Article de méthode

Au-Interaction des SLP1 Polymères et monocouche de

DOI :

10.3791/53572

⸱

19 janvier 2016

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1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Dans cet article

Résumé

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Pour obtenir des informations de base sur la sorption et le recyclage de l’or à partir de systèmes aqueux, l’interaction des nanoparticules d’Au(III) et d’Au(0) sur les protéines de la couche S a été étudiée. La sorption des polymères protéiques a été étudiée par ICP-MS et celle des monocouches protéiques par QCM-D. L’AFM subséquente permet d’imager les nanostructures.

Résumé

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Dans cette publication, le comportement de sorption de l’or des protéines de la couche superficielle (couche S) (Slp1) de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 est décrit. Ces biomolécules s’organisent en réseaux bidimensionnels paracristallins sur les surfaces, lient les métaux et sont donc intéressantes pour plusieurs applications biotechniques, telles que les matériaux biosorptifs pour l’élimination ou la récupération de différents éléments de l’environnement et les processus industriels. Le dépôt de nanoparticules d’Au(0) sur les couches S, soit par synthèse dirigée de la couche S 1, soit par adsorption de nanoparticules, ouvre de nouvelles possibilités pour diverses applications sensorielles. Bien que de nombreuses études aient décrit les propriétés biosorptives des couches S 2 à 5, une compréhension plus approfondie de l’interaction protéine-protéine et protéine-métal reste encore un défi. Dans l’étude suivante, la spectrométrie de masse à couplage inductif (ICP-MS) a été utilisée pour la détection de la sorption des métaux par les couches S en suspension. Cela a été corrélé aux mesures de microbalance à cristal de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D), qui permet la détection en ligne de la formation de monocouches protéiques et du dépôt de métal, et donc, une compréhension plus détaillée de la liaison métallique.

Les résultats de l’ICP-MS ont indiqué que la liaison de l’Au(III) aux polymères de la couche S en suspension dépend du pH. La liaison maximale d’Au(III) a été obtenue à un pH de 4,0. Les investigations QCM-D ont permis de détecter la sorption de l’Au(III) ainsi que le dépôt de NP Au(0) en temps réel pendant les expériences in situ. De plus, cette méthode a permis d’étudier l’influence de la liaison métallique sur la stabilité du réseau protéique de Slp1. Les propriétés structurelles et la stabilité de la couche protéique ont pu être visualisées directement après l’expérience QCM-D à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). En conclusion, la combinaison de ces différentes méthodes permet une compréhension plus approfondie de la liaison des métaux par les protéines bactériennes de la couche S en suspension ou sous forme de monocouches sur des cellules bactériennes ou des surfaces recristallisées.

Introduction

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En raison de l'utilisation croissante de l'or pour plusieurs applications comme l'électronique, les catalyseurs, les biocapteurs, ou des instruments médicaux, à la demande de ce métal précieux a augmenté au cours du temps de ces dernières années 6-9. Or, ainsi que beaucoup d'autres métaux précieux et lourds sont libérés dans l'environnement par les effluents industriels à des concentrations diluées, à travers des activités minières, et l'élimination des déchets 7,8,10, bien que la plupart contamination de l'environnement par des métaux lourds ou précieux est un processus continu principalement causés par des activités technologiques. Cela conduit à une interférence significative des écosystèmes naturels et pourrait menacer la santé humaine 9. La connaissance de ces résultats négatifs favorise la recherche de nouvelles techniques pour éliminer les métaux provenant des écosystèmes et des améliorations dans le recyclage des métaux contaminés des eaux usées industrielles. Bien établies méthodes physico-chimiques comme la précipitation ou échange d'ions ne sont pas si efficaces, surtout en hauteLy dilué solutions 7,8,11. Biosorption, soit avec la vie ou la biomasse morte, est une alternative intéressante pour le traitement des eaux usées 10,12. L'utilisation de ces matériaux biologiques peut réduire la consommation de produits chimiques toxiques. De nombreux micro-organismes ont été décrits à accumuler ou d'immobiliser les métaux. Par exemple, les cellules de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 ont montré des capacités de liaison élevée pour les métaux précieux, par exemple, Pd (II), Pt (II), Au (III), et d'autres métaux toxiques comme le plomb (II) ou U (VI) 4,13, les cellules de Bacillus megaterium pour Cr (VI) 14, les cellules de Saccharomyces cerevisiae de Pt (II) et Pd (II) 15, et Chlorella vulgaire de Au (III) et U (VI) 16 , 17. La liaison des métaux précédents comme Au (III), Pd (II), et Pt (II) a également été rapportée pour Desulfovibrio desulfuricans 18 et L. sphaericus JG-B53 19,20. Néanmoins, pas all microbes lient des quantités élevées de métaux et leur application en tant que matériau de sorption est limitée 12,21. En outre, la capacité de liaison du métal dépend de différents paramètres, par exemple, la composition de la cellule, la bio-composant utilisé, ou de l'environnement et des conditions expérimentales (pH, force ionique, température, etc.). L'étude de fragments de paroi cellulaire isolés 22,23, comme les lipides membranaires, peptidoglycane, des protéines ou d'autres composants, aide à comprendre le processus de cellules entières construites complexes 8,21 liaison du métal.

