Imaging potentiel de membrane avec deux types de capteurs codés génétiquement tension fluorescentes

Summary

Une méthode d’imagerie des changements de potentiel membranaire à l’aide d’indicateurs de tension génétiquement codés est décrite.

Abstract

Les indicateurs de tension génétiquement codés (GEVI) se sont améliorés au point de commencer à être utiles pour les enregistrements in vivo. Alors que l’objectif ultime est d’imager l’activité neuronale in vivo, il faut être capable d’imager l’activité d’une seule cellule pour garantir le succès des préparations in vivo. Cette procédure décrira comment imager le potentiel membranaire d’une seule cellule afin de fournir une base pour une imagerie in vivo. Nous décrivons ici des méthodes d’imagerie des GEVI constituées d’un domaine de détection de tension fusionné à une seule protéine fluorescente (FP) ou à deux protéines fluorescentes capables de transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) in vitro. L’utilisation d’un séparateur d’images permet de projeter simultanément des images créées par deux longueurs d’onde différentes sur la même caméra CCD. Le séparateur d’image positionne un deuxième cube de filtre dans le chemin de la lumière. Ce second cube filtrant est constitué d’un filtre dichroïque et de deux filtres d’émission permettant de séparer les longueurs d’onde fluorescentes donneuses et accepteuses en fonction des FP du GEVI. Cette configuration permet l’enregistrement simultané des partenaires fluorescents accepteurs et donneurs tandis que le potentiel de membrane est manipulé via la configuration d’une pince de patch de cellule entière. Lors de l’utilisation d’un GEVI composé d’un seul FP, le deuxième cube de filtre peut être retiré, ce qui permet aux miroirs du séparateur d’image de projeter une seule image sur la caméra CCD.

Introduction

L'objectif principal de cet article est de démontrer l'imagerie optique de l'évolution des potentiels de membrane in vitro utilisant des protéines fluorescentes codées génétiquement. changements d'imagerie du potentiel de membrane offre la possibilité intéressante de l'étude de l'activité des circuits neuronaux. Lorsque des changements dans la membrane résultat potentiel à un changement d'intensité de fluorescence, chaque pixel de la caméra devient une électrode de substitution permettant des mesures non intrusives de l'activité neuronale. Depuis plus de quarante ans, des colorants sensibles à la tension organiques ont été utiles pour observer les changements de potentiel ^1-4 membrane. Cependant, ces colorants manquent de spécificité cellulaire. En outre, certains types de cellules sont difficiles à teindre. indicateurs de tension génétiquement codés (GeViS) à surmonter ces limitations en ayant les cellules à étudier spécifiquement expriment la sonde fluorescente sensible à la tension.

Il existe trois classes de GeViS. La première classe de GEVI utilise la vodomaine de la phosphatase de détection de tension nsion détection soit avec une seule protéine fluorescente (FP) ^5-9 ou un transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) paire ^10-12. La seconde catégorie de capteurs utilise microbienne rhodopsine comme un indicateur fluorescent directement ou par l'intermédiaire ^{de 13 à 15} FRET électrochrome ^16,17. La troisième classe utilise deux composantes, la composante génétique étant une membrane ancrée FP et un second composant étant une membrane lié trempe colorant ^18-20. Tandis que les deuxième et troisième catégories sont utiles pour in vitro et trancher les expériences ^19,20, seule la première classe de capteurs sont actuellement utile pour des analyses in vivo ^6.

Dans ce rapport, nous allons démontrer l'imagerie du potentiel de membrane en utilisant la première classe de GeViS (Figure 1) in vitro. Cette première classe de capteurs de tension est le plus facile de faire la transition à l'imagerie in vivo. Depuis GeViS utilizing un domaine de détection de tension fusionné à un FP sont environ 50 fois plus brillante que la classe de rhodopsine de capteurs, ils peuvent être imagés en utilisant un éclairage à lampe à arc au lieu d'exiger un laser extrêmement puissant. Une autre conséquence de l'écart de brillance qui est la première classe de GeViS peut facilement dépasser l'auto-fluorescence du cerveau. Les sondes à base de rhodopsine ne peut pas. La troisième classe de capteur est tout aussi brillante que la première catégorie, mais nécessite l'ajout d'un extincteur chimique qui est difficile à administrer in vivo.

