Cultures Génération fibroblastes primaires de souris oreilles et la queue tissus

Résumé

Nous décrivons une procédure expérimentale simple et rapide pour générer des fibroblastes primaires des oreilles et de la queue de souris. Le procédé ne nécessite pas de formation spécifique des animaux et peut être utilisé pour la production de cultures de fibroblastes des oreilles stockées à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours.

Résumé

Les cellules primaires sont directement dérivées de tissus et sont pensés pour être plus représentatif de l'état physiologique des cellules in vivo que des lignées cellulaires établies. Cependant, des cultures de cellules primaires ont habituellement une durée de vie limitée et doivent être fréquemment rétablie. Les fibroblastes sont une source facilement accessible de cellules primaires. Ici, nous discutons d'une procédure expérimentale simple et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes primaires de oreilles et la queue de souris. Le protocole peut être utilisé pour établir des cultures de fibroblastes primaires de l'oreille stockées à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours. Lorsque le protocole est soigneusement suivie, les contaminations sont peu susceptibles de se produire malgré l'utilisation de tissus non stérile stocké pendant le temps prolongé dans certains cas. Fibroblastes prolifèrent rapidement dans la culture et peut être étendu à un nombre important avant de subir sénescence réplicative.

Introduction

Les cellules primaires sont obtenues à partir de tissu cultivé et vivant dans des conditions in vitro. Il est généralement admis que les cellules primaires ressemblent davantage à l'état physiologique et le fond génétique du tissu dont ils sont issus de lignées cellulaires tumorales immortalisées ou ^1. Pour cette raison, les cellules primaires représentent un modèle utile pour étudier les questions biologique ^2,3. Cependant, à la différence des lignées cellulaires établies qui poussent indéfiniment, cellules primaires éventuellement subir la sénescence dans la culture et doivent être fréquemment rétabli.

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Protocole

Les souris ont été hébergés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes en conformité avec les directives institutionnelles jusqu'à l'euthanasie (Le institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) des lignes directrices à l'Université nationale de Singapour et le Comité consultatif national de laboratoire de recherche animale (NACLAR) Lignes directrices).

1. Souris

1. Commandez un clic de l'arrière-plan génétique approprié. Ce protocole est basé sur un tissu dérivé d'une souris C57BL / 6.

2. Préparation de milieu complet

1. Préparer un milieu complet e....

Résultats

Extraction à partir des résultats des fibroblastes de tissu dans une quantité importante de débris de tissu (Figure 1). Contrairement aux débris tissulaires, les fibroblastes adhèrent à des surfaces en plastique de culture de tissus entre 1 et 3 jours de culture. Le milieu de cultures de fibroblastes peut être modifié en toute sécurité le jour 3 de la culture, ce qui devrait réduire de manière significative les niveaux de débris présents dans la culture (Figure 2). Les fibroblastes prés.......

Discussion

Ici nous fournissons une procédure expérimentale simple, peu coûteux et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes primaires de oreilles et la queue de souris. L'extraction doit se traduire par des fibroblastes de division adhérentes et rapidement dans les 3 jours après l'isolement du tissu. Une limitation importante de cellules primaires est la sénescence, un arrêt de la croissance permanente ^15. En utilisant le protocole, les cultures de fibroblastes peuvent être passées de 5 à 6 fois ava.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Sérum de veau fœtal	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Pénicilline/Streptomycine	HyClone	SV30010
Éthanol	Merck Millipore	107017	Absolu pour l’analyse
Collagénase D	Roche Diagnostics	11088866001	De Clostridium histolyticum, lyophilisé, non stérile
Pronase protéase	Merck Millipore	53702	De Streptomyces griseus  ;
Tris tampon (pH 8)	1ère BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1ère BASE	BUF-1053	Grade biotechnologique
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1ère BASE	BUF-2040-10X4L
trypsine-EDTA ultra pure 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0,5 % de trypsine, 0,2 % d’EDTA, trypsine gamma irradiée par le procédé SER-TAIN, sans rouge de phénol, dans une solution saline
Amphotéricine B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 &mu ; g/ml dans de l’eau déminéralisée, stérile-filtré
Ciseaux	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 &mu ; Filtre seringue M	Sartorius Stedim	16534
70 &mu ; M strainer	SPL	93070
Piston de seringue	Terumo	SS+10L
Tube cryovial	NUNC	368362
Tube de microcentrifugation de 1,7 ml	Axygen	MCT-175-C
10 cm Plat de culture cellulaire	Greiner	664160	Plat traité pour culture cellulaire.
Tube à fond conique de 15 ml	Greiner	188271
Tube à fond conique de 50 ml	Greiner	227261
Bain-marie	GFL	1002
Centrifugeuse	Eppendorf	5810R
Agitateur d’incubation	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 microscope optique	Carl Zeiss AG

Solution de