Les mécanismes qui régissent la motilité interstitielle des cellules CD4 T effecteurs aux sites d'inflammation sont relativement peu connus. Nous présentons une approche non invasive pour visualiser et manipuler dans des cellules in vitro -primed T CD4 dans le derme de l' oreille enflammée, ce qui permet pour l' étude du comportement dynamique de ces cellules in situ.
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Article de méthode
Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé
Dans cet article
Résumé
Résumé
La capacité des cellules T CD4 à exercer des fonctions effectrices dépend de la migration rapide et efficace de ces cellules dans les tissus périphériques enflammés par un mécanisme non encore défini. L'application de la microscopie multiphotonique à l'étude du système immunitaire fournit un outil pour mesurer la dynamique des réponses immunitaires dans les tissus intacts. Nous présentons ici un protocole pour l'imagerie multiphotonique intravitale non-invasif des cellules T CD4 dans le derme inflammation de l'oreille de la souris. Utilisation d'une plate-forme d'imagerie personnalisée et un cathéter veineux permet la visualisation de la dynamique des cellules T CD4 dans l'interstitium cutanée, avec la possibilité d'interroger ces cellules en temps réel par l'ajout d'anticorps bloquants à des composants moléculaires clés impliqués dans la motilité. Ce système offre des avantages sur les deux modèles in vitro et des procédures d'imagerie chirurgicale invasive. Comprendre les voies utilisées par les cellules T CD4 pour la motilité peut finalement donner un aperçu des basic fonction des lymphocytes T CD4 ainsi que la pathogenèse de maladies auto-immunes et les pathologies des infections chroniques.
Introduction
La fonction effectrice des lymphocytes T CD4 dépend de manière critique de leur capacité à pénétrer et à traverser rapidement une grande variété de tissus périphériques pour détecter les dommages, localiser les foyers d’infection ou provoquer une pathologie due à une infection chronique ou à une auto-immunité. Bien que les processus de retour vers les sites enflammés1 à 4 et d’extravasation5 à 7 du système vasculaire dans les tissus aient été bien caractérisés, les facteurs qui déterminent et régulent la motilité interstitielle des lymphocytes T restent indéfinis. La migration des lymphocytes T dans des environnements 3D complexes a été étudiée ....
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Protocole
Toutes les procédures impliquant des souris ont été approuvées par le soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université de Rochester, et réalisées en stricte conformité avec la Loi sur la protection des animaux et de la Politique sur les services de santé publique sur Humane soin et l'utilisation des animaux de laboratoire administré par le National Institutes de la Santé, Bureau de la protection des animaux de laboratoire.
1. Préparation des effecteurs T CD4 cellules
NOTE: BALB / c TCR transgénique DO11.10 souris qui reconnaissent spécifiquement un peptide à partir d'oval....
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Résultats
La capacité à étudier les réponses immunes in situ , sans altérer l'environnement immunitaire est essentielle pour l' étude des interactions en temps réel des cellules T effectrices avec un tissu enflammé. Imagerie du derme de l' oreille intacts par ce protocole, présenté sur la figure 1A et B, permet la visualisation des cellules T effectrices marquées par fluorescence transférés dans l'interstitium cutanée. Cela permet à la foi.......
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Discussion
Importance
Nous présentons ici un protocole complet pour la visualisation 4D transférés, effectrices spécifiques de l'antigène des cellules Th1 dans les intactes derme de l'oreille de la souris. Cette méthode offre des avantages sur des techniques d'imagerie actuelles pour plusieurs raisons. En imageant le derme de l'oreille ventrale, nous sommes en mesure de renoncer à l'épilation qui est nécessaire pour des protocoles d'imagerie impliquant d'autres site.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs remercient l'Université de Rochester installation multiphotonique Microscope de base pour l'aide avec l'imagerie en direct. Pris en charge par le NIH AI072690 et AI02851 à DJF; AI114036 à AG et AI089079 à MGO.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Souris BALB/c | Jackson Laboratories | 000651 | Les souris utilisées ont été élevées en interne |
| Souris DO11.10 | Laboratories | 003303 | Les souris utilisées ont été élevées en interne |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Chaleur inactivée à 56 ° ; C pendant 30 minutes |
| Complément de cobaye | Cedarlane | CL-5000 | |
| Anticorps anti-CD8 | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Anticorps dérivés de cet hybridome |
| Anticorps anti-CMH de classe II | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Anticorps dérivés de cet hybridome |
| Anticorps anti-CD24 | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Anticorps dérivés de ; cet hybridome |
| anticorps anti-Thy1.2 | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Anticorps dérivés de cet hybridome |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| anticorps anti-CD62L biotinylé (clone MEL-14) | BD | ||
| billes de séparation magnétique streptavidine | Miltenyi | 130-048-101 | |
| Colonne de séparation MACS LS | Miltenyi | 130-042-401 | |
| humaine recombinante IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| souris recombinante IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| souris recombinante IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anticorps anti-IFNg (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| Anticorps anti-IL-4 (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoéthanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| peptide d’ovalbumine | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Sérum de veau fœtal (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Chaleur inactivée à 56 ° ; C pendant 30 minutes |
| Plaque de culture à 24 puits | LPS | 3526 | Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 Seringues à insuline G1/2, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 Seringues à insuline G1/2, 300&mu ; l | BD | 309301 | |
| 27 seringues G1/2 TB, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 aiguilles G1/2 | BD | 305106 | |
| Tube médical PE-10 | BD | 427400 | |
| adhésif vétérinaire cyanoacrylate (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| chauffante | WPI | 61830 | |
| Contrôleur de plaque chauffante | WPI | ATC-2000 | |
| Contrôleur de couverture d’eau | Gaymar | TP500 | N’est plus en production, nouvel équivalent disponible |
| couverture d’eau | Kent Scientific | TP3E | |
| Vaporisateur d’isoflurane | LEI Medical | Isotec 4 | N’est plus en production, nouvel équivalent disponible |
| isoflurane | Henry Schein | vétérinaire microtubes | |
| centrifuger | VWR | 20170-038 | Multiple |
| Equivalent medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built-In-house, voir Fig 2 | ||
| plate-forme | Built-In-house, voir Fig 2 | ||
| pince courbe | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| ciseaux | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| lamelles en verre | VWR | Multiple Equivalent | |
| graisse sous vide poussé | Fisher | 146355D | |
| Cotons-tiges | Multiple Equivalent | ||
| task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM microscope droit avec Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti :Sa laser | Olympus | appel à devis | |
| table optique avec contrôle des vibrations | Newport | appel à devis | |
| 25x NA 1.05 objectif à immersion dans l’eau pour l’imagerie multiphotonique | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objectif chauffage | Bioptechs | PN 150815 | |
| Détection cube de filtre | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Cube propriétaire, peut être approximé à partir de filtres individuels/dichroïques |
| anti-intégrine &bêta ; 1 anticorps (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Sans azoture, faible teneur en endotoxines, |
| anti-intégrine et bêta ; 3 (clone 2C9. G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Sans azoture, faible teneur en endotoxine |
| Texas Red Dextran (70 000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
Références
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al.
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Réimpressions et autorisations
