Quantitative Fundus autofluorescence pour l'évaluation des maladies rétiniennes

Résumé

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) soutient la rétine sensorielle en recyclant les sous-produits du cycle visuel, qui s’accumulent sous forme de lipofuscine. Ces produits sont autofluorescents et peuvent être imagés qualitativement in vivo. Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie quantitative de la lipofuscine EPR à l’aide de l’ophtalmoscopie laser à balayage confocal.

Résumé

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est juxtaposé à la rétine sensorielle sus-jacente et soutient la fonction du système visuel. Parmi les tâches effectuées par l’EPR figurent la phagocytose et le traitement des segments photorécepteurs externes à travers les organites dérivés des lysosomes. Ces produits de dégradation, stockés et appelés granules de lipofuscine, sont composés en partie de bisrétinoïdes, qui ont de larges spectres d’absorption et d’émission de fluorescence qui peuvent être détectés cliniquement comme l’autofluorescence du fond d’œil avec ophtalmoscopie laser à balayage confocal (cSLO). L’accumulation de lipofuscine est associée à l’âge, mais se retrouve également dans divers modèles dans les maladies dégénératives acquises et héréditaires de la rétine. Ainsi, l’étude de son modèle d’accumulation et la corrélation de ces modèles avec les changements dans la rétine sensorielle sus-jacente sont essentielles pour comprendre la physiopathologie et la progression de la maladie rétinienne. Ici, nous décrivons une technique employée par notre laboratoire et d’autres qui utilise cSLO afin de quantifier le niveau de lipofuscine RPE dans les yeux sains et malades.

Introduction

L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) prend en charge la fonction de la rétine sensorielle par de nombreux procédés ^1. liée à l'âge de la dégénérescence maculaire (DMLA) est la plus importante cause de cécité incurable dans les pays industrialisés et se caractérise par des changements dans l'EPR, y compris la perte de pigment, la perte de fonction et l'atrophie. Dans la DMLA et au vieillissement normal, l'EPR, accumule organites lysosomes dérivé contenant des fragments fluorescents photoréceptrices phagocytés, appelés granules de lipofuscine. L'accumulation de lipofuscine RPE a été pensé pour indiquer un dysfonctionnement oxydatif ^1, mais des études récentes ont montré que la morphologie RPE reste normale dans les yeux âgés avec des niveaux élevés de lipofuscine ^2. Marqueurs Toutefois, les tendances anormales de la distribution de lipofuscine, en particulier la perte de lipofuscine, sont documentés pour AMD et AMD progression, à la fois histologiquement et cliniquement ^3,4

procès- défectueuxchanter RPE lipofuscin a également été observé chez certaines dégénérescences rétiniennes héréditaires. Les patients souffrant de la maladie de Stargardt (STGD) accumulent lipofuscine dans le RPE à un jeune âge, éventuellement développer une perte de vision similaire à celle observée chez AMD ^5. Ces résultats suggèrent que l' accumulation de lipofuscine peut lui - même être toxiques et entraîner un dysfonctionnement RPE ^6,7. Cependant, une étude d'imagerie détaillée des sujets avec STGD au fil du temps n'a pas confirmé que l' accumulation de lipofuscine focal a conduit à la perte subséquente de RPE ^8. Par conséquent, bien que des anomalies lipofuscine sont des marqueurs de dégénérescences rétiniennes, un rôle pour la toxicité directe des lipofuscin reste à prouver.