Nous allons donc démontrer l'acquisition d'une sonde avec une seule FP (Bongwoori) ⁸ et une sonde constituée d'une paire de FRET (Nabi 2) ^12. Le FRET construit dans le présent rapport sont des versions de papillon de VSFP-CR (protéines fluorescentes sensibles à la tension - Clover-mRuby2) ¹¹ consistant en un donneur fluorescente verte, Clover, et un accepteur de fluorescence rouge, mRuby2, nommé Nabi 2.242 et 2.244 Nabi

Figure 1. Deux types d'indicateurs codés génétiquement tension (GeViS) imagés dans le présent rapport (A) A __gVirt_NP_NN_NNPS<__ FP mono GEVI base ayant un domaine de détection de tension trans-membrane et une protéine fluorescente. (B) Un GEVI base de FRET composé d'un domaine de détection de tension trans-membrane, un donneur de FRET et l'accepteur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

déclaration éthique: Le protocole d'expérimentation animale a été approuvé par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité à KIST protocole animale 2014-001.

1. Équipement Setup

1. installation d'imagerie
   1. Placer un microscope à fluorescence inversée sur une table anti-vibrations. Utiliser un fort grossissement (60X lentille à immersion d'huile avec une ouverture numérique de 1,35) et une lentille d'objectif cube de filtre muni d'un miroir dichroïque et des filtres appropriés pour les protéines fluorescentes utilisées pour l'imagerie de tension.
      Remarque: Cette configuration utilise un microscope inversé afin d'employer des objectifs avec NA plus élevé, mais les microscopes droits peut également être utilisé. En effet, le microscope inversé est seulement pour le développement de la sonde depuis l'ouverture numérique élevée (NA) objectif recueille plus de lumière que l'une avec un faible NA améliorant ainsi le rapport signal sur bruit (SNR; peut être décrit comme le signal optique pic divisé par le écart-type de la ligne de basefluorescence) de l'enregistrement. Pour les non-développeurs, nous recommandons un microscope droit pour des applications telles que la tranche ou dans des enregistrements in vivo.
   2. Préparer une source de lumière, par exemple., Lampe à arc xénon, équipé d'un obturateur mécanique pour épifluorescence efficace imagerie à grand champ. Diriger la lumière vers le microscope par un guide de lumière monter. La lumière passe à travers le filtre d'excitation et est réfléchi par le premier miroir dichroïque dans le cube de filtre. Aligner la lumière pour éclairer l'échantillon de manière uniforme avec une intensité lumineuse maximisée sur le champ de vision ^21.
      Remarque: Traditionnellement, une lampe à arc de 75 watts a été utilisé depuis plus élevés des ampoules de puissance créent plus grande, mais pas les champs d'éclairement lumineux. Les lasers peuvent être utilisés, mais sont limités à une seule longueur d'onde. LED sont de plus en plus lumineux et peuvent en effet être la source de lumière de choix offrant de multiples longueurs d'onde et ne nécessitant pas un obturateur mécanique.
   3. Monter les deux caméras CCD à la Déessrence microscope comme le montre la Figure 2D.
      Remarque: La première caméra CCD a une résolution spatiale élevée et est utilisé pour l'identification d'une cellule exprimant le GEVI dans la membrane de plasma à tester. Pour les changements d'imagerie du potentiel de membrane, veiller à ce que la seconde caméra CCD a un taux de rafraîchissement élevé comme 1000 images par seconde (fps). Utiliser un adaptateur pour appareil photo à double accès (figure 2D (3)) pour passer la voie d'imagerie entre les deux caméras CCD. Dans cette configuration, un demagnifier est utilisé pour ajuster l'image à partir de l'objectif sur le capteur CCD dans la deuxième caméra CCD.
   4. Installer un séparateur d'image entre le premier (lent) et deuxième (rapide) des caméras CCD pour l'imagerie de base GEVI FRET. Insérer un cube de filtre ayant un miroir dichroïque (560 nm) et deux filtres d'émission (520 nm / 645 nm et 40/75) dans l'image séparateur. Cela se traduira par deux champs de vue, l'une pour la fluorescence du donneur et l'autre représentant la fluorescence de l'accepteur. Retirer ce seuxième filtre cube lors de l'imagerie d'un GEVI avec un seul FP.
      Remarque: La seule GEVI base FP testé cette méthode est Bongwoori qui utilise la FP, super écliptique pHluorin A227D (SE A227D). Le filtre d'excitation (472 nm / 30), un filtre d'émission (497 nm / temps de passage) et le miroir dichroïque (495 nm) ont été sélectionnés sur la base de son excitation et d'émission ⁵ spectres. En général, les filtres d'excitation et d'émission doivent avoir le plus grand chevauchement avec chaque spectre du fluorophore pour acquérir une image claire, tandis que les blocs de miroirs dichroïques toute la lumière d'excitation transmise à travers le filtre d'émission. Le choix de filtres et de miroirs dichroïques pour l'enregistrement sur ​​la base de la paire de FRET GEVI ¹¹ suit le même principe, sauf qu'elle nécessite un deuxième cube de filtre dans le diviseur d'image pour l'observation simultanée de donneur et l'accepteur de fluorescence. Le premier cube de filtre placé dans le boîtier de filtre à microscope a besoin d'avoir un filtre d'excitation (475 nm / 23) pour Clover. Ensuite, le émise fluorescence tant MF sera transmis au second cube de filtre à travers le premier miroir dichroïque (495 nm). Le deuxième cube de filtre comporte un miroir dichroïque (560 nm) et deux filtres d'émission (520 nm / 40 de trèfle et 645 nm / 75 pour mRuby2) pour chaque FP séparant ainsi la fluorescence à partir de deux points focaux différents.