Les composants de la cellule ont porté sur dans cette étude sont des protéines de la couche S. Les protéines de la couche S sont des parties de l'enveloppe cellulaire externe de nombreuses bactéries et archaebactéries, et ils constituent environ 15 - 20% de la masse totale en protéines de ces organismes. Comme la première interface pour l'environnement, ces composés cellulaires influencent fortement les propriétés de sorption 3 bactériennes. Les protéines de la couche S avec des poids moléculaires allant de quaranteà des centaines de kDa sont produites à l'intérieur de la cellule, mais sont assemblés à l'extérieur où ils sont capables de former des couches sur les membranes lipidiques ou polymériques composants de la paroi cellulaire. Une fois isolé, presque tous de la couche S protéines ont la propriété intrinsèque d'auto assembler spontanément en suspension, au niveau des interfaces, ou sur des surfaces planes ou formant tubulaires structures 3. L'épaisseur de la monocouche de protéine dépend de la bactérie et est dans une plage de 5 à 25 nm 24. En général, les structures des protéines de la couche S formés peuvent avoir une oblique (P1 ou P2), carré (p4), ou hexagonal (p3 ou p6) symétrie avec des constantes de réseau de 2,5 à 35 nm 3,24. La formation du réseau semble être dans de nombreux cas, dépendant des cations divalents et principalement sur ​​Ca2 + 25,26, Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). Néanmoins, la cascade de réaction pleine de monomère pliage, l'interaction monomère-monomère, la formation d'un réseau, et le rôle des différents métaux, en particulier des cations bivalents tels que Ca 2+ et Mg 2+, ne sont pas encore pleinement compris.

La souche de bactéries gram-positives L. sphaericus JG-B53 (renommé de Bacillus sphaericus après nouvelle classification phylogénétique) 27 a été isolé à partir de la pile de déchets des mines d'uranium "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saxe, Allemagne) 4,28,29. Son fonctionnelle de la protéine S-couche (SLP1) possède un réseau carré, un poids moléculaire de 116 kDa 30, et une épaisseur de ≈ 10 nm sur 31 cellules bactériennes vivant. Dans des études antérieures, la formation in vitro d'une couche de protéine fermée et stable d'une épaisseur d'environ 10 nm a été obtenue en moins de 10 min 19. La souche liée L. sphaericus JG-A12, également un isolat de la pile "Haberland", possède des capacités de liaison élevés des métaux et de sa protéine isolée de la couche S a montré un bon taux de sorption haute stabilité chimique et mécanique et pour les métaux précieux comme l'Au (III), Pt (II), et Pd (II) 4,32,33. Cette liaison de métaux précieux est plus ou moins spécifique pour certains métaux et dépend de la disponibilité des groupes fonctionnels sur la surface de protéine extérieure et intérieure du polymère et dans ses pores, la force ionique et le pH. Groupes fonctionnels pertinents pour l'interaction de métal par les protéines sont COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 -, et SO-. En principe, les capacités de liaison métalliques ouvrent un large éventail d'applications, Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). par exemple, en tant que composants biosorptive pour l'élimination ou la valorisationde métaux précieux ou toxiques dissoutes, des modèles pour la synthèse ou le dépôt de nanoparticules défini régulièrement structurés métalliques (IP) pour la catalyse, et d'autres matériaux de bio-ingénierie comme couches bio-sensorielle 3,5,18,33. NP tableaux disposés régulièrement comme Au (0) -NPs pourraient être utilisés pour des applications majeures allant de l'électronique moléculaire et les biocapteurs, des dispositifs de stockage ultra-haute densité, et des catalyseurs pour le CO-oxydation 34-37. Le développement de ces applications et la conception intelligente de ces matériaux nécessite une compréhension plus profonde des mécanismes contraignants de métal sous-jacent.

Une condition préalable pour le développement de ces matériaux à base de bio-est de la mise en œuvre fiable d'une couche d'interface entre la biomolécule et la surface technique 38,39. Par exemple, les polyélectrolytes assemblés avec la couche par couche (LBL) 40,41 technique ont été utilisées en tant que couche d'interface pour la recristallisation des protéines de la couche S 39 . Une telle interface offre une façon relativement facile à réaliser le revêtement de protéine d'une manière reproductible et quantitative. En effectuant des expériences différentes avec et sans modification avec les promoteurs adhésifs, il est possible de faire des déclarations concernant la cinétique de revêtement, la stabilité de la couche, et l'interaction des métaux avec des biomolécules 19,42, Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). Cependant, le mécanisme complexe de l'adsorption des protéines et l'interaction protéine-surface soit pas complètement compris. Surtout informations sur la conformation, l'orientation du motif, et les densités de revêtement est toujours manquant.

Microbalance à cristal de quartz avec la surveillance de dissipation (QCM-D) technique a attiré l'attention ces dernières années comme un outil pour l'étude de l'adsorption des protéines, de la cinétique de revêtement, et l'interaction proles processus à l'échelle du nanomètre 19,43-45. Cette technique permet la détection de masse en détail adsorption en temps réel, et peut être utilisé comme un indicateur pour le processus d'auto-assemblage de protéines et de couplage de molécules fonctionnelles sur 19,20,42,46-48 réseaux de protéines. En outre, les mesures QCM-D ouvrent la possibilité d'étudier les processus d'interaction de métal avec la couche protéique dans des conditions biologiques naturelles. Dans une étude récente, l'interaction de la protéine S-couche avec des métaux choisis comme Eu (III), Au (III), Pd (II), et Pt (II) a été étudié avec QCM-D 19,20. La couche de protéine adsorbée peut servir comme un modèle simplifié d'une paroi cellulaire des bactéries gram-positives. L'étude de ce seul composant peut contribuer à une meilleure compréhension de l'interaction de métal. Cependant, uniquement expériences QCM-D ne permettent pas de déclarations concernant les structures et les influences de métaux à la protéine de surface. D'autres techniques sont nécessaires pour obtenir ces informations. Un POSbilité pour l'imagerie bio-nanostructures et l'obtention d'informations sur les propriétés structurelles est la microscopie à force atomique (AFM).

