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Article de méthode

Time-Lapse Video Microscopy pour l'évaluation de EYFP-Parkin Agrégation comme un marqueur pour Cellular Mitophagy

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DOI :

10.3791/53657

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4 mai 2016

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1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons en détail une approche de microscopie vidéo en accéléré pour mesurer le recrutement temporel d’EYFP-Parkin lors de l’élimination sélective des mitochondries endommagées. Ce processus dynamique d’élimination des mitochondries endommagées dépendante de l’EYFP-Parkin peut être utilisé comme indicateur de la santé cellulaire dans différentes conditions expérimentales.

Résumé

La microscopie vidéo en accéléré peut être définie comme l’imagerie en temps réel de cellules vivantes. Cette technique repose sur la collecte d’images à différents points temporels. Les intervalles de temps peuvent être réglés via une interface informatique qui contrôle la caméra intégrée au microscope. Ce type de microscopie nécessite à la fois la capacité d’acquérir des événements très rapides et le signal généré par la structure cellulaire observée lors de ces événements. Une fois les images collectées, un film de l’ensemble de l’expérience est assemblé pour montrer la dynamique des événements moléculaires d’intérêt. La microscopie vidéo time-lapse a un large éventail d’applications dans le domaine de la recherche biomédicale et constitue un outil puissant et unique pour suivre la dynamique des événements cellulaires en temps réel. Grâce à cette technique, nous pouvons évaluer les événements cellulaires tels que la migration, la division, la transduction du signal, la croissance et la mort. De plus, à l’aide de sondes moléculaires fluorescentes, nous sommes en mesure de marquer des molécules spécifiques, telles que l’ADN, l’ARN ou les protéines, et de les suivre à travers leurs voies moléculaires et leurs fonctions. La vidéomicroscopie time-lapse présente de multiples avantages, le principal étant la capacité de collecter des données au niveau de la cellule unique, ce qui en fait une technologie unique pour l’investigation dans le domaine de la biologie cellulaire. Cependant, la microscopie vidéo time-lapse présente des limites qui peuvent interférer avec l’acquisition d’images de haute qualité. Les images peuvent être compromises par les deux facteurs externes ; les fluctuations de température, les vibrations, l’humidité et les facteurs internes ; pH, motilité cellulaire. Ici, nous décrivons un protocole pour l’acquisition dynamique d’une protéine spécifique, la parkine, fusionnée avec la protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) afin de suivre l’élimination sélective des mitochondries endommagées, en utilisant une approche de microscopie vidéo en accéléré.

Introduction

La macro-autophagie est un processus intracellulaire qui implique la dégradation catabolique de composants cellulaires endommagés et dysfonctionnels, tels que les organites et les protéines, dans le but de recycler ou de produire de l’énergie. Pour initier ce processus métabolique, la cellule engloutit les composants cellulaires endommagés dans une structure à double membrane, connue sous le nom d’autophagosome, qui fusionne avec un lysosome et son contenu est dégradé et recyclé 1,2. Il existe deux grands types d’autophagie, la non sélective et la sélective. Le processus d’autophagie non sélective se produit lorsque la cellule est dans des conditions de privation de nutriments et a besoin de récupérer à la fois des nutriments essentiels et de l’énergie. Cependant, l’autophagie sélective se produit pour médier l’élimination des organites dysfonctionnels / endommagés et des protéines qui pourraient autrement être toxiques. L’un des processus d’autophagie sélective les plus étudiés est l’ablation des mitochondries, appelée mitophagie 1,3-5.

Les mitochondries sont les organites centraux du métabolisme cellulaire et la principale source d’adénosine triphosphate (ATP) via la phosphorylation oxydative à travers la chaîne de transport d’électrons, l’oxydation des acides gras et le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA). De plus, les mitochondries régulent la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et libèrent des protéines qui participent aux voies de mort cellulaire 6-8.

