Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

Des développements techniques récents ont permis d'améliorer la polyvalence, l'applicabilité et la nature quantitative de l'EM, conduisant à une reprise de l'analyse ultrastructurale. Les progrès comprennent 3D EM, à grande échelle 2D EM et des méthodes et des réactifs améliorés pour la microscopie corrélative de microscopie optique et électronique (CLEM) pour comparer d' autres modes d'analyse microscopique directement au niveau EM ^8-10. À grande échelle 2D EM est particulièrement adapté pour quantifier ou identifier (nouveaux) caractéristiques de la maladie pour la pathologie humaine, étudier les modèles animaux pour les modèles de la maladie et de la culture de tissus. En raison de la petite généralement champ de vision, il est difficile d'établir une corrélation entre les changements à fort grossissement à une large échelle de tissus, ainsi que pour analyser quantitativement et sans biais caractéristiques ultrastructurales.

Pour l'analyse pathologique du tissu humain ou l'évaluation de la pathologie dans les modèles animaux, l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) des sections colorées de formaldéhyde paraffine (FFPE fixe embarqué) tisSue est la norme. En plus simple, coloration H & E immunomarquage est également effectuée pour identifier les anomalies pathologiques. Si de tels tissus pourraient être analysés au niveau EM, des types cellulaires spécifiques, et les changements subcellulaires ont pu être identifiés. La nature impartiale de grande EM échelle permet de trouver des caractéristiques inattendues et nouvelles de la maladie. En grande échelle des zones EM jusqu'à en millimètres carrés peuvent être visualisées. Nous et d' autres nanotomy de rat îlots pancréatiques ^4, de culture cellulaire ^2, cerveau de rat ^3, la peau et les muqueuses ⁷ et toute larves de poisson zèbre ^1,5 (www.nanotomy.org) précédemment appliqué. Le poisson zèbre est très approprié pour l' imagerie in vivo, en particulier pour visualiser les types de cellules qui sont difficilement accessibles dans des tissus de mammifères , y compris les cellules immunitaires du cerveau ^11. Ici, la procédure de nanotomy est décrite en détail, appliqué à des coupes coronales de têtes de poisson zèbre subissant une ablation neuronale conditionnée par la conversion du métronidazole par neuronalenitroreductase exprimé (www.nanotomy.org) ^5,12-14. Toutes les données brutes sont présentées sous forme de fichiers HTML zoomables, la visualisation moléculaire à des changements d'échelle tissulaire. La présentation des données brutes permet des analyses impartiales sur les ensembles de données à partir d'autres angles par des experts du monde entier.

Toutes les expériences avec les larves de poisson zèbre ont été approuvées par le Comité l'expérimentation animale de l'Université de Groningen selon les directives nationales et européennes.