L'objectif de l'étude présentée était d'enquêter sur la sorption de l'or (Au ​​(III) et Au (0) -NPs) aux protéines de la couche S, en particulier SLP1 de L. sphaericus JG-B53. Des expériences ont été faites avec des protéines en suspension sur l'échelle de lots dans une gamme de pH de 2,0 à 5,0 en utilisant l'ICP-MS et S-couches immobilisées en utilisant QCM-D. En outre, l'influence de la solution de sel métallique sur la stabilité du réseau a été étudié par des études ultérieures de la FAM. La combinaison de ces techniques contribue à une meilleure compréhension des processus in vitro dans d'interaction de métal comme un outil pour apprendre plus sur les événements de cellules bactériennes entières concernant les affinités de liaison métalliques spécifiques. Cette connaissance est essentielle non seulement pour le développement de matériaux filtrants applicables pour la récupération des métaux pour la protection de l'environnement et la conservation des re49 sources, mais aussi pour le développement de réseaux de IP métalliques hautement ordonnés pour diverses applications techniques.

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Protocole

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1. Microorganismes et la culture Conditions

Note:. Toutes les expériences ont été effectuées dans des conditions stériles L. sphaericus JG-B53 a été obtenu à partir d'une culture de cryo-conservé 29,30.

  1. La culture (1,5 ml) sous le banc propre transfert cryo-conservés jusqu'à 300 ml de bouillon nutritif stérile (NB) médias (3 g / L extrait de viande, 5 g / l de peptone, 10 g / l de NaCl). Ensuite agiter la solution pendant au moins 6 heures à 30 ° C pour obtenir la pré-culture pour la culture.
  2. Cultiver les bactéries dans des conditions aérobies dans les médias NB à pH = 7,0, 30 ° C dans un bioréacteur de 70 L escaladèrent la vapeur en place. Par conséquent, remplir le réacteur avec ≈ 57 L d'eau déminéralisée. Ajouter et dissoudre médias NB solide directement dans bioréacteur (concentrations voir ci-dessus).
    1. En outre ajouter un agent antimousse (30 pl / L NB-médias) pour les médias pour supprimer la formation de mousse lors de la culture, puis l'autoclave (122 ° C, température de maintien de temps de 30 min) les médiasà l'intérieur de l'installation du réacteur.
  3. Refroidir les médias et effectuer la saturation complète de l'oxygène. Ajuster le pH à 7,0 (en utilisant une MH 2 SO 4 et 2 M de NaOH) et commencer l'inoculation automatique de la 300 ml de pré-culture. Commencez l'enregistrement de données de paramètres de culture au point d'inoculation. Connectez paramètres en ligne par exemple, le niveau d'oxygène dissous (OD 2), plus acide et de base, et des valeurs de pH au sein de la culture.
    1. Surveiller la croissance bactérienne en ligne par des mesures de turbidité non invasives.
  4. Effectuer un prélèvement supplémentaire après chaque heure de la culture et de déterminer autre paramètre, comme le poids à sec bio (BDW) et une densité optique déconnecté (DO). Par conséquent, recueillir 20 ml de bouillon de culture à chaque point d'échantillonnage dans des conditions stériles.
    1. Déterminer déconnecté OD par des mesures photométriques de l'adsorption à 600 nm. Utilisez-NB moyen filtré stérile comme une valeur vide. À l'arrièreer atteindre adsorption> 0,4 ​​dilué la suspension cellulaire suivant la linéarité de la loi de Lambert-Beer.
    2. Pour la détermination de BDW une centrifugeuse de 5 ml de suspension bactérienne (en fonction de la densité cellulaire) à 5000 g pendant 5 min à température ambiante. Sécher le culot cellulaire obtenu à 105 ° C dans un four de chauffage jusqu'à stabilité masse et mesurer la masse de granules.
  5. Prendre des images microscopiques en phase de recherche optique microscope à contraste 400 et 1000 fois grossissement (contraste de phase de condenseur 2 et 3 respectivement) pour le contrôle de la croissance bactérienne et à titre de témoin de contamination croisée.
  6. Après avoir atteint la phase de croissance exponentielle détecté par ligne DO 2 et la turbidité en ligne, récolter la biomasse par centrifugation à flux continu à 15.000 xg, 4 ° C et laver la biomasse à deux reprises avec un tampon standard (TRIS 50 mM, MgCl2 10 mM, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    Remarque: Le culot de biomasse obtenue peut être stocké à -18 & #176; C jusqu'à utilisation ultérieure pour l'isolement.