		Simple GEVI base FP (Bongwoori)	FRET paire GEVI base (Nabi 2,42 et 2,44 Nabi)
Premier cube de filtre placé dans le microscope	filtre d'excitation	472 nm / 30	475 nm / 23
	miroir dichroïque	495 nm	495 nm
	filtre d'émission	497 nm / longue passe	-
Deuxième cube de filtre placé dans le diviseur de faisceau	miroir dichroïque	-
	filtre d'émission 1	-	520 nm / 40
	filtre d'émission 2	-	645 nm / 75

Tableau 1. Deux différents ensembles de filtre utilisé pour une GEVI FP base unique et une FRET à base de GEVI Recordings

2. l'isolement de vibration
   1. Ne pas monter tout équipement avec le déplacement des composants sur la table de l'isolation des vibrations. Vérifiez que les câbles qui sont attachés à l'équipement non isolé sont lâches pour éviter les vibrations de l'échantillon.
3. chambre de patch clamp
   1. Sceller le fond de la chambre de patch-clamp avec un mince # 0 couvercle verre depuis la distance de travail de l'objectif est relativement faible. Ceci est un inconvénient de la configuration de microscope inversé.
      Remarque: Comme un compromis d'avoir une haute objectif NA, la distance de travail diminue. Afin de placer le SPECIMen deçà de la distance de travail très court, le verre de protection et de la lamelle (étape 2) besoin d'être aussi mince que possible.
4. Contrôle de la température
   1. Assurez-vous que la solution de bain coule à travers un régulateur de température pour maintenir les cellules corrigées environ 33 ^o C pendant toute l'expérience.
5. connexions d'équipement
   1. Raccordez l'amplificateur de patch-clamp et l'obturateur mécanique de la source lumineuse à la baïonnette Neill-Concelman (BNC) boîte de commande de la caméra CCD haute vitesse. Cela permettra au logiciel d'imagerie pour contrôler l'amplificateur, la caméra et la source de lumière simultanément.
      Remarque: les composants électriques et d'imagerie doivent être synchronisées afin de fournir des enregistrements électriques et optiques simultanées de l'activité électrique.