Classe

kinase putative induite par PTEN (PINK1) et l’ubiquitine ligase Parkin RBR E3 (Parkin) sont les protéines clés impliquées dans le processus de mitophagie. La parkine peut protéger contre la mort cellulaire en maintenant la cellule saine grâce au contrôle de la qualité mitochondriale9. Lors de la perte du potentiel de la membrane mitochondriale, la parkine cytosolique est recrutée dans les mitochondries par PINK1. Ce recrutement déclenche les événements séquentiels de la mitophagie 10. Il existe un large éventail de preuves que la mitophagie est un processus fondamental de contrôle de la qualité des mitochondries et que les anomalies de ce processus entraînent la maladie 7. Par exemple, la maladie de Parkinson autosomique récessive a été associée à des mutations dans les gènes codant pour Parkin et PINK1 (PARK2 et PINK1, respectivement) 11. Le contrôle de la qualité de la santé mitochondriale est essentiel pour l’élimination des mitochondries qui contribuent à l’accumulation de ROS12. Une présence excessive de ROS intracellulaires peut entraîner des dommages à la fois à l’ADN nucléaire et à l’ADN mitochondrial (ADN et ADN mt, respectivement).

Dans ce document, nous montrons une approche de microscopie vidéo en accéléré pour suivre l’agrégation de Parkine après l’induction de la mitophagie médiée par la parkine dans des fibroblastes embryonnaires de souris immortalisés via l’administration in vitro de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)-phénylhydrazone (FCCP), un agent de découplage. FCCP perturbe la synthèse de l’ATP en court-circuitant les protons à travers la membrane mitochondriale externe et en découplant ainsi la phosphorylation oxydative de la chaîne de transport d’électrons 13. Le déclenchement de la dépolarisation de la membrane mitochondriale entraîne la perturbation des mitochondries et l’élimination sélective de la Parkine dépendante. Par conséquent, la transfection des cellules d’intérêt avec un vecteur d’expression codant pour la Parkine fusionnée à un marqueur fluorescent (protéine fluorescente jaune améliorée, EYFP) peut être utilisée comme une marque fluorescente pour suivre le recrutement de Parkine au cours du processus mitophagique. Afin de visualiser les mitochondries, nous avons co-transfecté pDsRed2-Mito, qui code pour la protéine fluorescente rouge (DsRed2) qui contient une séquence de ciblage mitochondrial de la sous-unité VIII de la cytochrome c oxydase (Mito). pDsRed2-Mito est conçu pour le marquage fluorescent des mitochondries14. Le temps nécessaire à la translocation de la parkine dans la membrane mitochondriale peut être mesuré et donne une mesure indirecte de la santé cellulaire. Par exemple, nous pouvons dire que si une lignée cellulaire désactivée pour un gène d’intérêt particulier montre un recrutement plus rapide ou plus lent de Parkine après l’induction de la mitophagie par FCCP, ce produit génique serait un acteur clé afin de maintenir les taux métaboliques de la cellule à l’état physiologique et de prévenir le développement de maladies. Par conséquent, la microscopie vidéo time-lapse fournit un outil très puissant pour les applications de recherche fondamentale et clinique pour suivre la dynamique des protéines marquées au cours de leurs processus moléculaires et comprendre comment ces processus sont affectés au cours d’un état pathologique.