2. La protéine de la couche S Isolement et purification

Remarque: Purifier SLP1 polymères selon un procédé adapté tel que décrit précédemment 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogénéiser la biomasse brut lavé et décongelé obtenu à partir de la culture dans un tampon standard (1: 1 (p / v)) pour éliminer flagelles en utilisant un disperseur (niveau 3, 10 min) dans un bain de glace de refroidissement à 4 ° C.
  2. Centrifuger la suspension (8000 xg, 4 ° C pendant 20 min) et on lave le culot deux fois avec du tampon obtenu standard (1: 1 (p / v)). Après lavage et centrifugation (8000 xg, 4 ° C pendant 20 min), remettre en suspension le culot dans un tampon standard (1: 1 (p / v)), ajouter de la DNase II et de la RNase (0,4 unité / g de biomasse) de la suspension et se désintègrent les cellules à 1000 bars avec un homogénéisateur haute pression. Ensuite centrifuger la suspension à 27 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure.
    Remarque: Contrôle suspension de cellules avec les mi de recherchecroscope. Rupture est terminée lorsque moins de 2 - 3 cellules intactes sont visibles dans le champ du microscope au grossissement 400 fois de la vue.
  3. Laver le culot deux fois avec un tampon standard (1: 1 (p / v)) et effectuer une nouvelle centrifugation. Ensuite resuspendre le culot dans un tampon standard (2: 1 (p / v)) en mélange avec 1% de Triton X-100 et incuber pendant 20 min sous agitation successifs (100 rpm) à solubiliser les dépôts lipidiques.
  4. Centrifuger la solution (27 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure) et laver le culot obtenus trois fois avec un tampon standard (1: 1 (p / v)).
  5. Incuber le culot obtenu après centrifugation supplémentaire (27 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure) pendant 6 heures dans un tampon standard (1: 1 (p / v)) mélangé à 0,2 g / l de lysozyme, pour hydrolyser des liaisons de peptidoglycane 50. En outre ajouter de la DNase et de la RNase II (chaque 0,4 unités / g de biomasse) à la suspension.
  6. Après centrifugation (45 500 xg, 4 ° C, 1 h), remettre en suspension la phase de protéine de blanc supérieur avec un faible volume de til surnageant de centrifugation (<30 ml) contenant de sous-unités protéiques.
  7. Solubiliser la suspension blanche par mélange de 1: 1 avec 6 M de chlorhydrate de guanidine (GuHCl 6 M, Tris 50 mM, pH = 7,2). La solution devient lumineux.
  8. Effectuer une filtration stérile (0,2 pm) de la solution traitée GuHCl suivie d'une centrifugation à grande vitesse supplémentaire (45 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure).
  9. Transférer le surnageant dans des tubes à membrane de dialyse (MWCO de 50 000 Dalton) et dialysées contre le tampon de ce recristallisation (TRIS 1,5 mM, CaCl2 10 mM, pH = 8,0) pendant 48 heures.
  10. Transférer la solution de polymère protéique recristallisée blanc dans des tubes et centrifuger à 45 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure. Remettre en suspension le culot dans un petit volume d'eau ultrapure (<30 ml).
  11. Ensuite, transférer la suspension dans des tubes membranaires de dialyse et d'effectuer une dialyse contre de l'eau ultra pure pendant 24 heures pour éliminer le contenu de la mémoire tampon.
    Remarque: Plusieurs changements de tampon ou de l'eau ultra pure durant la dialyse sont indispensables.
  12. Lyophiliser la SLP1 purifié dans un lyophilisateur.

3. caractérisation et la quantification des SLP1 pour les expériences

Remarque: concentration SLP1 pour des expériences de sorption et de revêtement ont été quantifiés par spectrophotométrie UV-Vis.

  1. Pipette 2 pl de l'échantillon dissous SLP1 directement sur le socle de mesure inférieure du photomètre. Déterminer la concentration en protéine à un maximum d'adsorption à une longueur d'onde de 280 nm, caractéristique des protéines. Utiliser le coefficient d'extinction de 0,61 pour déterminer la concentration SLP1. Utiliser une solution libre pour SLP1 mesures de référence.
  2. Diluer la protéine avec du tampon (pour des expériences de sorption en mode batch utilisant 0,9% de NaCl, pH = 6,0 et pour des expériences QCM-D utilisent tampon de recristallisation, pH = 8,0) à la concentration désirée pour les expériences (1 g / L et 0,2 g / L respectivement).
  3. Analyser SLP1 la qualité et le poids moléculaire par la norme bioanalProcédé ytical sodium dodécyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) décrit par Laemmli, Royaume-Uni 52.
    1. Effectuer SDS-PAGE avant d'utiliser SLP1 dans les expériences et, par exemple, après Au (0) -NP incubation en utilisant 10% de gels de séparation de polyacrylamide.
    2. Pour SDS-échantillons mélange ≈ 10 pi de la culture ou de la protéine échantillon avec un tampon d'échantillon (1,97 g de Tris, 5 mg de bleu de bromophénol, 5,8 ml de glycérine, 1 g de SDS, 2,5 ml β-mercaptoéthanol, se remplissent de l'eau ultrapure à 50 ml) dans un rapport de 1: 1 (v / v) et la pipette le mélange après 4 min d'incubation à 95 ° C dans les poches de gel.
    3. Exécuter SDS-PAGE 30 min sous une tension de 60 V jusqu'à ce que les échantillons passent le gel et le changement de collecte tension 120 V, une fois le passage du gel de séparation.
    4. Retirer les gels du système de gel, rincer à l'eau ultra pure et lieu pendant 1 heure dans une solution de fixation (acide acide de 10%, 50% d'éthanol absolu). Ensuite, rincer les gels avec de l'eau ultra-pure.
    5. Gels Stainen utilisant un colloïdale non spécifique adapté Coomassie méthode au bleu de 53,54. Après décoloration 72,73, prendre des images de SDS-PAGE par le système de documentation de gel selon le protocole du fabricant.

