur C (NOMPC), est un composant essentiel de la voie de mécanotransduction chez la drosophile5,11-13. NOMPC appartient à la superfamille des canaux cationiques5 et satisfait à tous les critères pour être qualifié de canal mécanosensible chez la drosophile14,15 : 1) Le NOMPC est exprimé dans les extrémités ciliées des neurones sensoriels de type 1 de la drosophile 13, 16-18, 2) Les larves nulles de la NOMPC n’ont pas de réponse électrique à la stimulation tactile13, 3) L’expression ectopique de NOMPC dans les cellules insensibles au toucher peut induire une sensibilité à la stimulation mécanique13, 4) L’expression hétérologue de NOMPC dans les cellules de Schneider 2 produit un canal mécanosensible13, et 5) Les mutants adultes NOMPC présentent des défauts dans leur réponse à la stimulation mécanique5. Compte tenu de ces preuves, nous avons prédit que les clones mutants NOMPC présenteraient une réponse de toilettage altérée ou inhibée en réponse à la stimulation mécanique des poils.
Une souche MARCM contenant la mutation NOMPC a été développée pour être utilisée dans une expérience de preuve de principe du test de toilettage. Des mouches mosaïques ont été stimulées au niveau des soies macrochètes contenant des cellules mutantes homozygotes NOMPC. Nous nous attendions à une inhibition de la réponse de toilettage suite à la stimulation des poils des macrochètes. Nous avons constaté que seulement 2 des 14 mouches à poils mutantes testées donnaient une réponse unique à une stimulation répétée ; La plupart n’ont pas répondu à la stimulation de la soie mutante homozygote. Après avoir confirmé que ce test comportemental basé sur MARCM produit un réflexe de toilettage anormal chez un mutant mosaïque mécanosensible connu, cette technique peut être utilisée dans un dépistage de mutations mécanosensibles supplémentaires.
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Protocole
1. Croix pour générer Flies marcm
- Maintenir des mouches sur les médias semoule de maïs de la mélasse (6,5 g / L d'agar; 23,5 g / L de levure; 60 g / L de farine de maïs, 60 ml / l mélasse; 4 ml / L mix d'acide; 0,13% Tegosept) ou des médias Drosophila standard à 22 degrés Celsius dans un cycle de lumière de 12 h / sombre.
REMARQUE: Un inférieure à la température standard est utilisé pour garder marcm-stocks en bonne santé. Ceci augmente le temps de développement entre l'œuf et l'âge adulte à 14 jours. - Utilisez des femelles vierges (environ 1 - âgées de 8 jours) à partir d'un stock marcm prêt contenant les éléments génétiques nécessaires (GFP sous le contrôle d'une séquence en amont d'activation (UAS-GFP), la protéine répresseur GAL80, le facteur de transcription Gal4, un choc thermique de recombinase entraîné, et un site de recombinaison FRT).
Note: Notre marcm ready-titres contiennent les génotypes suivants: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / CYO; tubGal4 / TM3Sb.
Remarque: Le site FRT spécifique dépendra de la localisation de la mutationdans le génome. Par exemple, FRT40A est utilisé pour tester des mutations sur le bras gauche du chromosome 2, comme NOMPC (voir 10 pour plus de détails sur les protocoles de marcm). - Cross femelles vierges marcm prête aux hommes qui contiennent une mutation d'intérêt et de son site correspondant FRT (par exemple, W; NOMPC3, FRT40A / CYO; + / +). Pour contrôler pour l'induction de marcm efficace, mettre une deuxième croix utilisant mouches mâles contenant le même site FRT, mais sans une mutation. Utilisez un rapport approximatif de 5 femelles: 1 mâle dans les croisements.
2. Timed ponte
- Après avoir laissé les mouches à accoupler pour au moins une nuit, déplacer adultes dans de nouveaux flacons de milieux frais. Autoriser les mouches pondent leurs œufs dans un environnement sombre pendant environ 4 heures avant de le transférer à nouveau les croix dans de nouveaux flacons. Notez les heures de début et de fin de la période de ponte.
Remarque: Des intervalles plus courts sont acceptables quand il semble y avoir un nombre élevé d'œufs sur les médias avant la fin de la InterVA 4 heuresl.- Gardez les flacons avec un nombre suffisant d'oeufs (environ plus de 20) et de stocker dans un cycle de lumière de 12 h / obscurité à 22 degrés Celsius pour être un choc thermique plus tard.
