Évaluation de Planar-Cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée

Résumé

Les cils primaires influencent diverses voies de signalisation. La cochlée de mammifère est idéale pour examiner la signalisation de la polarité cellulaire planaire (PCP). Le dysfonctionnement des cils affecte la croissance cochléaire, la structure cellulaire et l’orientation des cellules ciliées, les lectures de PCP. Notre objectif est d’analyser la signalisation PCP dans la cochlée de souris via l’analyse phénotypique, l’immunohistochimie et la microscopie électronique à balayage.

Résumé

Ces dernières années, les cils primaires sont devenus des régulateurs clés dans le développement et la maladie en influençant de nombreuses voies de signalisation. L’une des premières voies de signalisation associées à la fonction ciliaire était la voie de signalisation Wnt non canonique, également appelée signalisation de polarité cellulaire planaire (PCP). L’un des meilleurs endroits pour étudier les effets de la signalisation de la polarité cellulaire planaire (PCP) pendant le développement des vertébrés est la cochlée des mammifères. La perturbation de la signalisation PCP dans la cochlée de la souris perturbe la croissance cochléaire, la structure cellulaire et l’orientation des cellules ciliées, qui sont toutes affectées par le dysfonctionnement des cils. L’objectif de ce protocole est de décrire l’analyse de la signalisation PCP dans la cochlée de mammifère en développement par analyse phénotypique, immunohistochimie et microscopie électronique à balayage. Les défauts de convergence et d’extension se manifestent par un raccourcissement du canal cochléaire et/ou des modifications de la structure cellulaire, qui peuvent être quantifiées après dissection de mutants murins en développement. Les changements dans l’orientation stéréociliaire du faisceau et la longueur ou le positionnement des kinocilia peuvent être observés et quantifiés à l’aide de l’immunofluorescence ou de la microscopie électronique à balayage (MEB). Une compréhension plus approfondie du rôle des protéines ciliaires dans les voies de signalisation cellulaire et d’autres phénomènes biologiques est cruciale pour notre compréhension de la biologie cellulaire et du développement, ainsi que pour le développement de stratégies de traitement ciblées.

Introduction

cils primaires sont des appendices en fonction de microtubules longues qui se prolongent à partir de la surface de la plupart des cellules de mammifères. cils primaires sont souvent confondus avec des cils mobiles, dont il existe toujours multiples par cellule, et dont le but est de déplacer le fluide à travers les surfaces de la membrane. cils primaires, en revanche, adopter des rôles sensoriels et sont par conséquent également désignée comme les cils sensorielle. Une fois oublié depuis longtemps, cet organite a récemment été "redécouvert" en raison de son association avec une multitude de maladies génétiques humaines ^1. Idéalement positionné comme un organite de signalisation, le cil primaire a été montré pour réguler de nombreuses voies de signalisation, dont beaucoup sont importantes non seulement dans l'homéostasie tissulaire et les maladies, mais également au cours du développement ^2.

L'une des premières voies de signalisation est prouvé qu'ils sont associés à un dysfonctionnement des cils est la voie de signalisation Wnt non canonique, connu également que la polarité cellulaire planaire (PCP) voie > 3. Cette cascade de signalisation initialement identifié chez la drosophile, est essentiel pour l'embryogenèse; en particulier pour les processus de convergence et d'extension et pour l'orientation correcte de cellules dans le plan de l'épithélium ^4. La signalisation séquentielle d'un ensemble de base de protéines régulatrices traduit indications directionnelles qui conduisent finalement à des réarrangements du cytosquelette et se traduisent par la polarisation coordonnée des cellules épithéliales dans un plan ^5. Le processus de convergence et l'extension est absolument nécessaire pour le canal cochléaire pour allonger et de structuration cellulaire correcte ^6. Comme il est régulée par activation de la voie de PCP, l'un des phénotypes les plus frappants de mutants PCP cochlée est un canal cochléaire raccourci avec l'épithélium sensoriel désorganisé ^7. De même, les mutants de souris, qui manquent de cils, présentent également une telle convergence et l'extension phénotype ^8,9, mais précisément comment cela est réglementé reste à élucider.