L'EPR est la couche la plus postérieure de la cellule de la rétine, mais produit la majeure partie de signal fluorescent provenant du fond de l'oeil. La génération et la détection de l'autofluorescence (AF) dérivée de l'EPR peut être effectuée en utilisant une ophtalmoscopie laser à balayage confocal (cSLO), ce qui permet de visualization de la distribution spatiale de la FA scléral. Certains dégénérescences rétiniennes démontrent modèles distinctifs de fundus AF, et les aides d'imagerie AF dans le diagnostic et le suivi de ces conditions. Bien que l'imagerie AF standard est cliniquement importante, AF quantitative (QAF) est devenu un moyen important d'évaluer la santé de l'EPR. Nous et d' autres ont mis au point une approche normalisée qui peut déterminer de façon fiable les niveaux QAF à des endroits spécifiques de la rétine ^9. QAF a des applications potentielles dans le diagnostic et le suivi des conditions de la rétine, et peut également avoir une utilité dans le pronostic et le risque de stratification. En outre, les capacités de diagnostic de QAF ont également été décrits pour certains troubles rétiniens ^10-12. Ici, nous fournissons étape sage de détails pour réaliser notre technique accompagnée d'une démonstration visuelle de son application dans l'évaluation des yeux sains et malades.

Protocole

Déclaration éthique: Tous les patients inclus dans ces études ont été réalisées en conformité avec examen institutionnel approuvé conseil de surveillance à New-York University School of Medicine.

1. Sélection des patients et préparation initiale pour l'imagerie

Remarque: Les documents suivants sont requis: solution ophtalmique tropicamide 0,5%, solution ophtalmique de phényléphrine 2,5%, cSLO équipé domaine spectral tomographie optique de cohérence (SD-OCT), et la référence de fluorescence interne.

1. Avant imagerie, mis en place de manière appropriée cSLO pour l'acquisition de données selon les instructions du fabricant.
2. Monter une référence fluorescente interne dans le cSLO. Remarque: La référence fluorescente interne, acheté auprès du fabricant, est logé dans un anneau métallique et est placé directement derrière la lentille de la caméra. Si un cSLO d'un autre fabricant est utilisé, il peut y avoir une configuration différente de celle qui est décrite dansce protocole.
   1. Afin d'insérer la référence dans le cSLO, tourner la lentille pour la retirer, dévisser la bague métallique de la machine, et le remplacer par la nouvelle bague métallique contenant la référence.
      Remarque: la référence fluorescente interne est essentielle à la technique QAF, car elle permet la correction de la variation de la puissance du laser et le détecteur de sensibilité / de gain.
3. Demandez aux patients recrutés pour l'imagerie subissent un examen de routine des yeux dilatés et d'obtenir des informations de base concernant l'histoire oculaire passé et des conditions médicales sous-jacentes qui peuvent se manifester avec des résultats oculaires.
4. Dilater élèves avec 0,5% et 2,5% tropicamide phényléphrine. ÉTAPE CRITIQUE: Dilater élèves à au moins 6 mm. Note: Ceci est essentiel pour le passage ininterrompu de la lumière, et donc pour une visualisation optimale et la mesure du fundus.
5. Avant imagerie, positionner le patient correctement sur le cSLO, avec le menton appuyé sur la mentonnière, le front placé contre le forehead repos, et canthi latéral correctement alignés avec les indicateurs.

2. Baseline Imaging des Fundus Ocular

1. Tout d'abord, l'image du fond avec réflexion infrarouge (IR) proche (longueur d'onde de 820 nm) afin de centraliser la caméra sur la macula et d'obtenir l'accent rugueux.
   1. Avec le patient correctement positionné, changer le réglage du matériel sur le panneau de commande en mode d'imagerie infrarouge, caméra de position manuellement jusqu'à ce que le fond est en pleine mise au point, et prendre une image
   2. Réglez le paramètre sur le panneau de commande pour "IR-OCT", qui utilise de domaine spectral tomographie optique de cohérence (SD-OCT), en liaison avec l'imagerie infrarouge pour évaluer la macula de la maladie sous-jacente.
   3. Utilisez les guides présents dans la fenêtre d'imagerie pour orienter correctement les PTOM à l'image IR du fundus. Pour obtenir un fonctionnement optimal SD-OCT qualité, positionner la caméra de telle sorte que l'image OPO est dans le premier tiers de sa fenêtre d'imagerie. Acquérir au moins un sc de ligne horizontaleun par la fovéa et couvrant le champ d'imagerie.