4. Les expériences de sorption en mode batch et la quantification de Métal

  1. Pour le lot des expériences de sorption préparent Au (III) solution stock de HAuCl4 ∙ 3 de H 2 O, diluer le sel de métal et le mélanger avec la solution SLP1 / NaCl à une concentration de métal initiale de 1 mM et la concentration finale SLP1 de 1 g / L . Effectuer des expériences dans des triplets avec un contrôle négatif supplémentaire sans SLP1. Utiliser un volume total de 5 ml pour des expériences de sorption.
  2. Secouez la suspension en continu à la température ambiante à différentes valeurs pré-ajusté pH entre 2,0 à 5,0 pendant 24 heures (ajuster le pH avec une faible solution de HCl et NaOH concentré).
  3. Après sorption, centrifuger les échantillons à 15 000 xg, 4 ° C pendant 20 min) à SEPARmangé SLP1 à partir du surnageant.
  4. Transférer le surnageant dans des tubes d'ultrafiltration (MWCO 50 000 Da) et centrifuger à 15 000 xg ce, 4 ° C pendant 20 min pour éliminer les monomères protéiques dissous.
  5. Déterminer la concentration de métaux dans le filtrat résultant par ICP-MS 19,20 et utiliser les résultats pour le dos-calcul de sorption métallique par la masse sèche SLP1. Principes de mesure, les possibilités de la méthode et des composants de l'occasion ICP-MS ont été décrits dans la littérature 55.
    1. Préparation des échantillons et des références pour les mesures ICP-MS en utilisant 1% de HNO 3 et du rhodium en tant que matrice comme étalon interne (1 mg / ml).

5. Synthèse de Au-NP et Détermination de la taille des particules

Remarque: Au Citrate stabilisé (0) -NP ont été synthétisés selon une méthode décrite précédemment par adaptée Mühlpfordt, H. et al. (1982) pour obtenir des particules sphériques avec un diamètre de 10 - 15 nm 56,57 .

  1. Préparer un stabilisée mM HAuCl 25 4 ∙ 3 H 2 O stock pour la formation NP.
  2. Diluer 250 pi de cette solution mère dans 19,75 ml d'eau ultra pure et incuber ces à 61 ° C pendant 15 min sous agitation successives.
  3. Préparer 5 ml d'une deuxième solution de réserve (12 mM d'acide tannique, 7 mM de citrate de sodium di-hydrate, 0,05 mM de K 2 CO 3) et incuber la solution 2 ème séparément à 61 ° C pendant 15 min.
  4. Ajouter sous constante agitation de la solution stock de 2 ème à la solution d'un. On agite le mélange réactionnel pendant au moins 10 min à 61 ° C. Ensuite refroidir la solution et l'utiliser pour NP revêtement sur SLP1 réseau à l'intérieur des expériences QCM-D.
    Note: Au résultant (0) -NP ont été caractérisés par spectroscopie UV-VIS au maximum d'absorbance de 520 nm, typiquement utilisé pour la détection de forme Au (0) 58 -NPs. La solution peut être conservé à 4 ° C.
  5. Analyse de la taille de la formeAu (0) -NP par spectroscopie par corrélation de photons (PCS) qui est également connu comme diffusion de lumière dynamique.
    1. Pour la détermination de la taille NP, transférer 1,5 ml de Au synthétisé (0) -NP solution dans des cuvettes dans des conditions exemptes de poussière dans une zone d'écoulement laminaire et de l'analyser avec une taille des particules et potentiel calibreur zêta. Une description détaillée de PCS et préparation de l'échantillon est donnée dans Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 et Jain, R. et al. (2015) 60.

6. QCM-D Essais - SLP1 revêtement sur des surfaces et Au-NP adsorption sur SLP1 Lattice

Note: Les mesures ont été effectuées avec un QCM-D équipé avec jusqu'à quatre modules d'écoulement. Toutes les expériences QCM-D ont été réalisées avec un débit constant de 125 pi / min à 25 ° C. SLP1 revêtement métallique et / NP incubation ont été effectuées sur SiO 2 capteurs piézoélectriques AT-coupe quartz (Ø 14 mm) avec une fréquence fondamentale de ≈ 5 MHz. Étapes de rinçage et d'ajouterition de la solution sont marqués dans les chiffres de la partie représentative des résultats. Les expériences QCM-D pourraient être décrites comme une étape par étape en commençant par le nettoyage et la modification de la surface des capteurs utilisés suivie d'une recristallisation SLP1 et par la suite l'interaction de NP métal et le métal.