ve_content "> Parce que les processus de convergence et de vulgarisation sont essentiels pour l'excroissance du canal cochléaire, et la structuration cellulaire de l'épithélium sensoriel dans le canal cochléaire, le développement de la cochlée est un organe idéal pour examiner la signalisation PCP au cours du développement des vertébrés. L'organe de Corti, le terme donné à l'épithélium sensoriel spécialisé qui tapisse le canal cochléaire, est composé de cellules de soutien non-sensorielles et les cellules ciliées mécano qui doivent être uniformément orientés pour la cochlée pour fonctionner ^10. les cellules ciliées mécano sont appelés ainsi en raison de la faisceaux stéréocils qui se prolongent à partir de la plaque cuticulaire (de surface apicale) de chaque cellule sensorielle de cheveux ^11. Ceux-ci agissent comme des transducteurs primaires de mécanosensibilité et en dépit de leur nomenclature comme stereocilia, sont en fait constituées de microvillosités sur la base de filaments d'actine modifié. de chaque poil en forme de chevron bundle, trois rangées de stéréocils sont organisées dans un pa très ordonnée et régulièrettern dans un cas comme manière d'escalier. Réel cils base microtubules, kinocilia appelés, sont nécessaires pour le développement et l'orientation des faisceaux stéréocils ^12. A chaque cellule de cheveux, un seul kinocil est physiquement attaché à la touffe ciliaire, adjacent au centre de la rangée la plus haute des stéréocils. La fonction précise de la kinocil est pas claire, et une hypothèse est que le kinocil 'tire' stéréocils en forme à leur échéance de microvillosités ^12. Chez les vertébrés, kinocilia dans la cochlée ne sont présentes que de façon transitoire et se rétractent à partir des cellules ciliées chez les souris avant le début de l'audition ^11,13,14.

Perte complète de cils dans les résultats de la cochlée en développement dans les conduits cochléaires sévèrement raccourcies, mal formée et mal orienté paquets stéréocils, ainsi que mis-positionnés organes de base ^8,9. Un cil fonctionnelle est non seulement composé de l'axonème ciliaire. Beaucoup de protéines associées aux cilsfonction se produire dans des complexes localisés dans les sous-domaines connexes cils tels que le corps de base, zone de transition, ou ciliaire axonème ^15. Le corps de base, provenant de la centriole mère du centrosome, est également un centre de microtubules organisation pour les microtubules étendant depuis le cil dans le corps cellulaire et peut réguler le trafic intracellulaire, ainsi que le trafic de ciliaire. La zone de transition ciliaire est une autre région où la fonction ciliaire est réglementé en termes d'organisation importation et l'exportation de composés ciliaires ^16.

De multiples études ont identifié un lien entre les cils et Wnt non canonique (signalisation PCP), bien que le mécanisme précis est difficile ^17. Redondance de gènes ciliaires et le PCP et la sensibilité de la polarité cellulaire à des anomalies cellulaires généralisées, il est difficile de relier directement une mutation à des déficits spécifiques PCP. L'une des sorties de lecture de la signalisation de PCP est le positionnement du corps de base et primary cil donc séparer le primaire à partir des défauts secondaires est difficile. Certaines études de mutants de poisson zèbre et la souris ont suggéré aucun lien entre les cils et de signalisation Wnt ^18-20. Les écarts dans les données peuvent refléter des espèces, des tissus ou des différences temporelles dépendantes des cotisations ciliaires vers la signalisation Wnt. En outre, la réactivité Wnt normale pourrait être retenue si les organes de base restent fonctionnelles. Une connaissance plus approfondie le rôle des protéines ciliaires dans les voies de signalisation cellulaire et d'autres phénomènes biologiques est cruciale pour notre compréhension de la biologie cellulaire et du développement, ainsi que pour le développement de stratégies thérapeutiques ciblées.

Protocole

Utiliser et euthanasier tous les animaux conformément aux directives et réglementations institutionnelles et gouvernementales, le plus souvent par _{inhalation de CO 2} et la dislocation cervicale.

1. Préparation des réactifs

NOTE: Avant de commencer, préparer tous les réactifs à l'aide de produits chimiques de qualité analytique. Faire des solutions utilisant la biologie moléculaire distillée et de l'eau déminéralisée, sauf indication contraire.