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Protocole

1. L'électroporation de fibroblaste avec deux vecteurs d'expression EYFP-Parkin et pDsRed2-Mito

  1. Cultiver les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris immortalisée sur 10 cm plaque de culture tissulaire en utilisant du DMEM (le milieu de Eagle modifié par Dulbecco) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 à 37 ° C.
    1. À 80% de confluence des cellules, éliminer le milieu DMEM complet par aspiration stérile et ajouter 10 ml d' une solution tampon de phosphate de 1x stérile (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 et 1 L distillation de H 2 O, pH: 7,4).
    2. Jeter le PBS par aspiration stérile et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA 0,25%. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont décollées (2 - 3 minutes). Ajouter 4 ml de milieu complet DMEM, remettre les cellules et sortir 10 _6, l de la suspension cellulaire pour le comptage hémocytomètre.
      NOTE: Le hémocytomètre est conçu de telle sorte que le nombre de cellules dans une série de 16 cases d'angle est égal au nombre de cellules x 10 4 / ml.
  2. Semences 1 x 10 6 cellules sur 10 cm boîtes de culture tissulaire de 24 heures avant le processus d'électroporation.
  3. Jeter le milieu DMEM complet par aspiration stérile et ajouter 10 ml de PBS stérile. Jeter le PBS par aspiration stérile et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA 0,25%. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont décollées (2 - 3 minutes). Ajouter 4 ml de milieu DMEM complet et remise en suspension des cellules dans un tube de 15 ml.
  4. Faites tourner les cellules vers le bas à 250 xg pendant 5 min en utilisant une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C). Jeter le surnageant par aspiration stérile et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS stérile. Faites tourner les cellules vers le bas à 250 g pendant 5 min à 4 ° C.
  5. Jeter le surnageant par aspiration stérile, et ajouter 100 pi of solution mélange pour l'électroporation (82 pi de solution d'électroporation V + 18 pi de solution supplémentaire 1) au culot cellulaire et resuspendre doucement le culot par pipetage (Pour plus de détails reportez-vous au guide de l'utilisateur). Ajouter 2 pg de EYFP-Parkin (excitation / émission 514/527) et 1 ug Mito-pDsRed2 (excitation / émission 565/620) à la suspension cellulaire.
  6. Transférer la solution dans la cuvette stérile à l'aide d'un pasteur jetable (les deux outils sont fournis avec le kit) et l'électroporation en utilisant le programme de pré-série NIH / 3T3 U-030 (impulsion unique, tension 200 V, capacité 960 uF, temps d'impulsion de 20 millisecondes , nombre d'impulsions: 1).
  7. Immédiatement après l'électroporation, ajouter 500 pi de milieu préchauffé frais DMEM complet et ensemencer la cellule sur un 6 cm plaque de culture tissulaire live-imagerie de qualité et de les incuber dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24 heures.

2. Time-Lapse Video Microscopy

  1. Régler la température de la chambre du microscope à 37 ° C avant utilisation.
  2. À ce stade, préparer un support d'imagerie en direct spécifique de procéder au protocole expérimental. Préparer le milieu de l'imagerie en direct de la manière suivante; mélanger du DMEM exempt de phénol supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine. Préchauffer le moyen d'imagerie en temps réel à 37 ° C dans un bain d'eau.
  3. Jeter le milieu des cellules électroporées par aspiration stérile et ajouter 1 ml de milieu préchauffé imagerie en temps réel, en utilisant une pipette P1000 et incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 ° C.
  4. Pendant la période d'incubation de la plaque, l' afflux 5% de CO 2 dans la chambre du microscope déjà à une température stable de 37 ° C.
  5. Placer la plaque avec les cellules électroporées dans la chambre du microscope évitant les mouvements ou oscillations majeures.
  6. Utilisation de l'interface du logiciel, réglez le microscope afin de détecter à la fois fluoreles signaux de Scence des protéines de fusion codées par les vecteurs cotransfectées, EYFP-Parkin (plage d'excitation 495-510 nm et la plage d'émission de 520-550 nm, vert) et le pDsRed2-Mito (excitation maximum de 558 nm et une émission maximale de 583 nm, rouge).
    1. Ouvrez le logiciel de microscopie vidéo time-lapse. Dans le menu supérieur sélectionnez le FITC pour EYFP-Parkin et rhodamine pour pDsRed2-Mito. Dans le menu supérieur sélectionnez le grossissement (20X).
  7. Utilisation de l'interface du logiciel, recherchez la cellule unique exprimant les deux vecteurs co-transfectées et enregistrer la position. Répétez cette étape jusqu'à un minimum de 10 cellules est recueilli pour chaque condition expérimentale (groupe expérimental).
    1. Sélectionnez le menu "Applications" et cliquez sur multi dimensionnelle Acquisition. Dans les fenêtres multi dimensionnelles Acquisition sélectionner les paramètres nécessaires, tels que le nombre d'acquisitions, l'intervalle de temps entre chaque acquisition et la position de la cellule enregistrée. Cliquez sur "Acquire"Pour démarrer le processus d'acquisition.
  8. Lancer l'acquisition basale des deux EYFP-Parkin et DsRed2-Mito signal fluorescent collecte des images toutes les 5 minutes pour un intervalle total de 15 min.
  9. Préparer moyen d'imagerie en temps réel préchauffée à une concentration de FCCP deux fois supérieure à la concentration finale de travail (0,1 à 10 uM, dépendant du type cellulaire).
  10. Interrompre le processus d'acquisition et ajouter doucement 1 ml de pré-chauffé support d'imagerie en temps réel avec FCCP dans la plaque à l'intérieur de la chambre du microscope à l'aide d'une pipette P1000.
  11. Redémarrer le processus d'acquisition, comme décrit précédemment, pendant une durée totale de 3 heures, à l'aide de la position enregistrée. Enregistrer toutes les images acquises afin de les analyser et de créer une vidéo du processus mitophagic lorsque l'acquisition est terminée.