  1. Procédures de nettoyage:
    1. Equiper les cellules du liquide avec des mannequins de capteurs. Pompe à au moins 20 ml (chacun par module) d'un agent de nettoyage liquide alcalin (2% nettoyant en eau ultra-pure (v) / v) par le système QCM-D et le tube. Ensuite pomper le volume cinq fois (chaque par module) d'eau ultra pure dans le système (débit jusqu'à 300 pi / min). Effectuer le nettoyage conformément au protocole du fabricant.
    2. Nettoyer les capteurs de SiO 2 à l'extérieur des modules de débit par incubation (20 min au moins) dans une solution de SDS à 2% et ensuite rincer les capteurs à plusieurs reprises avec de l'eau ultrapure 61,62.
    3. Sécher les cristaux avec comp filtréeressed air et placez-les dans une chambre de nettoyage d'ozone pendant 20 min 63,64.
    4. Répétez la procédure de nettoyage deux fois pour éliminer tous les contenus organiques.
    5. Pour éliminer les métaux consolidés à partir de la surface du capteur rincer les capteurs avec 1 M HNO 3. Ensuite, effectuer toutes les étapes de rinçage avec de l'eau ultra-pure.
  2. Capteur Modification de surface par Polyelectrolytes:
    Remarque: La modification de surface peut se faire soit à l'intérieur (circuler à travers la procédure) ou à l'extérieur du module de flux (technique LBL). Dans ces expériences de la manière suivante pour modifier les surfaces a été utilisé.
    1. Modifiez les capteurs à 3 g / L d'une alternance de couches de PE de polyéthylène (PEI, MW 25000) et le polystyrène sulfonate (PSS, MW 70000) via le revêtement par immersion en utilisant la technique LbL 40,41 décrit précédemment pour le système utilisé spéciale dans l'article de Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Placez les capteurs à l'intérieur du PE-solution appropriée dans une profonde well plaques et incuber ceux-ci pendant 10 min à température ambiante.
    3. Prenez les capteurs de PE-solution et rincer les capteurs entre chaque étape de revêtement par immersion intensive avec de l'eau ultra-pure.
      Remarque: La nouvelle modification de surface se compose d'au moins trois PE couche terminaison avec chargée positivement PEI.
    4. Après cette modification externe placer des capteurs à l'intérieur du module de débit et équilibrer les capteurs par rinçage avec de l'eau ultrapure avant de commencer les expériences.
  3. SLP1 monocouche recristallisation:
    1. Dissoudre SLP1 à 4 M d'urée pour convertir polymères en monomères.
    2. Centrifuger les protéines à 15 000 xg monomerized, 4 ° C pendant 1 heure pour éliminer les plus gros agglomérats de protéines.
    3. Mélanger le surnageant et on le centrifuge SLP1 solubilisée avec le tampon de recristallisation à une concentration finale en protéines de 0,2 g / L.
      Remarque: Le calcium selon recristallisation de SLP1 (auto-assemblage) commence par addition de la recrystallization tampon. Par conséquent, pomper la solution mixte avec un débit de 125 ul / min pour les capteurs (placé à l'intérieur des modules d'écoulement) immédiatement. La recristallisation se fait après des valeurs stables de la fréquence et de dissipation des changements ont été détectées dans des expériences QCM-D.
    4. Après avoir réussi recristallisation de protéines au-dessus des capteurs de PE modifiée à l'intérieur des modules de débit rincer les capteurs enrobés avec du tampon de recristallisation ou ultrapure waterintensively avec un débit de 125 ul / min jusqu'à ce que des valeurs stables de la fréquence et de dissipation des changements ont été détectés.
      Remarque: La modification de la surface de SiO 2 avec du PE pour les expériences ultérieures de sorption SUR DES monocouches et AFM études SLP1 est visualisé sur la figure 1.

figure-protocol-1
Figure 1. Schéma Design du PE Modification de surface et SLP1 monocoucheRevêtement; Ce chiffre a été modifié de Suhr, M. et al. (2015) 19 avec l'autorisation de Springer. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Métal et Métal NP Interaction:
    Remarque: La sorption de la solution de sel de métal Au (HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O) a été réalisée à des concentrations de 1 mM ou 5 mM à pH = 6,0 à 0,9% de NaCl. Au-NP adsorption a été fait avec non dilué au-IP dans 1,6 mM de tampon tri-sodium-citrate à pH ≈ 5,0.
    1. Après succès revêtement SLP1 dans les modules de débit, rincer la couche SLP1 obtenu intensivement avec une solution de NaCl à 0,9% jusqu'à ce que les valeurs stables de la fréquence et de dissipation des changements ont été détectés.
    2. Pomper la solution préparée en métal (1 mM) et une solution de NP les modules d'écoulement avec un débit de 125 ul / min et l'écoulement de suivre l'adsorption de masse à la Slcouche de p1. Adsorption de masse peut être détectée directement par le suivi des décalages de fréquence se référant à l'équation Sauerbrey (équation 1).
    3. Après avoir terminé l'interaction de métal et NP métallique, rincer avec la couche tampon sans métal / NP pour enlever faibles des métaux ou des nanoparticules attachées liés ou faibles.
      Remarque: Une illustration du montage expérimental est représenté sur la figure 2.

figure-protocol-2
Figure 2. Schéma de conception de l'installation QCM-D à l'aide du module de flux QFM 401 * 66. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Enregistrement des données et de l'évaluation:
    1. Enregistrer les changements dans la fréquence en Hz (Af n) et la dissipation (AD n) Dans les expériences QCM-D en utilisant QCM-D logiciel spécifique.
    2. Utilisation pour évaluation de la sensibilité masse adsorbée (Δm) de l'équation / modèle Sauerbrey (Equation 1) 65 66 qui est valable pour des films minces et rigides couplés sans frottement à la surface du capteur appliqué à la n-ième harmonique. Le terme C (Sauerbrey constant) utilisé pour la 5 MHz au niveau du capteur de quartz de coupe est de 17,7 ng ∙ Hz -1 ∙ cm -2 68. Pour rigide, répartis uniformément, et suffisamment minces couches adsorbées utiliser l'équation 1 comme une bonne approximation.
      figure-protocol-3
    3. Effectuer la modélisation supplémentaires selon le modèle de Kelvin-Voigt valable pour molécules viscoélastiques 68-71 avec le logiciel spécifique au fabricant et de comparer les résultats avec celui du modèle Sauerbrey.
    4. Pour le calcul de l'épaisseur de la couche et l'utilisation d'adsorption de massecomme paramètre de modélisation importante une densité de couche de la couche adsorbée de 1,35 g cm -3 ∙ correspondant à des valeurs décrites ci-dessus pour les protéines de la couche S 72-75. Utiliser la même valeur pour le calcul de l'interaction avec le métal de la couche protéique.