1. Tampon phosphate salin (PBS 1x): Faire 1 L de PBS 1x en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO ₄ et 0,24 g de KH ₂ PO ₄ dans 1 litre de H ₂ O. Ajuster le pH à 7,4 avec du HCl. PBS n'a pas besoin d'être stérile et peut être stocké à température ambiante. Notez que ce tampon est faite sans CaCl _{2 ou} MgCl _2.
2. Paraformaldéhyde (PFA 4%): Préparer une solution à 4% de PFA dans 1x PBS dans une hotte ventilée. Ajouter 40 g de poudre de paraformaldehyde à 1 litre de PBS 1x. Pour dissoudre, mélanger et chauffer à environ 60 ° C,et ajouter lentement goutte à goutte NaOH pour élever le pH. Une fois que la poudre soit dissoute, réajuster le pH à 7,4 avec HCl. Filtrer à travers un filtre de 0,45 uM et congeler des aliquotes. Décongeler un aliquote fraîche pour chaque expérience.
3. tampon Triton: préparer un M de Tris-HCl 0,1 (pH 7,5), 0,15 M de NaCl, 0,1% de Triton X-100 solution en dissolvant 8,77 g de NaCl dans 1 litre de 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Ajouter 1 ml de Triton X-100. Remuez pour dissoudre. Magasin tampon Triton à température ambiante.
4. Triton bloc: Préparation du sérum de chèvre à 10% dans un tampon Triton en ajoutant 1 ml de sérum de chèvre à 9 ml de tampon Triton. Conserver à 4 ° C. Si l'on utilise des anticorps primaires soulevées chez la souris, ajouter de chèvre anti-souris fragments Fab d'IgG à une dilution de 1 dans 200 au bloc Triton pour l'étape de blocage.
   NOTE: Si vous prévoyez d'utiliser des échantillons pour la microscopie électronique à balayage (MEB), préparer des réactifs supplémentaires, tel qu'indiqué ci-dessous.
5. Solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec du calcium et du magnésium: Faire une solution de HBSS 1x par dilution d'une solution mèreen distillée stérile H ₂ O. Comme tampon HBSS est compliqué à faire et il y a des risques, il est conseillé de commander une solution 10x boursier premade. La concentration finale de tampon de HBBS couramment utilisés est la suivante: 1,26 _{mM de CaCl2,} 0,49 _{mM de MgCl2} -6H2O, 0,41 mM de MgSO ₄ -7H2O mM, KCl 5,33 mM, KH ₂ PO ₄ 0,44, NaHCO ₃ 4,17 mM, NaCl 137,93 mM , 0,34 mM Na _{2 HPO 4,} mM dextrose 5,56.
6. tampon Hepes: Préparer une solution Hepes 0,1 M en 1x HBSS, en dissolvant 23,8 g HEPES dans 1 tampon L 1x HBSS.
7. Microscopie électronique à balayage fixateur (SEM Fix): Préparation de fixateur pour SEM électrons en diluant du glutaraldéhyde à niveau microscopique (2,5%) et du paraformaldehyde (4%) dans du tampon Hepes. Ajouter CaCl ₂ à une concentration finale de 10 mM.
8. 1% tétroxyde d'osmium (OSO ₄₎ dans un tampon Hepes; 1% tétroxyde d'osmium dans l'eau: Diluer une solution mère de tétroxyde d'osmium dans du tampon Hepes et separately dans stérile distillée H ₂ O, à une concentration finale de 1%. Tétroxyde d'osmium est hautement toxique et est le plus souvent vendu comme une solution à 4%.
9. 1% (p / v) d'acide tannique: Dissoudre 0,5 g d'acide tannique dans 50 ml d'eau distillée stérile ₂ O. Filtre stériliser par filtration à travers un filtre de taille de pore de 0,45.
10. Graduée éthanol série de solution: Diluer 200 éthanol preuve avec stérile distillée H _{2 O} pour rendre les solutions 30, 50, 70, 90 et 95% d'éthanol. Pour les rinçages de finale en éthanol, éthanol à 100% 200 preuve est exigée. Utilisez une bouteille fraîchement ouvert de 200 éthanol preuve pour les derniers rinçages.

2. Choix de tissus

1. Idéalement, examiner des embryons ou des jeunes chiots âgés de jour embryonnaire 16,5 (de E16,5) et jour postnatal 3 (P3).
   NOTE: L'ossification du labyrinthe osseux et os temporaux fait dissection progressivement plus difficile que les souris matures. Aussi kinocilia, le seul vrai cil base microtubules trouvé sur les cellules ciliées de la cochlée,rétracte au cours du développement et ne sont plus présents dans les souris adultes.
2. Après fixation, détartrer cochlée adulte. Placez disséqué (voir section 3) labyrinthes osseux, dans 2 ml d'EDTA (4,13% dans PBS), pH 7,3, dans un tube de microcentrifugeuse pendant 3 - 4 jours avec rotation. Reconstituer EDTA quotidienne. Une fois que les tissus ont ramolli, rincer dans 1,5 ml de PBS ou plus de 3 fois pendant 5 minutes sur un nutator à une augmentation de l'agitation.