Préparation 1. Echantillon

1. Fixation and Embedding
   1. Fixation
      1. Les larves de poissons dans tricaïne (0,003%) anesthésier ajouté au (NaCl 5 mM , KCl 0,17, 0,33 mM de _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4, 10 mM HEPES, pH 7,6) E3 de l' eau du poisson zèbre et un test pour la profondeur de l' anesthésie en poussant doucement avec une pointe de pipette 200 pi sous dissection microscope jusqu'à ce que le mouvement ne soit plus détecté (figure 1A).
      2. Lors du traitement des échantillons pour EM corrélative après l' acquisition de données d'imagerie in vivo en utilisant confocal ou d' imagerie 2 photons dans 1,8% d' agarose comme décrit, ^5,15 fix larves d' agarose en utilisant 4% de PFA dans du PBS contenant du Triton-X-100 (0,05%).
      3. Couper les larves d'agarose et le processus deEM à grande échelle ^5.
      4. Fixer des larves dans du paraformaldehyde frais à 4% dans du PBS contenant du Triton-X-100 (0,05%) pendant 2 heures à la température ambiante dans des tubes en plastique.
         Note: Les cellules cultivées en culture (in vitro) peut être directement fixé dans du glutaraldéhyde, comme décrit dans l'étape suivante (1.1.1.5).
      5. Enlever la solution et ajouter 100 ul de 0,5% de PFA, 2% de glutaraldéhyde (GA), et 0,1 M de cacodylate de sodium (pH 7,4). Conserver une nuit à 4 ° C. échantillons Rincer deux fois dans cacodylate de sodium 0,1 M.
      6. Couper les têtes des larves rostrale du cerveau postérieur pour faciliter la pénétration de l'osmium. Utilisez fines seringues / forceps.
      7. Postfix larves dans 1% de tétroxyde d' osmium (OSO ₄₎ /1.5% ferrocyanure de potassium (K ₄ [Fe (CN) _6]) dans 0,1 M de cacodylate de sodium sur la glace pendant 2 heures et rincer 3 x 5 min dans le double H distillée ₂ O.
      8. Déshydrater dans l'éthanol par 20 min d'incubation dans des concentrations croissantes d'éthanol (50%, 70%, 3 fois par 100%).
   2. Incorporation
      1. Préparer une résine époxy selon les recettes standard utilisés dans les laboratoires de EM.
         Remarque: Nous utilisons une résine époxy comme suit: mélanger 19,8 g glycid éther 100, 9,6 g d'anhydride d'acide 2-dodécénylsuccinique et 11,4 g d'anhydride méthylnadique utilisant un agitateur magnétique. Ajouter 0,5 g DMP-30 (tris- (diméthylaminométhyl) phénol) et mélanger à nouveau.
      2. Incuber les larves pendant une nuit dans une résine époxy à 50% dans de l'éthanol (v / v) pendant la rotation (RT).
      3. Remplacer dilué résine époxy avec de la résine pure. Incuber pendant 30 min, ajouter résine fraîche à nouveau et incuber pendant 30 min. Encore une fois rafraîchir la résine puis incuber 3 heures à température ambiante, puis 15 min à 58 ° C et un autre 1 heure à température ambiante sous basse pression (200 mbar).
      4. Orienter les têtes dans disponibles dans le commerce silicium plat moules d'encastrement sous un microscope de dissection à l'aide d'une aiguille ou d'un cure-dent avec la face antérieure faisant face au côté du moule, ou au besoin (Figure 1B).
      5. Polymériser res époxydans la nuit à 58 ° C. Si la résine époxy est encore trop mou permettre un autre jour pour polymériser et durcir à 58 ° C. raideur de test en appliquant une pression en utilisant une pince. Si cela laisse facilement une indentation permettre un autre jour pour polymériser et durcir à 58 ° C. Lorsque l'échantillon est entièrement durci procéder à la coupe et la coupe.
      6. Coupez l' excédent de résine des stub en utilisant des lames de rasoir (figure 1B).
2. Sectionnement, contrastante et montage
   1. Sectionnement
      1. bloc de résine Section époxy en utilisant un ultramicrotome.
      2. Utilisez un couteau de verre ou un histoknife de diamant pour couper des sections semithin (500 nm) pour le bleu de toluidine / fuchsine basique (figure 1D) coloration pour détecter le bon positionnement.
      3. Transfert semi-minces sections sur des lames microscopiques en les ramasser avec une pipette Pasteur en verre dont la pointe a été fermée par fusion dans une flamme. Sec sur une plaque chauffante uusqu'à pas d'eau est laissé. La coloration pendant 10 secondes avec 1% de bleu de toluidine dans l'eau sur une plaque chaude et, après rinçage à l'eau, aux taches pendant 10 s avec 0,05% de fuchsine basique dans le tétraborate de sodium à 1%. Examiner avec un microscope optique normal à 10X à 40X.
      4. Lorsque le site / l' orientation correcte dans le cerveau est atteinte, continuer sectionner le bloc de résine époxy avec un couteau de diamant pour couper des sections ultra - minces (~ 70 nm; figure 1E)
      5. Utilisez les structures anatomiques facilement identifiables dans et autour du cerveau, y compris les fosses olfactives, les yeux, les limites de la matière grise-blanche, pour identifier la région d'intérêt pendant ultraminces sectionner et d'ajuster l'angle de coupe lors de l'échantillon est incliné.
      6. Section mont sur ​​simple fente grilles L2 x 1 de cuivre (figure 1F), afin de permettre l' acquisition non interrompu par des barres de grille. Utilisez Formvar grilles revêtues pour soutenir les sections.
   2. Contrastant
      1. coupes ultrafines Tache sur la grilles pendant 2 minutes à 2% d' acétate d'uranyle dans du methanol suivi par Reynolds du citrate de plomb pendant 2 min ^16.

