Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Et le HF183 marqueur humain Fecal associé dans les eaux

Yiping Cao; Meredith R. Raith; John F. Griffith

doi:10.3791/53611

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Article de méthode

Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la

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DOI :

10.3791/53611

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9 mars 2016

Yiping Cao¹ , Meredith R. Raith¹ , John F. Griffith¹

¹Department of Microbiology, Southern California Costal Water Research Project Authority

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit un essai PCR duplex numérique qui peut être utilisé pour quantifier simultanément Enterococcus spp. , Et les marqueurs génétiques HF183 comme indicateurs de contamination fécale générale et humaine associée dans les eaux récréatives.

Résumé

Ce manuscrit décrit un test de PCR numérique duplex (EntHF183 RCPH) pour la quantification simultanée de Enterococcus spp. Et le marqueur humain HF183 fécale associée. Le EntHF183 duplex RCPH (dénommé EntHF183 RCPH de maintenant) test utilise les mêmes amorces et sondes séquences que ses PCR quantitative (qPCR) homologues individuels publiés. De même, les mêmes procédures de filtration d'eau et d'extraction d'ADN effectuée avant qPCR sont suivies avant d'exécuter RCPH. Cependant, le dosage duplex DPCR présente plusieurs avantages par rapport aux essais de qPCR. Plus important encore, le dosage RCPH élimine la nécessité d'exécuter une courbe standard et donc, le biais et la variabilité associée, par quantification directe de ses objectifs. En outre, alors que duplexage (c. -à- quantification simultanée) Enterococcus et HF183 en qPCR conduit souvent à une sous - estimation grave de la cible moins abondante dans un échantillon, RCPH fournit une quantification cohérente des deux cibles, aiguisentelle quantifié individuellement ou simultanément dans la même réaction. Le dosage DPCR est également capable de tolérer des concentrations d'inhibiteur de PCR qui sont un à deux ordres de grandeur plus élevées que celles tolérées par qPCR. Ces avantages font l'essai EntHF183 RCPH particulièrement intéressante, car elle fournit simultanément des informations précises et reproductibles à la fois sur la contamination générale et humaine associée fécale dans les eaux environnementales sans la nécessité d'exécuter deux essais qPCR séparés. En dépit de ses avantages sur qPCR, la limite de quantification supérieure du dosage RCPH avec instrumentation disponible actuellement est d'environ quatre ordres de grandeur inférieure à celle obtenue par qPCR. Par conséquent, la dilution est nécessaire pour la mesure des concentrations élevées d'organismes cibles, tels que ceux qui sont habituellement observés à la suite de déversements d'eaux usées.

Introduction

Les méthodes quantitatives PCR (qPCR) ont été largement utilisés à des fins récréatives surveillance de la qualité de l'eau et microbiennes des applications de suivi de la source, car ils sont plus rapides, plus flexibles et spécifiques par rapport aux méthodes basées sur la culture traditionnelle. Par conséquent, qPCR est recommandé pour obtenir des résultats de surveillance des eaux rapides des indicateurs fécaux généraux tels que Enterococcus spp. , Dans la version révisée de l' EPA eau récréative des critères de qualité ^1. De nombreux essais qPCR ont également été mis au point et validé pour identifier les sources de contamination féca....