3. cochlée Dissection

1. Euthanasie poste par dislocation cervicale ou _{inhalation de CO 2} (100% de CO _2), enlever la tête. Utilisez une lame de scalpel ou une petite paire de ciseaux, en fonction de la taille de l'animal, de disséquer la tête le long de la ligne médiane sagittale en commençant par le nez et étendant caudale. Retirer le cerveau de chaque moitié du crâne avec une paire de forceps. Identifier les os temporaux, qui contiennent les labyrinthes osseux développement de l'oreille interne (voir la flèche sur la figure 1A).
2. Utilisez une paire de pourcèpes pour isoler soigneusement les labyrinthes osseuses du crâne (os temporal). Pour ce faire, sous un microscope de dissection. Prise de distance le tissu osseux du crâne en exécutant la pince doucement sous les labyrinthes osseux. Chez les animaux jusqu'à P4 les labyrinthes osseuses sont encore cartilagineux et peuvent être facilement enlevés sans se rompre.
3. À la suite de la dissection, utilisez la pointe de la pince à disséquer pour effacer l'ovale et fenêtres rondes et faire un petit trou dans le sommet de la spirale cochléaire. Fixer les labyrinthes osseux avant de poursuivre la dissection du canal cochléaire. Pour permettre un retrait facile de la membrane de Corti (voir 3.7), fixer les labyrinthes osseux dans 1,5 ml de 4% PFA pendant 5 minutes sur de la glace.
   NOTE: Si le retrait de la membrane de Corti est pas nécessaire, plus la fixation est recommandée (voir 04/01 au 04/03). Brève fixation des os temporaux avant la dissection du canal cochléaire facilite le processus de dissection et l'enlèvement de la membrane de Corti. dissection poste et l'exposition de l'organe de Corti, Furtsa fixation est nécessaire.
4. disséquer les labyrinthes osseux pour exposer l'épithélium sensoriel cochléaire comme suit. Placez les labyrinthes osseux dans un plat de dissection d'élastomère enduit silicone noir contenant du PBS pour faciliter la dissection. Utilisez des épingles minuties pour immobiliser le tissu si nécessaire. Pour utiliser des épingles minuties, placez-les à travers la partie vestibulaire des labyrinthes osseux à la face ventrale de la spirale cochléaire vers le haut.
   NOTE: Noir plat en élastomère de silicone: composant de base en élastomère de silicone Mélanger avec du charbon en poudre pour obtenir une couleur noire opaque. Ajouter l'agent de durcissement et verser dans une ou plusieurs boîtes de Pétri (verre ou plastique). À sec sous vide pour éliminer les bulles d'air emprisonnées. vaisselle sèche complètement avant de l'utiliser.
5. Utilisez une pince fine (# 5) pour enlever le cartilage externe exposer le canal cochléaire. Commencez par la fenêtre ovale; insérer l'extrémité inférieure de la pince dans la fenêtre ovale et levier doucement pour ouvrir le cartilage, se déplaçant lentement vers le haut vers lesommet.
6. Après l'exposition du canal cochléaire, retirez la face ventrale, la membrane de Reissner. Utilisez une belle paire de pinces pour pincer la membrane de Reissner à la base du canal cochléaire et le retirer dans un mouvement ascendant. Visualiser la face dorsale du conduit cochléaire, y compris l'épithélium sensoriel.
7. Retirer la membrane recouvrante, comme décrit ci-dessous (en option). Pour SEM ou immunohistochimie de la kinocil ou liasses stéréocils retirer la membrane de Corti.
8. Utilisez une paire très fine de forceps (N ° 55 ou plus fin) pour pincer la membrane de Corti à la base de la cochlée et éplucher vers le haut vers le sommet.
   NOTE: La membrane de Corti est optiquement clair qui rend difficile à identifier. Plus souvent qu'autrement, la membrane se détache en un seul morceau et bien qu'il ne soit pas facilement visualisé, on peut sentir la résistance comme il est retiré de l'organe de Corti exposée.
9. Après avoir exposé l'organe de Corti, fixer davantage le tissu que described ci-dessous. Conserver la région vestibulaire pour faciliter les opérations de préparation des tissus.