Figure 2. ÉquipéInstallation ment pour l'imagerie de tension avec GeViS Le flux de travail suivant le chemin de lumière, (A) une lampe à arc 75W Xenon, (B) la lumière d'excitation de la lampe à arc est filtré par le filtre d'excitation et ensuite réfléchi par le premier miroir dichroïque avant de parvenir à la platine, un encart dans le coin supérieur droit montre la configuration cellule entière, (C) la caméra CCD de vitesse lente est utilisée pour aider à la fois le choix d'une pince de la cellule et le patch, (D) la partie d'acquisition d'image; (1) de la caméra CCD haute vitesse, (2) le séparateur de l'image à la fois paire de FRET et mono FP GeViS, (3) l'demagnifier pour adapter l'image sur le capteur CCD de la caméra CCD haute vitesse, (4) le double port adaptateur de caméra pour passer la voie d'imagerie et (5) la caméra CCD à vitesse lente à haute résolution spatiale pour l'identification de la cellule de patch, (E & F) l'acquisition d'image avec un GEVI base unique FP (E) et un GEVI base FRET(F). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Expression de GeViS

1. Dans rein embryonnaire humain 293 cellules
   1. La culture de rein embryonnaire humain 293 (HEK 293) avec les cellules du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de veau fœtal à 10% à 37 ^{° C dans} _{un incubateur à CO2} (5% CO _2). Utilisez une boîte de culture de tissu avec 100 mm de diamètre et 20 mm de hauteur. Démarrer la culture avec 2 x 10 ³ - 6 x 10 ³ cellules / cm ² et incuber jusqu'à ce qu'ils atteignent une confluence de 80 à 90% pour la transfection ultérieure.
   2. Le jour de la transfection, aspirer les milieux cellulaires et laver doucement une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Disperser les cellules HEK 293 avec une solution de trypsine-EDTA 0,25% pendant 1-2 min, aspirer la solution et tapotez doucement le côté de la boîte de détacher le caunes. Ajouter DMEM frais (10% de FBS) et dissocier les cellules agglomérées par pipetage. Déterminer la concentration des cellules en utilisant un hémocytomètre.
   3. Placer 0,08 - 0,13 mm d'épaisseur, 10 mm de diamètre lamelles de pré-revêtue avec de la poly-L-lysine dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Ensemencer les cellules HEK 293 sur des lamelles à 1 x 10 ⁵ cellules / cm de densité cellulaire ^2.
      Remarque: Comme les cellules HEK 293 sont capables de former des jonctions lacunaires avec l'autre, le nombre des semences doit donner des cellules isolées.
   4. Transfecter de manière transitoire des cellules avec une construction de gène codant pour une GEVI approprié en utilisant un réactif de lipofection en suivant les instructions du fabricant.
      Remarque: Les constructions génétiques utilisées pour cette étape pcDNA3.1 utilisée (Bongwoori) et pUB2.1 (Nabi 2.242) en tant que vecteurs de squelette. La quantité d'ADN utilisée était de 100 ng de chaque lamelle; Toutefois, les conditions de transfection ont besoin d'être déterminée de manière empirique pour chaque GEVI à tester.
2. Dans la hanche de la souris dissociéneurones primaires pocampal
   1. Disséquer hippocampes de jour embryonnaire 17 C57BL6 / N souris puis dissocier les neurones de l'hippocampe comme décrit précédemment ^22,23.
   2. Plate neurones dissociés SUR DES poly-D-lysine revêtus 0,08-0,13 mm d'épaisseur, 10 lamelles mm de diamètre à 1 x 10 ⁵ cellules / densité cellulaire ml. Incuber les cellules à 37 ^{° C dans} l'incubateur _CO2 (5% CO _2).
   3. Transfecter de manière transitoire des neurones dissociés à 6 - 7 jours in vitro (DIV) avec une construction de gène codant pour une GEVI en utilisant un réactif de transfection au phosphate de calcium comme décrit précédemment ^24.
      Remarque: Les constructions génétiques utilisées pour cette étape pcDNA3.1 utilisée (Bongwoori) et pUB2.1 (Nabi 2.244) en tant que vecteurs de squelette. La quantité d'ADN utilisée était de 1 pg pour chaque lamelle. Encore une fois, les conditions de transfection doivent être déterminées empiriquement pour chaque GEVI testé.
3. Vérifier le niveau d'expression avant tension imaging
   1. Prendre la plaque de culture de tissu à partir du CO ₂ incubateur et d'observer la fluorescence à partir des cellules transfectées dans un microscope à épifluorescence.
   2. Après confirmation de la fluorescence de la membrane, transférer la lamelle à la chambre patcher pour l'imagerie de tension dans la section 3.
      Remarque: L'imagerie de tension est effectuée 16 à 24 heures après transfection. Cependant, comme différentes protéines fluorescentes ont différents temps de maturation, certains GeViS besoin de plus de temps en post transfection. Par exemple, les paires de FRET contenant mRuby2 dans ce protocole peuvent prendre plus de temps pour exprimer depuis la maturation des mRuby2 prend beaucoup plus de temps que Clover ^11. La fluorescence du donneur et accepteur doit être vérifié.