7. Mesures de l'AFM

  1. Réaliser des études avec tout à fait capable AFM sur un microscope optique inversé.
    1. Images AFM d'enregistrement à l'état liquide à l'aide du tampon de recristallisation ou de l'eau ultra pure directement sur les capteurs revêtus QCM-D.
    2. Rincer les capteurs avec de l'eau ultra pure après des expériences QCM-D et de les placer à l'intérieur de la cellule fluide AFM. Par conséquent, en utilisant une cellule de fluide fermé avec un volume total d'environ 1,5 ml. Gardez la température de la constante de cellule fluide à 30 ° C.
    3. Utiliser un cantilever avec une fréquence de résonance de 25 kHz ≈ dans l'eau et une raideur de <0,1 N / m. Réglez la vitesse de balayage entre 2,5 et 10 um / sec.
    4. prendre des images en mode de contact dynamique pendant que le cantilever est excité par une piézo à sa fréquence de résonance. Déterminer la distance de la poutre à la surface par l'oscillation d'amortissement 76.
      Remarque: Les images de hauteur sont illustrées avec z-échelle tout en valeurs z représentent la topographie exacte de la surface. Amplitude (pseudo 3D) images sont montrées sans z-z-échelle en raison des valeurs d'amplitude dépendent de paramètres de numérisation et portent des informations limitées. Analyse des images a été fait à l'aide de trois logiciels d'évaluation différente de 77.

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Résultats

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La culture de micro-organismes et SLP1 Caractérisation