3. Mise en place QAF Imaging

1. Utilisez l'acquisition d'images "haute vitesse". Remarque: Ce paramètre permet l'acquisition d'images plus rapide, ce qui diminue le risque de perte de signal due à un mouvement du patient et de blocage résultant de la lumière par l'iris ou des paupières.
2. Utilisez "moyenne de 9" frames. Remarque: Ce paramètre permet de, la capture séquentielle rapide de 9 trames d'image, qui peuvent être par la suite "en moyenne" pour réduire le bruit et l'artefact (voir ci-dessous).
3. Utilisez champ "30 x 30 degrés". Note: Ceci se rapporte aux degrés de la zone rétinienne capturé lors de l'acquisition d'image.
4. Avant imagerie, prévenir le patient au sujet de la lumière bleue, comme cela peut être inquiétant au premier abord.
5. Activez le mode AF et aligner l'axe de la caméra de telle sorte que l'écran est au maximum "rempli" avec fundus AF (brunissement minimal des côtés et des coins de l'image).
   1. Si les patients hdifficulté ave tolérer la lumière bleue brillante, commencer l'imagerie avec l'appareil photo plus loin de l'œil, puis amener la caméra lentement vers le patient jusqu'à ce que le fond est en pleine vue.
      ÉTAPE CRITIQUE: Si la lumière entrant dans ou sortant de l'oeil est obstruée, une diminution de signal entraînera. diminution localisée est visible comme assombrissement asymétrique d'un côté de l'image ou dans un coin. perte Généralisé de signal est observé lorsque les mouvements des yeux seul obstacle passage de la lumière.
6. Alignez la caméra de telle sorte que le signal AF est à son plus haut niveau dans tout le champ. Objectif pour le signal maximal plutôt que l'image la plus nette, mais ils sont corrélés à peu près. Réglez la mise au point de la caméra en déplaçant le cSLO pour repositionner la caméra manuellement ou avec le joystick ophtalmoscope.
7. Réglez la sensibilité / gain de telle sorte que AF rétinienne est facilement visible, mais éviter la saturation. Lors de l'acquisition de l'image, des pixels colorés visibles soit dans la référence interne (situé en haut de laimage) ou le fond indiquent sur-saturation et donc une perte de signal.

4. Image Acquisition

Remarque: ÉTAPE CRITIQUE: L'objectif en matière d'acquisition d'image devrait être d'obtenir 2 de haute qualité 9-cadre piles d'images par session pour contrôler la variabilité entre les images dans une session. Après le repositionnement du patient et de la caméra, obtenir une deuxième session de deux images afin d'évaluer et de contrôle de la variabilité. Toutes les images seront en fin de compte être étalonnés à la référence interne (décrite ci-dessous).

1. Acquérir les images seulement après au moins 20 secondes de "blanchiment" (exposition complète de la rétine à la lumière AF) pour minimiser l' absorption de la lumière par la rhodopsine dans la rétine sensorielle ^9.
   1. Utilisez cette période pour optimiser l'alignement de la caméra, la concentration et la sensibilité.
2. Avoir les sujets clignotent avant chaque acquisition d'image en tant que film lacrymal frais améliore la qualité du signal.
3. Éviter les paupières dans le plan d'acquisition.
   Remarque: Il peut être utile de manuellement les paupières ouvertes pour les patients les plus difficiles. Les auteurs recommandent que l'assistant effectue cette tâche.
4. Optimiser l'alignement avant chaque acquisition d'image pour assurer que la lumière ne soit pas obstrué par l'iris résultant en une diminution de signal.
   Remarque: Au moins mineur mouvement est très commun, les auteurs recommandent bien réalignement nécessaire avant chaque acquisition d'image. Guider et encourager le patient tout en imagerie permet le mouvement de baisse. Les auteurs recommandent également d'utiliser le pied de la pédale de la machine comme le «bouton d'acquisition" de manière à minimiser l'opérateur distraction.
5. Effectuer le traitement post-image en calculant la "moyenne" de la pile 9-cadre pour augmenter le rapport signal-bruit. Calculer la moyenne d'une pile à l'aide du logiciel cSLO en sélectionnant l'option pour calculer la moyenne.
   Note: Il peut y avoir des piles où certains cadres ne sont pas de qualité optimale (ie, ont localisé ou généralisé diminué signal par rapport aux cadres optimales), donc inspecter soigneusement chaque pile et désélectionner cadres suboptimales avant le calcul de la moyenne.
   Remarque: les images moyennes avec des rapports signal sur bruit acceptables peuvent être traités à partir d'au moins 3 cadres. Il est normal pour les côtés et les coins de chaque image pour avoir le signal plus faible que les 20 degrés centraux en raison des limitations dans le cSLO lui-même.
   1. Si le logiciel demande si l'opérateur souhaite normaliser les niveaux de gris (c. -à étirer l'histogramme) entre 0 et 255, sélectionnez "Non". Cela permet de maintenir des niveaux de gris inchangés pour l'analyse.