3. Analyse

  1. Collecter toutes les images acquises en format ".tiff" sur un ordinateur personnel
  2. Ouvrez les images avec un chiffon doux graphiqueWare et définir l'intervalle de temps se sont produites à partir de la mitochondriale induite par dépolarisation au FCCP à la première image montrant le recrutement de Parkin dans la membrane mitochondriale (Les images sont acquises toutes les 5 minutes). Répéter cette analyse pour chaque cellule dans le groupe expérimental.
  3. Étiquette de la première cellule de la colonne sur une feuille de calcul avec le nom du groupe expérimental. Pour chaque groupe expérimental, mesurer les intervalles temporels pour Parkin recrutement d'un minimum de 10 cellules. Faire une moyenne des intervalles temporels calculés pour le recrutement Parkin et de définir l'écart-type pour chaque groupe expérimental (moyenne ± SD, N = 10).
    1. Organiser en colonnes les intervalles temporels calculés simples. Chaque colonne contient n = 10 mesures du groupe expérimental.
    2. Sélectionnez la fonction «moyenne» dans le menu Formula Builder. Sélectionner les données contenues dans la colonne. Sélectionnez la fonction "Déviation standard" dans le menu Formula Builder. Select les données contenues dans la colonne.
  4. En utilisant une approche statistique, comparer les groupes expérimentaux appliquant la statistique appropriée afin de définir une différence significative dans la dynamique de mitophagy entre les groupes expérimentaux. (Par exemple, deux groupes = test t de Student, trois ou plusieurs groupes = ANOVA plus un test post-hoc)

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Résultats

Ici, nous montrons comment la microscopie time-lapse vidéo est une technique puissante qui peut être utilisé pour suivre les événements moléculaires des protéines par fluorescence marqués dans une seule cellule. Les résultats représentatifs montrent aussi comment cette technique permet l'acquisition d'images de haute qualité. Lorsque les images du processus moléculaire, sont obtenus, nous avons la possibilité de les analyser de différentes manières. Ici, nous analysons l'inte...

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Discussion

Vidéomicroscopie peut être définie comme la technique qui étend l'imagerie des cellules vivantes à partir d'une seule observation dans le temps pour l'observation de la dynamique cellulaire sur de longues périodes de temps. Cette méthodologie se distingue d'un confocal simple, ou la microscopie de cellules vivantes, car elle permet à l'observateur d'identifier en temps réel une seule protéine fluorescente étiquetée et suivre sa dynamique à l'intérieur d'une seule cellule vivante. En fait,...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 à R.G.P.), le Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), une subvention de la Breast Cancer Research Foundation, des subventions généreuses du Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) et une subvention du Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). Ce travail a été en partie soutenu par une bourse postdoctorale de l’American Italian Cancer Foundation (G.D.) et la ressource partagée en bioimagerie du Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036). Le Ministère décline expressément toute responsabilité à l’égard d’une analyse, d’une interprétation ou d’une conclusion. Il n’y a aucun conflit d’intérêts associé à ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMCorning Life Science10-013-CVPréchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
DMEM sans phénolCorning Life Science17-205-CVPréchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
Sérum fœtal bovinSigma-AldrichF2442Préchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
L-GlutamineGibco25030Préchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
Pénicilline/streptomycineCorning Life Science30-002-CIPréchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
Vecteur d’expression EYFP-PARKINAddgene23955
Vecteur d’expression pDsRed2-MitoClontech632421
Nucleofector 2B dispositifLONZAAAD-1001S
Nucleofector pour kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M microscope inverséCARL ZEISS
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)-phénylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorph Molecular DevicesConstructeur expérimental ImageJ
Institut national de la santéConstructeur
expérimental

Références

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