4. Fixation

1. Pour immunohistochimie régulière fixer les labyrinthes osseux disséqués dans 1,5 ml de 4% PFA à 4 ° C sur un nutator pendant 2 heures.
   NOTE: En raison de la sensibilité de différents anticorps et antigènes, les variations de la longueur et de la composition de fixation peut être nécessaire et doit être optimisé pour chaque anticorps.
2. Après fixation, les échantillons de lavage de rinçage dans 1,5 ml de PBS ou plus de 3 fois pendant 5 minutes sur un nutator à une augmentation de l'agitation. Les échantillons peuvent être stockés dans du PBS à 4 ° C pendant plusieurs semaines avant le traitement.
3. Si la préparation des échantillons pour les SEM, Fix disséqué os temporaux dans SEM fix (voir 1.7) pendant 2 heures à la température ambiante. Laver par rinçage dans 1,5 ml ou plusieurs tampons Hepes 3 fois pendant 5 min sur un nutator avec agitation accrue. Magasin à tampon Hepes à 4 ° C jusqu'à traitement ultérieur. Stockage supérieur à un couple de la semaines est pas recommandée.

5. L'immunohistochimie

1. Effectuer immunohistochimie sur des échantillons disséqués dans un puits d'une plaque à 96 puits à fond plat. Sinon, utilisez un PCR ou microtube. Il est conseillé de conserver la partie vestibulaire du labyrinthe osseux pour faciliter le traitement.
2. Perméabiliser tissu par incubation dans 1,5 ml de tampon Triton pendant 1 heure à température ambiante sur une nutator sous agitation douce.
3. Bloquer le tissu par incubation dans 0,5 ml de Triton bloc pendant au moins une heure à température ambiante. Si en utilisant des anticorps primaires soulevées dans la souris, ajouter des fragments IgG anti-souris Fab au bloc à une dilution de 1 pour 200 (voir section 1.4). Cela diminue grandement la liaison non spécifique de l'IgG anti-souris de tissu de souris.
4. Incuber le tissu avec des anticorps primaires dilués dans Triton bloc O / N à 4 ° C sous agitation douce. dilution anticorps dépend anticorps utilisés (voir section 6.1). Alternativement incuber antibodie primaires pendant 2 heures à température ambiante. Idéalement utiliser un volume minimal de 0,5 ml de dilution de l'anticorps primaire. Si l'anticorps est limitée, utiliser la plus petite quantité d'anticorps dilution qui enveloppe complètement le tissu.
5. Laver le tissu par rinçage dans 1,5 ml ou plusieurs tampons Triton, un minimum de 3 fois pendant 15 minutes, sur un nutator avec agitation accrue.
6. Incuber le tissu avec des anticorps secondaires conjugués à des colorants fluorescents dilué aux fabricants concentration recommandée (typiquement 1: 200 à 1: 1000) dans le bloc Triton pendant 1 heure à température ambiante sur une nutator. Utiliser un volume minimal de dilution d'anticorps secondaire de 0,5.
   1. Centrifuger l'anticorps secondaire dilué à 13 000 g pendant 3 min avant l'utilisation pour réduire au minimum la liaison non spécifique des agrégats d'anticorps secondaire. Protéger le tissu de la lumière à partir de cette étape en avant pour éviter photoblanchiment les colorants fluorescents.
7. Comme à l'étape 5.5, laver les tissus par rinçage dans 1,5 ml de tampon Triton ou plus, au moins 3 fois pendant 15 minutes, sur unenutator avec agitation accrue. Conserver les échantillons dans du PBS à 4 ° C jusqu'au moment de monter.

6. Sélection Anticorps

NOTE: La source d'anticorps recommandées et leurs dilutions sont indiquées dans la Table des matières et équipements spécifiques. Effectuer incubations d'anticorps comme décrit au chapitre 5.

1. Pour visualiser le kinocil base microtubules, utiliser un ciliaire axonème marqueur tel que anti-Arl13b (1: 1000) ou anti-acétyle-α-tubuline (1: 800). Visualiser le corps de base en utilisant un anticorps contre la γ-tubuline (1: 200) ou tout autre marqueur centrosomale.
2. Pour visualiser les filaments d'actine faisceaux stéréocils riche, ajouter phalloïdine (1: 300 - 1 000), conjugué à une ou plusieurs fluorophores différents de l'incubation de l'anticorps secondaire. Phalloïdine étiquettes également d'autres structures d'actine filamenteuse dont les filaments d'actine corticale autour de la périphérie de chaque cellule épithéliale cheveux. Ceci est utile pour déterminerle contour de chaque cellule de cheveux. Utilisez un marqueur membranaire alternative comme anti-Zo-1 (1: 500), si nécessaire.
3. Marquer les cellules ciliées de la cochlée en utilisant des anticorps contre la myosine VI (1: 1000) ou la myosine VIIa (1: 1000). Ceux-ci peuvent être utilisés si l'évaluation de la longueur de la cochlée.