3. Tension Protocole Imaging

1. Choisissez une cellule saine avec une bonne expression membranaire
   1. En utilisant la microscopie, trouver une cellule saine (figure 4B) qui montre une fortemembrane fluorescence localisée par rapport à la fluorescence interne. Essayez de ne pas patcher cellules arrondies. cellules circulaires sont soit divisent ou mourants et sont difficiles à corriger. Appliquer une impulsion de test de 5,0 mV en ms amplitude et de 5,0 dans la durée pour aider ultérieures expériences de patch-clamp.
2. Préparer la cellule pour l'imagerie de tension
   1. Après avoir choisi une cellule de patch, placez la pipette de patch-clamp dessus de la cellule. Apportez la pipette vers le bas jusqu'à ce qu'il touche la membrane cellulaire. À cette étape, observer 1 MQ - 2 MQ montée de la résistance de la membrane sur le logiciel de patch clamp ^25.
      NOTE: De temps en temps, un joint bonne giga-ohms peut se produire simplement en touchant la membrane cellulaire. Tant que le joint giga-ohms est stable, il devrait être OK.
   2. Établir un joint giga-ohms en appuyant légèrement négative à travers la pipette. Réglez le potentiel de la pipette à un potentiel de maintien souhaitée.
   3. Tout en maintenant le sceau giga-ohms, l'image the cellule avec la caméra CCD à haute vitesse et de se concentrer à la surface de la membrane.
   4. Rompre la membrane cellulaire en appliquant des impulsions d'aspiration par la bouche ou de la seringue doucement pour effectuer une configuration cellule entière ^26.
   5. Imager la pièce serrée cellule dans une configuration de serrage de l'ensemble de cellules en fonction de la conception expérimentale en utilisant un logiciel d'imagerie
      1. Démarrez le logiciel d'imagerie. Cliquez sur [Acquérir] - [SciMeasure Caméra] menu pour ouvrir la page 'CCD ACQUIRE'.
      2. Créer un nouveau fichier de données pour enregistrer les images.
      3. Cliquez sur [SORTIE ANALOGIQUE], puis [Lire ASCII] pour ouvrir un fichier de protocole d'impulsions de procéder à l'imagerie. Cliquez sur 'la moyenne des répétitions internes »si les données doivent être en moyenne. Puis fermez la page «Sortie analogique».
         Remarque: Ce protocole d'impulsion doit être conçu et enregistré dans un fichier '.txt' selon le but de chaque expérience avant cette étape.
      4. Réglez acquis spécifiqueparamètres de dé de la page «CCD ACQUIRE '. Saisissez les valeurs spécifiques pour 'Nombre de cadres pour l'acquisition »et« Nombre d'essais ».
         Note: Le nombre de trames est déterminé par la vitesse de l'acquisition et le moment où le protocole d'impulsions. Par exemple, si l'imagerie à 1 kHz, 1.000 images est égal à 1 sec de temps d'enregistrement.
      5. Cliquez sur [prendre des données (Optique + BNC)] pour lancer l'enregistrement. Alors que l'imagerie de tension est en cours, voir la fenêtre de l'oscilloscope à partir du logiciel de patch-clamp pour assurer configuration cellule entière stable tout au long de l'enregistrement.
         Remarque: Pour tester gamme de tension sensible du GEVI, la taille du signal dans AF valeur / F ou résolution temporelle sur toute la plage de tension physiologique, mener ensemble une expérience de serrage de tension de cellule avec des impulsions de tension d'un protocole d'impulsions ayant intensifié allant de -170 mV à 130 mV. Pour déterminer la performance de l'GEVI dans la résolution des potentiels d'action évoqués de prima cultureneurones ry, l'image de la cellule dans une configuration de serrage courant de cellule entière.