2. Image Acquisition

1. Large Scale STEM
   Remarque: Nous utilisons l' analyse EM avec un générateur de balayage externe capable d'acquérir plusieurs grands champs de vision à haute résolution ^3,5,7,17 ​​utilisant la détection de STEM. Typiquement, une image générée de cette manière est équivalente aux champs de vision de 100 ~ microscope électronique à transmission (TEM) images, ce qui réduit considérablement la quantité de couture.
   1. Exemple de montage dans Microscope
      1. Placer la grille à l'article dans le porte-échantillon de grille multiples et transférer dans la chambre de la SEM.
   2. Alignement du détecteur STEM
      1. Mettez la grille avec l'échantillon sous le faisceau et le déplacer jusqu'à sorte qu'il sera environ. 5 mm par rapport au pôle de la lentille. Acquérir une image à 20 kV en utilisantle détecteur à lentille.
      2. Concentrez sur le bord de la grille et régler la distance de travail à 4,0 mm.
      3. Déplacez le porte-échantillon à une position de sécurité et apporter le détecteur STEM.
      4. Centrez le trou du détecteur STEM dans le champ de l'image en tournant les ajustements vis en imagerie à vitesse maximale avec le détecteur en verre.
      5. Ramener ensuite avec précaution en arrière le porte-échantillon qui vient se loger entre le pôle de lentille et le détecteur.
      6. Acquérir une image avec le détecteur en verre pour être sûr d'être sur la zone de section.
      7. Passer en STEM détection (milieu de gain et de tous les quadrants fixés sur «moins») et d'acquérir une image et sélectionner la zone à numériser.
      8. Augmenter la tension d'accélération de 21 kV et d'attendre la stabilisation du faisceau (image stable à nouveau), puis aller à 29 kV par paliers de 2 kV.
   3. Acquisition d' images
      1. Pré-irradier l'échantillon (pour éviter les changements de luminosité causés par le e-beam) en zoomantde manière complète la zone à numériser est compatible avec la fenêtre d'image.
      2. Changer l'ouverture à 120 um (pour garder la plage dynamique appropriée les gains de détection doivent être réduit une seule étape).
      3. De-focus pour que l'image est floue.
      4. Faire de la zone balayée aussi serrée que possible en utilisant l'option de balayage de zone réduite.
      5. Réglez la vitesse de balayage de telle sorte qu'une image est balayée env. 1 - 2 sec.
         Remarque: En fonction de la taille et du tissu cela prend généralement ½ h (100 x 100 um FOV) à un maximum de 3 heures (1000 x 500 um).
      6. Zoom dans au moins 100X et balayer une petite surface pendant 10 secondes.
         Remarque: Lorsque cette zone ne change pas la luminosité par rapport à sa pré-irradiation environnante est suffisante.
      7. Ramener l'ouverture de 30 pm (et STEM gain sur support)
      8. Concentrez l'échantillon.
      9. Alignez ouverture à l'aide du wobbler (à ~ 40,000X grossissement).
      10. Alors que la mise au point de sélectionner le plus léger zone / fonction, régler la vitesse de balayage de telle sorte que les détailssont visibles.
      11. Dans le logiciel de microscope régler la luminosité et le contraste en regardant attentivement l'histogramme de garder tous les pixels dans la plage dynamique. Faites de même pour les plus sombres zone / caractéristiques.
      12. Retour à la zone lumineuse et vérifier à nouveau. Soyez sur le côté sécuritaire donc il y a un peu d'espace sur les deux côtés de l'histogramme.
      13. Zoom arrière de sorte que la surface à analyser correspond à la fenêtre d'imagerie, et commencer le grand programme d'acquisition de la zone.
      14. Utilisez l'option de l'assistant pour configurer une mosaïque en sélectionnant une zone de l'écran. Utiliser la taille du pixel 2-5 nm en fonction de ce que les détails sont nécessaires. Utilisez le temps de séjour de 3 ms pour STEM.
      15. Sélectionnez l'option "mise au point automatique sur la tuile précédente", utilisez la grande mise au point automatique du logiciel d'acquisition à grande échelle avec les paramètres de l'entreprise par défaut, la case à cocher "vérifier la mise en avant l'exécution" et définir où enregistrer les données.
      16. Appuyez sur "optimiser" pour vérifier les réglages du microscope.
          Remarque: Maintenant, le temps nécessaire sera shposséder. Cela pourrait être jusqu'à 72 h pour 1 x 0,5 mm zones.
      17. Dans la fenêtre de type "résolution de tuiles maximale" 20.000 carreaux de sorte individuels ne seront pas plus grand que 20k x 20k, ce qui empêche les effets de bord contondants. Appuyez sur "exécuter".
      18. Lorsqu'on lui a demandé de vérifier focus et Luminosité / Contraste (B / C), éteindre le générateur de balayage externe et ajuster le focus et l'astigmatisme dans le logiciel de microscope avec soin. Ne pas changer B / C.
          Remarque: L'étape peut être déplacé et le grossissement changé, mais le grossissement doit être en retrait à la taille de pixel souhaitée.
      19. Allumez le générateur de balayage externe à nouveau et appuyez sur "continuer".