REMARQUE: utiliser des anticorps secondaires appropriés colorant fluorescent conjugué optimisé pour les exigences de microscope.

7. Montage et imagerie

1. Placer l'échantillon dans un plat à base de silicone élastomère noir contenant du PBS. En utilisant des pinces fines, retirez la région vestibulaire de la spirale cochléaire.
2. Très retirer délicatement le cartilage sous-jacent et le mésenchyme de la spirale cochléaire. La spirale cochléaire restant contient le sillon interne, organe de Corti et sillon externe.
3. Transférer la spirale cochléaire dans une goutte de PBS placé sur une lame de microscope. Si on le désire, séparer la spirale cochléaire en morceaux équivalents à un tour. Cette étape est inutile cependant, et peut conduire à loss du tissu. La surface apicale (côté stéréocils) des cellules ciliées de la cochlée doit être orientée vers le haut en direction de la lamelle.
4. Évacuer la PBS avec un tissu absorbant ou un morceau de papier filtre et doucement repositionner la spirale cochléaire si l'épithélium a changé et chevauche sur lui-même.
5. Ajouter une goutte de milieu de montage directement sur l'échantillon de cochlée et placer délicatement une lamelle sur le dessus, en prenant soin d'éviter les bulles d'air. Aucun entretoises sont nécessaires; placer la lamelle directement sur l'échantillon. A, non-fluorescent soluble dans l'eau, milieu de montage semi-permanent qui ne nécessite pas des mesures supplémentaires pour maintenir la lamelle en place est recommandée. Milieu de montage et l'épaisseur de la lamelle doivent être adaptés aux spécifications microscope.
6. Utiliser un microscope à épifluorescence ou à balayage laser à foyer commun équipé d'un fort grossissement (63 - 100X), l'ouverture numérique élevée (1.2 - 1.4) des objectifs pour capturer des images de la surface apicale de la cellule capillaire cochléaire. Utilisez loobjectifs wer (5 - 20X) pour prendre des images se chevauchant de la spirale cochléaire pour quantifier la longueur du conduit cochléaire. Correspondre lasers d'excitation et des filtres d'émission aux fluorophores utilisés pour des anticorps secondaires.

8. microscopie électronique à balayage

1. Continuer à partir de la section 4.3. Après avoir lavé les échantillons SEM fixes dans un tampon Hepes, effectuez les étapes suivantes sous ventilation. Le protocole suivant fonctionne bien pour les tissus cochlée et évite l'utilisation d'un revêtement par pulvérisation cathodique d'un métal conducteur.
2. Post-correction dans une OsO _4% dans un tampon HEPES pendant 1 heure, suivi de 3 lavages avec 1 ml d'eau distillée pendant 5 minutes à chaque fois. Le plus petit volume de OsO ₄ qui enveloppe complètement le tissu doit être utilisé pour réduire les déchets toxiques. Aucune agitation est nécessaire.
3. Incuber les échantillons à la température ambiante dans chacune des solutions suivantes pendant 1 heure avec 3 lavages avec 1 ml d'eau distillée pendant 5 minutes à chaque fois entre les deux étapes: l'acide tannique à 1% fraîchement préparé dans de l'eau et de filnominatives avant utilisation; 1% OsO ₄ dans l'eau, de l'acide tannique à 1% dans l'eau, 1% de OsO ₄ dans l'eau.
4. Déshydrater les échantillons à travers un bains successifs d'éthanol par mise en incubation pendant 10 min dans chacune des dilutions suivantes: 30, 50, 70, 90 et 95%. Aucune agitation est nécessaire.
5. échantillons de transfert à travers trois changements, 5 minutes chacun, de 100% d'éthanol (à partir d'une bouteille récemment ouvert de 200 éthanol preuve).
6. Exécutez les échantillons par un point critique plus sec en suivant les instructions du fabricant.
7. Monter les échantillons en utilisant un adhésif de carbone conducteur au-dessus d'un tronçon avant SEM imagerie sur un microscope électronique. Sous un stéréomicroscope, utiliser une paire de pinces fines et un pinceau pour placer doucement l'échantillon avec les épithéliums cochléaires vers le haut. Utiliser la partie vestibulaire de l'échantillon à «ancre» les tissus à l'embout. Conserver les échantillons dans un dessiccateur jusqu'à imagerie. Effectuer imagerie SEM comme décrit dans Jones (2012) ^21.