4. Acquisition de données

1. Calcul de AF / F
   1. Démarrez le logiciel d'imagerie. Cliquez sur [File] - [Fichier de données Lire] pour ouvrir un fichier de données à analyser. Observez l'image de la cellule dans son intensité repos Light (RLI) sur le côté droit
      Remarque: Les moyennes de logiciels les 5 premières images pour déterminer RLI de l'enregistrement.
   2. Cliquez sur «Afficher BNC» pour amener les valeurs de courant et de tension mesurées à l'écran.
   3. Changer le mode de «cadre RLI 'de la page de« soustraction de Frame' d'utiliser la fonction cadre de soustraction d'identifier pixels avec des signaux optiques sensibles. Telle est la véritable puissance de l'imagerie puisque chaque pixel peut être examiné pour des changements potentiels de fluorescence.
   4. Sélectionnez deux points dans le temps (F ₀ et F ₁₎ pour la soustraction. Identifier la zone de la cellule estmontrant des signaux sensibles à membrane changement potentiel.
      Remarque: Le SNR pour les images cadre de soustraction peut être améliorée en sélectionnant plusieurs images pour chaque point de temps de la moyenne temporelle du signal. Le logiciel soustrait l'intensité lumineuse moyenne tirée des images sélectionnées et calcule les F ₁ -F ₀ valeurs (AF). Habituellement, on choisit un point acquis au point de potentiel et une autre fois maintenant pris au cours de la période de stimulation temps.
   5. Désigner les pixels qui doivent être analysés en faisant glisser ou en cliquant sur chaque pixel avec la souris d'ordinateur. Observer la représentation graphique de l'intensité de fluorescence moyenne des pixels sélectionnés dans la partie gauche de la fenêtre de logiciel. Les figures 4B et 5B montrent des images représentatives de l'analyse cadre de soustraction.
   6. Diviser les pixels soustraits par le RLI (F _0). Cliquez sur [Diviser par RLI] pour acquérir des valeurs AF / F
2. Exporter des données
   Calculer les valeurs AF / F pour chaque échelon de tension d'analyser plus tension propriétés de détection de la GEVI. Utilisez ces valeurs pour dessiner des graphiques telles que AF / F fonction de la tension pour les données ultérieures analyses.
3. Retirer graphiques courant et de tension par décliquetage menu 'Show BNC de. Allez dans [SORTIE] - [Enregistrer Traces tel qu'il apparaît (ASCII)] pour exporter la trace de fluorescence dans un format de fichier ASCII pour la courbe d'analyse approprié par un logiciel graphique standard.

Analyse 5. Données

1. Tension propriété détection du GEVI
   1. Dessinez le changement de fluorescence fonction de la tension graphique (FV) en reportant les valeurs AF / F fonction de la tension dans un programme d'analyse de données. Monter la courbe d'une fonction de Boltzmann (tableau 2) pour déterminer la plage de tension du signal optique en cliquant sur ​​[Analyse] - [Appareillage] - [ajustement Sigmoidal] - [dialogue Ouvrir], puis choisissez la fonction Boltzmann.
      Remarque: Montage d'une fonction rend possible de caractériser les propriétés de tension de détection de différentes sondes de tension et de comparer leurs performances dans des cellules différentes. La fonction Boltzmann peut être utilisé pour les sondes testées dans le présent document parce que les courbes de ces sondes FV montrent motif sigmoïde.
   2. Normaliser chaque valeur AF / F en utilisant les valeurs initiales et finales (A ₁ et A ₂₎ calculé par la fonction.
      Remarque: Dans l'équation de Boltzmann, le minimum est de ₁ A et un maximum de _{A 2.} Pour la normalisation, utiliser un logiciel de tableur pour ajuster les valeurs AF / F en définissant A _{1 et A 2} zéro comme l'un. La moyenne des Af normalisée valeurs / F et calculer l'erreur-type pour l'analyse statistique.
   3. Replot l'AF normalisée / valeurs de F par rapport à la tension tel que décrit précédemment dans la section 5.1.1).
2. La vitesse de la réponse optique
   1. Ouvrez le fichier ASCII acquis de l'étape 4.2.2) avec une analyse de donnéesprogramme et tracer la trace AF / F en fonction du temps.
   2. Cliquez sur "sélecteur de données 'dans le logiciel d'analyse de données et de sélectionner un point de temps correspondant au début d'une impulsion de tension étagée et un second point lorsque le signal optique a atteint l'état d'équilibre du temps. Monter cette gamme à la fois une fonction de décroissance exponentielle simple et double en cliquant sur [Analyse] - [Appareillage] - [ajustement exponentiel] - [dialogue Ouvrir], puis choisissez une fonction de décroissance exponentielle. Signaler le meilleur ajustement.
      Remarque: En ajustant les fonctions de décroissance exponentielle simple ou double, les constantes de temps quantifiés représentés par τ peuvent être acquises. Cela aidera expérimentateurs comparer la cinétique de leurs mesures effectuées avec différents indicateurs de tension. La trace de la fluorescence peut montrer des composants rapides et lents qui peuvent être décrits avec une double fonction exponentielle de décroissance. Dans ce cas, le calcul se traduira par deux constantes de temps avec des amplitudes différentes.
   3. calculer ee constantes de T permet pondérée de comparer la cinétique de sondes présentant deux composantes temporelles à sondes avec un seul composant.
      Remarque: Une tau pondérée est calculée comme la somme de τ _1, multipliée par l'amplitude relative, A _1, plus τ ₂ multipliée par l'amplitude relative, A _2, tel que défini par la formule suivante;