Remarque: les flacons avec un faible nombre d'œufs sur le support (inférieure à environ 20) sont peu susceptibles de rapporter un nombre suffisant de mouches adultes pour les tests de comportement et dans l'intérêt de l'efficacité, il est recommandé qu'ils ne peuvent être conservés pour des tests supplémentaires.
Note: Nos mouches sont élevés avec les lumières sur 8 heures-20 heures. Nous avons trouvé le temps du soir points d'avance à la densité des œufs plus élevés, donc généralement effectuer des croisements entre chronométrés de 4 - 8 heures et 20 heures-minuit. Les mouches pondent leurs œufs à la température ambiante dans un cabinet noir, puis sont retournés à l'incubateur de la journée suivante, afin de ne pas perturber le cycle lumière-obscurité régulière dans l'incubateur.
- Gardez les flacons avec un nombre suffisant d'oeufs (environ plus de 20) et de stocker dans un cycle de lumière de 12 h / obscurité à 22 degrés Celsius pour être un choc thermique plus tard.
3. Effectuer Heat Shock pour Provoquer recombinaison mitotique
- Environ 85 à 100 heures après la ponte, place vEIAA dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant 1 heure. Assurez-vous que le niveau de l'eau atteint dessus de la hauteur des médias dans les flacons, mais ne submergent pas pleinement les flacons pour empêcher les larves de la noyade.
- Retirer les flacons du bain d'eau et de permettre une période de récupération de 1 heure à température ambiante.
- Placer les flacons dos en 37 degrés Celsius bain-marie pendant 1 h.
- Retirer les flacons du bain d'eau et de stocker dans un incubateur sur la lumière cycle de 12 h / obscurité à 22 degrés Celsius jusqu'à l'éclosion.
4. Préparation pour la vérification comportementale
- Après l'éclosion, anesthésier les mouches sur de la glace. Sélectionnez les mouches avec des génotypes qui contiennent tous les éléments génétiques pour marcm et indiquent GFP clones d'expression marquée seront probablement observées sur la base des marqueurs phénotypiques observables utilisées dans les stocks de parents. Décapitez mouches avec iridectomie ciseaux.
Note: Par exemple, nous avons sélectionné pour les mouches sans les marqueurs génétiques CYO (Les ailes arrondies) et Sb (poils de barbe) pour identimouches fy qui contiennent tous les éléments génétiques nécessaires pour créer des régions mosaïque marquées à la GFP.
Remarque: Décapitation est nécessaire pour empêcher les adultes de se envoler quand ils sont stimulés. - Placez les mouches sans tête dans un environnement clos et humide et laisser environ 10 - 20 h de récupération. Seule l'utilisation vole ce droit eux-mêmes quand perturbée pour des tests supplémentaires. Essai vole dans les 30 heures de la décapitation.
5. tests comportementaux
- En observant vol décapités sous un microscope de dissection fluorescence, identifier des clones GFP marquées d'homozygotes chez les poils des organes sensoriels externes. Enregistrez le nom de poils et à gauche ou à droite. Pour éliminer tout risque de biais, le membre du laboratoire d'effectuer la stimulation de poils doit être aveugle au génotype de la soie, de type sauvage ou mutant.
- Susciter un réflexe de toilettage en déviant la GFP marqué poils vers le corps de la mouche avec un poil raide ou une pince fine et observer la répétition de la jamberéponse. Donnez une note de un à mouches qui lève la patte en réponse à la stimulation et à poils un score de zéro à mouches qui ne se déplacent pas leurs jambes.
Remarque: Des études antérieures 6,7 ont caractérisé la réponse de la jambe qui est provoquée par la stimulation d'un poil particulier. Cela comprend la jambe qui répond à chaque poil et la proportion de vol qui répondent à une stimulation de poils qui particulier. Nous seulement marqué pour les mouvements de la jambe qui nous nous attendions à répondre basé sur la classification de Vandervorst 6. - Mener cinq essais espacés 2 minutes d'intervalle.
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Résultats
Le succès de ce protocole dépend en grande partie sur le rendement global de mouches vérifiables, l'efficacité du choc thermique pour induire la recombinaison mitotique, et la capacité d'obtenir une réponse comportementale robuste dans les mouches stimulées à intervalles de 2 min. Étant donné qu'environ 12,5% des embryons contient les éléments nécessaires marcm et environ 16,67% des adultes qui ont le potentiel Eclose pour l'expression de la GFP, il est essentiel d'ob...