9.Quantification

1. Après la préparation de l'immunohistochimie, acquérir des images en utilisant une épifluorescence ou à balayage laser confocal microscope. Après la préparation de SEM, utiliser un microscope électronique à balayage à l'image des spécimens. L'image de la surface apicale de l'organe de Corti avec les cellules ciliées de la cochlée exposées et les cellules de soutien intercalées.
2. Définir des positions spécifiques le long du canal cochléaire, telles que 25, 50, et 75% de la base et les utiliser pour comparer les régions cochléaires entre les échantillons de mutants et de contrôle. Analyser et comparer les mutants cils avec leurs contrôles même portée, que les différences de fond génétique peuvent modifier le phénotype cochléaire.
   NOTE: L'organe de Corti se développe dans un gradient qui va du milieu de la base à la fois vers le sommet et la base. Chez la souris, le développement est pas complète tant que P14, il est donc important de comparer les régions à des stades et des postes de perfectionnement similaires.
3. Prenez des photos en utilisant le logiciel accompagnant le microscope qui allow pour la quantification du phénotype particulier selon les besoins (voir ci-dessous). Utilisez un logiciel d'analyse d'image tels que Image J ou le logiciel qui accompagne le microscope pour mesurer des longueurs, compter les cellules et de déterminer la localisation des protéines comme décrit ci-dessous. Graphique ces données sous forme de graphique à barres, diagramme de dispersion, boîte blot ou histogramme, comparant le contrôle de contre mutant.
4. La longueur totale du canal cochléaire (figure 3A):
   1. L'utilisation d'un marqueur de cellule de cheveux ou phalloïdine, (qui marque les faisceaux stéréocils), de déterminer et de mesurer où l'épithélium sensoriel commence et se termine. La longueur du conduit cochléaire est souvent abrégé en mutants cils.
5. Anomalies des faisceaux stéréocils (Figure 3B, D, E, G):
   1. Mesurer convexité faisceau (la hauteur) que la plus courte distance entre le sommet de la botte et la ligne qui traverse les deux extrémités du faisceau «bras» comme illustré sur la figure 3G, à gauche. Sinon, quantifier la zoneentouré par les bras de faisceau externe stéréocils des cellules ciliées comme le montre la Figure 3G, à droite. Si les cellules ciliées des faisceaux stéréocils circulaires peuvent être identifiés comptent ceux-ci en tant que pourcentage du total des cellules ciliées.
      NOTE: Dans de nombreux mutants ciliaires anomalies bundle peuvent être observés indépendamment de l'orientation bundle. Il est difficile de quantifier avec précision les anomalies bundle stéréocils.
6. L'orientation des faisceaux stéréocils (Figure 3B, C, G):
   1. Évaluer l'orientation de chaque faisceau individuel par rapport à une ligne perpendiculaire à la ligne de cellules de pilier qui sépare les cellules ciliées internes et externes. Les cellules avec une orientation normale sont alignées le long de cet axe perpendiculaire, et ils ont donc une rotation de 0 °. Déterminer les angles de rotation en utilisant soit une notation de 360 ​​° ou des écarts absolus de 0 °.
7. Positionnement Kinocilia ou de positionnement de faisceau stéréocils (Figure3B, F, H):
   1. Compter le pourcentage de cellules dans lesquelles kinocilia sont manquants. Mesurer la distance entre le kinocil au «sommet» ou centre du faisceau. Le «sommet» du faisceau peut ne pas être facile de définir si les faisceaux sont anormaux, et donc le centre du faisceau peuvent être utilisés à la place.
8. Quantifier la position de kinocilia stéréocils et faisceaux sur la surface des cellules ciliées apicale, en superposant une grille de positionnement sur chaque cellule de cheveux et le marquage de l'emplacement de la base soit de la kinétocil ou le sommet / centre du faisceau stéréocils. Afficher les données en pourcentage de chaque catégorie qui se trouve dans une région particulière de la grille, et en recouvrant les emplacements de chaque marquage sur une grille de positionnement.
   REMARQUE: Dans les tissus de contrôle, kinocilia sont toujours attaché au sommet du faisceau stéréocils. Dans mutants cils, kinocilia sont souvent absents, encore mislocalized encore attaché, ou même complètement détaché des sbundle tereociliary.
9. Longueur Kinocilia (figure 3I):
   1. Mesurer la longueur de la kinocil par marquage avec un marqueur ciliaire axonème. mesurer que kinocilia qui reposent à plat dans un plan confocal 1,5 um. Confirment que les cils sont allongés à plat par l'observation d'une vue en coupe transversale du tissu analysé. Comparer les échantillons appariés âgés de la même région de la cochlée depuis le kinétocil se rétracte au cours du développement.
10. Mauvaise localisation des protéines de polarité:
    1. Suite à l'immunohistochimie en utilisant des anticorps contre les protéines de polarité tels que Vangl2 et Gai3, déterminer la localisation via l'imagerie.