Les données enregistrées de la croissance bactérienne indique la fin de la phase exponentielle de croissance à environ 5 heures. Enquêtes précédentes ont montré que SLP1 peut être isolé à partir de ce moment de la récolte (4,36 g / biomasse humide L (≈ 1,45 g / L (BDW)) avec un rendement maximal 19. Néanmoins, l'optimisation de la culture en...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce travail étudié la liaison aux protéines de Au S-couche a été étudiée en utilisant une combinaison de différentes méthodes analytiques. En particulier, la fixation de Au est très intéressante, non seulement pour la récupération des eaux de Au miniers ou des solutions de traitement, mais également pour la construction de matériaux, par exemple des surfaces sensorielles. Pour les études de l'UA interaction (Au (III) et Au (0) -NPs) avec sursis et monocouche de SLP1 recristallisé, la protéine a dû être ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent travail a été partiellement financé par l'IGF-projet "S-Sieve" (490 ZBG / 1) financé par l'BMWi et le BMBF-projet "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Un merci spécial à Tobias J. Günther pour son aide précieuse pendant les études de l'AFM et à Erik V. Johnstone pour lire le manuscrit comme une langue maternelle anglaise. En outre, l'auteur de cet article tient à remercier Aline Ritter et Sabrina Gurlit (de l'Institut pour l'écologie des ressources de l'aide pour les mesures par ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava et de la biotechnologie de groupe de la Helmholtz-Institut Freiberg pour Technology Resource.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
strong
Bioreactor, vapeur en place Système pilote 70LApplikon Biotechnology, Pays-BasZ6Xavec dO2, capteurs de pH d’Applikon Biotechnology et logiciel BioXpert V2
Moniteur de biomasse non invasif BugEye 2100BugLab, Concord (CA), USAZ9X---
Spectrometer Ultrospec 1000Amersham Pharmacia Biotech, Grande-Bretagne80-2109-10Entreprise maintenant GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifugeVWR, Allemagne521-2844Pour la centrifugation d’échantillons de culture Système de
recherche microscope BX-61Olympus Germany LLC, Allemagne037006Microscope en combinaison avec le logiciel d’imagerie
Cell^P (version 3.1)Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Mü ; nster, Allemagne---en collaboration avec le microscope
Powerfuge Pilot Separation System Série 9010-SCarr Centritech, Floride, États-Unis9010PLTPour la récolte de la biomasse
T18 basic Ultra TurraxIKA Labortechnik, Allemagne431-2601Pour l’élimination des flagelles et l’homogénéisation des échantillons
Sorvall Evolution RC Superspeed CentrifugeThermo Fisher Scientific, USA728411Utilisé dans l’isolement
des protéines Processeur de fluide mobile à haut cisaillement, M-110EH-30 Microfluidics pilote, Massachusetts, États-UnisM110EH30KUtilisé pour la rupture cellulaire
Alpha 1-4 LSC LyophilisateurMartin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, AllemagneSpectrophotométrie 102041---
UV-VIS (NanoDrop 2000c)Thermo Fisher Scientific, USA91-ND-2000C-LPour la détermination de la protéine chambre
d’électrophorèse verticale Mini-PROTEANBio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Allemagne165-3322SDS-PAGE
VersaDoc 3000Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Allemagne1708030Utilisé pour l’imagerie des gels SDS-PAGE
ICP-MS Elan 9000PerkinElmer, Waltham (MA), États-UnisN8120536Pour la détermination de la concentration
en métalZetasizer Nano ZSMalvern Instruments, Worcestershire Royaume-UniZEN3600Pour la détermination de la taille des nanoparticules
Dispositif Q-Sense E4  ;Q-Sense AB, Göteborg, SuèdeQS-E4commandé via LOT quantum design (logiciel inclus avec la plate-forme E4)
Q-Soft 401 (enregistrement de données)Q-Sense AB, Göteborg, Suède
Q-Tools 3 (évaluation et modélisation des données)Q-Sense AB, Göteborg, Suède
Modules de flux QCM-D QFM  ; 401  ;Q-Sense AB, Göteborg, SuèdeQS-QFM401commandé via LOT quantum design
QSX  ; 303 SiO2 capteurs piézoélectriques à quartz AT-CutQ-Sense AB, Göteborg, SuèdeQS-QSX303commandé via LOT quantum design
Chambre de nettoyage de l’ozoneBioforce Nanoscience, Ames (IA), ÉTATS-UNISQS-ESA006commandé via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFMAsylum Research, Santa Barbara (CA), USAMFP-3DBioLogiciel de mesure et d’imagerie AFM
Logiciel AFM d’Asylum Research AR Version 120804+1223Asylum Research, Santa Barbara (CA), États-Unislogiciel d’imagerie inclus dans Cat. Non. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 LogicielWaveMetrics, Inc., États-Unis---Logiciel d’imagerie inclus dans Cat. Non. MFP-3DBio
BioHeaterAsylum Research, Santa Barbara (CA), États-UnisBioheaterChauffage d’échantillons pour les mesures AFM
Mini cantilever Biolever,  ; BL-AC40TS-C2Olympus Germany LLC, Allemagne&nbsp ; BL-AC40TS-C2Cantilever préféré pour les mesures AFM
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)Nanotec Electronica S.L. , EspagnefreewareLogiciel pour l’analyse AFM
Nom><>Numéro de catalogueCommentaires
>Détergents et autres équipements
acide acide, 100 %, p.A.CARL ROTH GmbH+CO. KG3738.5Danger, liquide et vapeur inflammables et corrosifs. Provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires.
Antimousse 204Sigma-Aldrich Co. LLC.A6426Pour la suppression de la mousse
bleu de bromophénol, sel de sodiumSigma-Aldrich Co. LLC.B5525---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)CARL ROTH GmbH+CO. KG3862.1---
Désoxyribonucléase II de la rate porcineSigma-Aldrich Co. LLC.D4138Typ IV , 2 000 - 6 000  ; Kunitz unités/mg de protéines
Éthanol, 95 %VWR, Allemagne20827.467inflammable
, p.A.CARL ROTH GmbH+CO. KG3783.1---
Chlorhydrate de guanidine (GuHCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG0037.1---
Hellmanex IIIHellma GmbH & Co. KG9-307-011-4-507---
Acide chlorhydrique (HCl) (37 %)CARL ROTH GmbH+CO. KG4625.2Danger ; Corrosif, utilisé pour l’ajustement du pH
Lysozyme du blanc d’œuf de pouleSigma-Aldrich Co. LLC.L6876  ;Poudre lyophilisée, protéines = 90 %, = 40 000 unités/mg de protéines (Sigma)  ;
Agitateur magnétique avec chauffage,  ; MR 3000KHeidolph Instruments GmbH & Co.KG, Allemagne504.10100.00Agitateur standard dans le cadre de l’expérience
NB-Media DM180Mast Diagnostica GmbH121800---
Acide nitrique (HNO3)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN50.1Danger ; Échelle
de protéines non colorées PageRulerThermoScientific-Pierce26614---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS)Sigma-Aldrich Co., LLC.243051Mw moyen ~70 000
polyéthylénimine (PEI), ramifiéSigma-Aldrich Co. LLC.408727Avertissement ; Nocif, irritant, dangereux pour l’environnement ; moyenne Mw ~25 000
Carbonate de potassium anhydre (K2CO3)Sigma-Aldrich Co. LLC.60108Avertissement ;
Ribonucase A nocive du pancréas bovinSigma-Aldrich Co. LLC.R5503Type I-AS, 50 à 100 unités de Kunitz/mg de protéines
Azoture de sodium (NaN3)Merck KGaA106688Danger ; très toxique et dangereux pour l’environnement
Chlorure de sodium (NaCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG3957.2---
Dodécylsulfate de sodium (SDS)Sigma-Aldrich Co., LLC.L-5750Danger ; hydroxyde
de sodium (NaOH) toxiqueCARLROTH GmbH+CO. KG6771.1Danger ; Corrosif, utilisé pour la régulation du pH dans la culture et l’ajustement du pH
Spectra/Por 6, membrane de dialyse, MWCO 50 000CARL ROTH GmbH+CO. KG1893.1---
Acide sulfurique (H2SO4)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN52.2Danger ; Corrosif, utilisé pour la régulation du pH dans la culture
Acide tannique (C76H52O46)Sigma-Aldrich Co. LLC.16201---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG9090.2---
Triton X-100CARL ROTH GmbH+CO. KG3051.3Avertissement ; Nocif, Dangereux pour l’environnement
VIVASPIN 500, 50 000 MWCO Tubes d’ultrafiltrationSartorius AGVS0132---
&beta ;-mercaptoethanolSigma-Aldrich Co. LLC.M6250Danger, toxique
Pour le système d’imagerie --- Danger, glycérine oxydante et corrosive

Références

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