Analyse 3. Données

1. Ouvrez programme de visualisation fichier EM à grande échelle et ouvrez le fichier "info mosaïque". Cela permettra d'ouvrir tous les fichiers TIF-carrelées. Ceci est de préférence réalisé sur un autre poste de travail pour ne pas gêner les nouvelles acquisitions.
2. Choisissez l'option "aupour assembler toute la mosaïque (paramètres chevauchent le mode sur la moitié, couture seuil de 0,90, la réduction automatique du bruit. Dans le cas des critères de couture ne peuvent pas être remplies, zoom et placez manuellement la tuile en position et cliquez sur "Continuer comme cela est ').
3. Exporter sous forme de fichier html, ou encore comme un seul TIF.
   Notez que pour les TIF exporter un downscaling pourrait être nécessaire. Inclure la taille de pixel finale dans le nom de fichier permettant des mesures plus tard.
4. Effectuer des annotations dans le fichier TIF en l'ouvrant dans un programme de retouche d'image. En parallèle, ouvrez le fichier html zoomable dans un navigateur web pour l'observation de la résolution optimale.

À grande échelle EM jeu de données de coupes coronales de la tête de 1-semaine-larves de poisson zèbre montre de nombreux tissus et fonctions cellulaires dans une seule image à grande échelle (www.nanotomy.org).

Nanotomy des coupes de cerveau de contrôle révèle des caractéristiques ultrastructurales typiques du tissu neural du cerveau antérieur rostral y compris les faisceaux de fibres olfactives, des noyaux neuronaux et les sous-compartiments neuronaux dont les synapses (figure 2A, www.nanotomy.org). Les types de cellules dans la tête que l'on peut distinguer notamment les chondrocytes avec de grandes vacuoles dans la mâchoire inférieure, la myéline osmiophile des cellules nerveuses olfactives, les cellules endothéliales d'un petit vaisseau, les structures comprennent la méninge (la contrepartie zebrafish des méninges, la couche enveloppante membraneuse le cerveau des mammifères). structures sous-cellulaires comprennent la glycocalyx de l'épiderme, différentes morphologies nucléaires et des foyers différents dans les cel types et organites l y compris l'appareil de Golgi, réticulum endoplasmique (RE), les mitochondries et les vésicules synaptiques et les densités post-synaptiques.