NOTE: Dans certains mutants cils, localisation des protéines de polarité est perturbé. Ceux-ci comprennent Vangl2 et Gai3, qui se sont révélés être perturbé dans Ift20, Bbs8 et BBS6 cochlée mutant.

NOTE: D'autres exemples de la façon de quantifier et de cheveux d'affichage cellule Polarity peuvent être trouvés dans les documents suivants. Curtin, et al. (2003) Current Biology ^22, Montcouquiol, et al. (2003) Nature ^7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience ^23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biology ^24, mai-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology ^25, Yin et al (2012) PloS One ^26.

Résultats

Cochlée Dissection et de tissus Préparation

Après l'élimination du cerveau, après la mi-ligne dissection sagittal d'une tête P0 de la souris, le labyrinthe osseux, vu de derrière, peut être visualisée (Figure 1A, flèche blanche) et enlevé. Figure 1B montre les labyrinthes osseuses isolées avec les cheveux cochléaire vers le haut, ventrale, (à gauche) et de l'arrièr...

Discussion

Lors de la préparation des tissus cochléaire pour l'analyse, il y a quelques points clés à garder à l'esprit. Tout d'abord, les différences de fond génétique peuvent modifier le phénotype cochléaire, ce qui rend nécessaire d'analyser et de comparer les seuls contrôles même portée. Deuxièmement, l'élimination complète de la membrane de Corti est nécessaire pour obtenir les meilleures images avec immunohistochimie et est essentielle pour SEM. La membrane de Corti est une structure opaque et peut obscur...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Outils/Matériel
Élastomère de silicone - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	Voir note 2
Micro ciseaux de dissection-lame droite	Divers
Pinces fines (n° 5 et 55) et pinces émoussées	Divers
Microscope de dissection.	Divers
Lames de microscope en verre non revêtu	Divers
lamelles de protection de microscope (22 mm & times ; 40 mm & times ; 0,15 mm)	Diverses
pipettes de transfert	Diverses
broches Minutien	; Outils de haute science	26002-10
Porte-échantillon MEB	tousimis	8762
Goujons de microscopie électronique à balayage	TED PELLA	16111
PELCO Tabs : Adhésif carbone	TED PELLA	16084-3
Microscope fluorescent	Divers
Sécheur de points critiques	Divers
Microscope électronique à balayage	Diverses
lames de microscope en verre	Diverses
lamelles en verre	Divers
tissus Kimwipe  ;	Divers
réactifs
fins pour pinceau
1& fois ; Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco/Life Technologies	10010023
le paraformaldéhyde  ; (PFA) (Grade EM requis pour EM)	Divers		Préparez une solution à 4 % en 1& fois ; PBS a fait du frais à chaque fois. Grade EM requis pour EM.
2.5 % Glutaraldehyde Grade1	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl (pH 7.5)	Divers
NaCl	Divers
CaCl 2	Divers
Triton X-100	Divers
Sérum de chèvre normal	Divers
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G Média de montage	SouthernBiotech	0100-01
10× ; Celui de Hanks Solution saline équilibrée (HBSS)	Gibco/Life Technologies	14065
Hepes	Gibco/Life Technologies	15630-080
Tétroxyde d’osmium (OsO4 )	Sigma-Aldrich/Fluka Analytical	75632
Acide tannique	Sigma-Aldrich	403040
Éthanol 200 proof	Divers
Anticorps
anti Arl13b	Protein Tech	17711-1-AP	Concentration suggérée 1:1 000
anti tubuline acétylée (611-B1)	Sigma-Aldrich	T6793	Concentration suggérée 1:800
anti gamma tubuline (GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557	Concentration suggérée 1:200
anti Zo_1  ;	Invitrogen	40-2300	Concentration suggérée 1:500
Myosine VI	Proteus Biosciences	25-6791	Concentration suggérée 1:1000
Myosine VIIa	Proteus Biosciences	25-6790	Concentration suggérée 1:1 000
anti Vangl2	Merk Millipore	ABN373	Concentration suggérée 1:250
anti G&alpha ; i3	Sigma-Aldrich	G4040	Concentration suggérée 1:250
Alexa Fluor® ; 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Concentration suggérée 1:300 - 1 000
Alexa Fluor® ; 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Concentration suggérée 1:300 - 1 000