5. Analyse de l'image

1. Analyser les images AF comme précédemment décrit en utilisant un logiciel d'analyse d'images mis au point pour la technique QAF (IGOR; ^9). Une brève description d'une analyse d'image typique utilisant ce logiciel est inclus ci-dessous.
   1. Chargez le programme QAF en IGOR et importer des images (au format .bmp) exportés de lalogiciel cSLO avec un rapport d'aspect de pixel 768 x 768 (paramètre de sortie par défaut).
   2. Sélectionnez l'image dans le menu déroulant et lancer l'analyse.
   3. Repositionner indicateurs d'étalonnage sur l'image de telle sorte que les "réticule" recouvrent la fovéa et le "support" bute le disque optique (ces indicateurs sont utilisés à l'échelle et positionner les ROIs). Lorsqu'il est correctement positionné, utilisez un logiciel invites puis remplir l'image avec ROIs circonférentielles autour de la fovéa (voir les figures 1, 2).
   4. Sélectionnez l'option dans IGOR pour étalonner les niveaux de gris globaux de chaque image aux niveaux présents dans la référence fluorescente interne. Remarque: Cette étape permet le calibrage des facteurs liés à la machine, y compris le niveau zéro électronique de chaque image et le facteur d'étalonnage interne de référence de chaque machine, ainsi que les facteurs liés au patient, y compris l'âge, la réfraction et de la courbure de la cornée.
      Remarque: Le logiciel d'analyse affiche alors le r fixeégions sur l'image résultante et une valeur Qaf est démontrée au sein de chaque région. Les valeurs QAF sont également entrés automatiquement dans un format de feuille de calcul dans une fenêtre séparée ".
   5. Générer Qaf "cartes de chaleur" en sélectionnant l'option dans les invites de commande. Toutes les images et les données peuvent être exportées à partir du logiciel IGOR dans une feuille de calcul Excel en sélectionnant les options appropriées.

Résultats

Cette technique a été utilisée pour étudier QAF dans les deux sains ¹³ et états pathologiques ^10-12. Dans les yeux sains (figure 1), AF émise par l'EPR est répartie de façon relativement uniforme dans l'ensemble du fond d' oeil (figure 1A). intensité réduite est perçue dans la région maculaire centrale à cause du blocage de la lumière par le pigment maculaire, et sur les côtés et les coins de l'image due à l'optique de l'œil et la c...

Discussion

distribution lipofuscin RPE anormale, que ce soit augmentée ou diminuée, est un marqueur sensible de la maladie de la rétine et est généralement associée à la perte de la fonction de la rétine sensorielle. Ici, nous décrivons l'application de QAF pour l'évaluation des RPE lipofuscine. L' incorporation d'une référence fluorescente interne pour corriger la puissance du laser et le détecteur de sensibilité variable ⁹ aux côtés de notre technique d'imagerie standardisée permet une quantificati...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0,5 % tropicamide solution			Toute marque peut être utilisée
2,5 % de phényléphrine solution			N’importe quelle marque peut être utilisée
Référence fluorescente interne	Heidelberg Engineering
Logiciel IGOR Pro	WaveMetrics