Results

De manière transitoire des cellules transfectées peuvent présenter une variation significative de l'intensité de fluorescence et le degré d'expression de la membrane plasmique. Même sur le même lamelle certaines cellules auront divers niveaux de fluorescence interne. Ceci est probablement dû à la quantité d'agent de transfection absorbé par la cellule. Parfois, trop expression provoque la cellule de connaître la réponse de la protéine dépliée résultant de l'apoptose ²⁷ (lumine...

Discussion

Le système nerveux utilise une tension de plusieurs manières différentes, l'inhibition entraîne une légère hyperpolarisation, entrée synaptique provoque une légère dépolarisation et une action résultats potentiels d'une variation relativement importante de tension. La capacité de mesurer les changements dans le potentiel de membrane par GeViS offre le potentiel prometteur de l'analyse de plusieurs composants de circuits neuronaux simultanément. Dans ce rapport, nous démontrons une méthode fondamentale pour l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope inversé	Objectif Olympus	IX71
60X (ouverture numérique = 1,35)	Olympus	UPLSAPO 60XO
Filtre d’excitation	Semrock	; FF02-472/30	Pour l’imagerie de tension de la pHluorin super écliptique dans le
miroir dichroïque	Semrock	FF495-Di03-25x36
Filtre d’émission	Semrock	FF01-497/LP
75W Lampe à arc au xénon	CAIRN	OptoSource Illuminator	Les LED et les lasers sont également des sources lumineuses efficaces
Caméra CCD à vitesse lente	Hitachi	KP-D20BU
Adaptateur de caméra à double port	Olympus	U-DPCAD
Caméra CCD haute vitesse	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
Séparateur d’images	CAIRN	Optosplit 2
Filtre d’excitation	Semrock	FF01-475/23-25	Pour l’imagerie de tension de GEVI basé sur une paire FRET composée de Clover et mRuby2)
Miroir dichroïque	Semrock	FF495-Di03-25x36
Filtre anti-émission	Chroma	ET520/40
Miroir dichroïque	Semrock	FF560-FDi01-25X36
Filtre anti-émission	Chroma	ET645/75
Système d’isolation des vibrations	Systèmes cinétiques	250BM-IC, 5702E-3036-31
Chambre de brassage	Warner instruments	RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)	Electron Microscopy Sciences	72198-20
Régulateur de température	Warner instruments	TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm de diamètre lamelle en verre	Ted Pella	260366
Lipofection	agent Life Technologies	11668-027
Réactif de phosphate de calcium	Clontech - Takara	631312
Amplificateur à pince de patch	HEKA	EPC 10 Amplificateur
Logiciel d’acquisition de données multicanaux	HEKA	Patchmaster
Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images	RedShirtImaging	Neuroplex
Tabsheet Logiciel d’application	Microsoft	Microsoft Excel 2010
Logiciel	d’analyse de donnéesOriginLab	OriginPro 8.6.0
Loupe	Qioptiq LINOS Optom	coupleur de caméra standard 0.38x SC38 J clamp
Microscope confocal	Nikon	Nikon A1R Réactif
anti-décoloration	Life Technologies	P36930