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Discussion
Ce protocole utilise un test de comportement des adultes à l'écran pour les mutations qui affectent mécanosensibilité chez la drosophile. Parce que la collection de mutants contient létales mutations élément P qui empêcherait de dépistage que les adultes, ce protocole permet l'utilisation d'une technique génétique complexe d'abord décrit par Lee et Luo , (1999) et détaillée en tant que protocole par Wu et Luo, (2006) pour contourner la létalité adulte. Marcm induit recombinaison mitotiq...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Les auteurs souhaitent remercier le centre Bloomington boursier, Liqun Luo, Charles Zuker, et Lily et Yuh Nung Jan pour le partage généreux des stocks de mouches et de la suivante pour un financement: SOMAS-URM (JD et SW), baccalauréat Ford Faculté été Fellowship (SW), BD Corporation de bourses de recherche d'été (à CL et DL), Renée et Anthony M. Marlon, MD '63 bourses de recherche d'été (DL) James C. '75 et Jane Colihan bourses de recherche d'été (TO) par Alumni / Fonds de recherche Summer Parent du Collège de la Sainte Croix et la Fondation Stransky Summer Research Fellowship (TO). Un merci spécial au Département de biologie et le bureau du doyen au Collège de la Sainte Croix pour le soutien de tout le travail dans le laboratoire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Levure de bière (25 lb) | MP Biomedicals ; | ICN90331225 ; | Nourriture pour mouches |
| Maïs (25 lb) | MP Biomedicals ; | ICN90141125 ; | Nourriture pour mouches |
| Agar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Nourriture pour mouches |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Nourriture |
| mouches Mélasse (1 gallon) | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | Nourriture pour mouches |
| Acide propionique | Fisher | A258-500 | Nourriture pour mouches |
| Acide phosphorique | Fisher | A260-500 | Nourriture pour |
| mouches Drosophila Fioles, étroit (PS) | Genesee | 32-109 | Cultures de mouches |
| Bouteille à fond carré de 6 oz (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Bouteilles de mouches en plastique | Genesee | 49-100 | Fly Cultures |
| Rayonne Balls, Grand | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, Narrow | Genesee | 59-168 Préparation de | la nourriture pour mouches |
| Droso-Filler, Bouteilles | Genesee | 59-170 | Nourriture pour mouches Préparation |
| 8A-C / agitateur de laboratoire à engrenages avec support de serrage en C 1/15 CV, 700 tr/min vitesse variable, 115 V, 50/60 Hz | Mélangeur Cleveland | 8A-C Préparation des | aliments |
| double d’eau Bouilloire | Préparation des aliments à mouches Chambre | ||
| croissance diurne | Forma Scientific | Température et cycle d’obscurité contrôlé | |
| Bain d’eau | VWR | Pour la chaleur | |
| microciseaux de choc ; | Outils de science fine | ; 15000-08 | Pour l’ablation des têtes |
| Microscope de dissection Fluroscence | Zeiss | SteREO Discovery V8 ; | Avec filtre passe-bande cube GFP (KSC295-814D) |
| La source lumineuse Fluroscence | Zeiss | X-Cite 120 | Fiber optical Light Pipe facilite la configuration. |
| Caméra pour lunette | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Logiciel d’acquisition d’images | Zeiss | ||
| Seau | pour l’anesthésie froide | ||
| Plateau | pour la décapitation de l’anthesie | ||
| froide Boîtes | pour la récupération des mouches décapturées en milieu humide |
Références
- Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
- Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).
- Gillespie, P. G., Walker, R. G. Molecular basis of mechanosensory transduction. Nature. 413, 194-202 (2001).
- Corfas, G., Dudai, Y. Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants. J Neurosci. 10, 491-499 (1990).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Vandervorst, P., Ghysen, A. Genetic control of sensory connections in Drosophila. Nature. 286, 65-67 (1980).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9, 56-62 (1989).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59(2005).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. A Drosophila mechanosensory transduction channel. Science. 287, 2229-2234 (2000).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493, 221-225 (2013).
- Arnadottir, J., Chalfie, M. Eukaryotic Mechanosensitive Channels. Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).
- Christensen, A. P., Corey, D. P. TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia. PLoS One. 5, e11012(2010).
- Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells. Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. R. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Curr Biol. 22, 353-362 (2012).
- Jarman, A. P. Studies of mechanosensation using the fly. Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).
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Réimpressions et autorisations