De manière inattendue les noyaux des cellules qui tapissent le ventricule sont très denses aux électrons par rapport aux autres cellules dispersées plus latéralement dans le cerveau. En outre, ces noyaux présentent des foyers ventriculaires sombres qui sont absentes dans d' autres cellules dans le cerveau et semblent différents en taille et la structure de l'hétérochromatine, qui se trouve dans les noyaux des cellules microgliales phagocytaire (figure 2). Les cellules qui tapissent le ventricule dans le développement de zebrafish comprennent des cellules gliales essentiellement radiales et progéniteurs neuronaux, ce qui peut refléter un état de la chromatine altérée que les cellules plus différenciées. Comme les cellules souches dans les tissus sont généralement assez rares, nanotomy de corréler l'étiquetage des tissus pour les marqueurs de cellules souches avec échelle tissulaire EM pourrait donc être utilisé pour identifier les caractéristiques ultrastructurales des cellules souches.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> EM à grande échelle (www.nanotomy.org) d'une section coronale dans une larve zebrafish subissant l'ablation neuronale révèle de nombreux tissus spécifiques et les caractéristiques cellulaires et moléculaires non trouvés chez les animaux témoins. caractéristiques cellulaires comprennent microglie phagocytaires et vacuoles la taille des cellules, représentant probablement des cellules meurent (Figure 2B, www.nanotomy.org). des études antérieures EM ont identifié microglie chez les vertébrés 18,19. les traits caractéristiques de la microglie comprennent des noyaux allongés , des touffes de la chromatine lacunaire à côté de l'enveloppe nucléaire, l'appareil de Golgi de premier plan, polyribosomes libres, réticulum endoplasmique granulaire (ER) avec une longue cisternes étroite cytoplasme relativement sombre / dense et de nombreuses inclusions, telles que les phagosomes, des gouttelettes lipidiques et les lysosomes. Tous ceux-ci poinçons, attribués à la microglie dans les tissus de mammifères, ont également été trouvés dans ces cellules dans le cerveau de poisson zèbre (figure 2B, www.nanotomy.org). <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figure 1: Flux de tissus à grande échelle Electron Microscopy sur Brains Zebrafish. (A) 7 jours-larve de poisson zèbre. (B) têtes larvaires Zebrafish embarqués côte à côte dans la résine époxy. Couteau (C) en verre pour les semi -thin sectionnant et en orientant l'échantillon. (D) semithin toluidine section teinté bleu représentant montrant deux side-by-side intégré larves de poisson zèbre. couteau (E) de diamant pour couper ultrafines (70 nm) sections. (F) image modifiée en (D) de la section entière du cerveau des larves de poisson zèbre sur la grille d' un trou pour indiquer le positionnement. (G) système de Microscopie utilisé à grande échelle 2D EM dans cette étude. (H) Flux de traitement d'image. S'il vous plaît , cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.

. Figure 2: Nanotomy Résultats:. De macromolécule à Tissue (A) Nanotomy des cerveaux de 7 jours de contrôle post-fertilisation et (B) traités (ablation neuronale; Figure 1), montrant des caractéristiques spécifiques à la neuronal ablation cérébrale dégénérative (B) Ces inclure les microglies, les cellules phagocytaires sombres subissant une mort cellulaire et d' aspect spongieux du tissu nerveux ((A) et (B)). Panneaux supérieurs (adapté de 5): 10X vue agrandie de la région ont indiqué dans les panneaux intermédiaires. panneaux Moyen: vue 10X agrandie de la région ont indiqué dans les panneaux inférieurs. (A, panneau du milieu) de vue à fort grossissement de neuropile montrant synapse (A, panneau inférieur), les vésicules synaptiques (SVS) etla densité post-synaptique (PD). (B, Panneau central) vue à fort grossissement de la microglie amiboïde ou peut - être un macrophage (panneau du milieu, M) montrant des caractéristiques typiques amiboïdes microgliales (panneau inférieur) , y compris l' appareil de Golgi de premier plan (G), les inclusions dont vacuoles lysosomales (L). Barres d'échelle: 50 um (haut), 5 um (moyenne) et 0,5 um (en bas). Ce chiffre a été modifié depuis 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure , ou visiter les données en ligne complète (nanotomy.org).

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.