Time-Lapse Video Microscopy pour l'évaluation de EYFP-Parkin Agrégation comme un marqueur pour Cellular Mitophagy

Résumé

Ici, nous décrivons en détail une approche de microscopie vidéo en accéléré pour mesurer le recrutement temporel d’EYFP-Parkin lors de l’élimination sélective des mitochondries endommagées. Ce processus dynamique d’élimination des mitochondries endommagées dépendante de l’EYFP-Parkin peut être utilisé comme indicateur de la santé cellulaire dans différentes conditions expérimentales.

Résumé

La microscopie vidéo en accéléré peut être définie comme l’imagerie en temps réel de cellules vivantes. Cette technique repose sur la collecte d’images à différents points temporels. Les intervalles de temps peuvent être réglés via une interface informatique qui contrôle la caméra intégrée au microscope. Ce type de microscopie nécessite à la fois la capacité d’acquérir des événements très rapides et le signal généré par la structure cellulaire observée lors de ces événements. Une fois les images collectées, un film de l’ensemble de l’expérience est assemblé pour montrer la dynamique des événements moléculaires d’intérêt. La microscopie vidéo time-lapse a un large éventail d’applications dans le domaine de la recherche biomédicale et constitue un outil puissant et unique pour suivre la dynamique des événements cellulaires en temps réel. Grâce à cette technique, nous pouvons évaluer les événements cellulaires tels que la migration, la division, la transduction du signal, la croissance et la mort. De plus, à l’aide de sondes moléculaires fluorescentes, nous sommes en mesure de marquer des molécules spécifiques, telles que l’ADN, l’ARN ou les protéines, et de les suivre à travers leurs voies moléculaires et leurs fonctions. La vidéomicroscopie time-lapse présente de multiples avantages, le principal étant la capacité de collecter des données au niveau de la cellule unique, ce qui en fait une technologie unique pour l’investigation dans le domaine de la biologie cellulaire. Cependant, la microscopie vidéo time-lapse présente des limites qui peuvent interférer avec l’acquisition d’images de haute qualité. Les images peuvent être compromises par les deux facteurs externes ; les fluctuations de température, les vibrations, l’humidité et les facteurs internes ; pH, motilité cellulaire. Ici, nous décrivons un protocole pour l’acquisition dynamique d’une protéine spécifique, la parkine, fusionnée avec la protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) afin de suivre l’élimination sélective des mitochondries endommagées, en utilisant une approche de microscopie vidéo en accéléré.

Introduction

La macro-autophagie est un processus intracellulaire qui implique la dégradation catabolique de composants cellulaires endommagés et dysfonctionnels, tels que les organites et les protéines, dans le but de recycler ou de produire de l’énergie. Pour initier ce processus métabolique, la cellule engloutit les composants cellulaires endommagés dans une structure à double membrane, connue sous le nom d’autophagosome, qui fusionne avec un lysosome et son contenu est dégradé et recyclé ^1,2. Il existe deux grands types d’autophagie, la non sélective et la sélective. Le processus d’autophagie non sélective se produit lorsque la cellule est dans des conditions de pri....

Protocole

1. L'électroporation de fibroblaste avec deux vecteurs d'expression EYFP-Parkin et pDsRed2-Mito

1. Cultiver les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris immortalisée sur 10 cm plaque de culture tissulaire en utilisant du DMEM (le milieu de Eagle modifié par Dulbecco) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO ₂ à 37 ° C.
   1. À 80% de confluence des cellules, éliminer le milieu DMEM complet par aspiration stérile et ajouter 10 ml d' une solution tampon de phosphate de 1x stérile (PBS) (80 g de N....

Résultats

Ici, nous montrons comment la microscopie time-lapse vidéo est une technique puissante qui peut être utilisé pour suivre les événements moléculaires des protéines par fluorescence marqués dans une seule cellule. Les résultats représentatifs montrent aussi comment cette technique permet l'acquisition d'images de haute qualité. Lorsque les images du processus moléculaire, sont obtenus, nous avons la possibilité de les analyser de différentes manières. Ici, nous analysons l'inte.......

Discussion

Vidéomicroscopie peut être définie comme la technique qui étend l'imagerie des cellules vivantes à partir d'une seule observation dans le temps pour l'observation de la dynamique cellulaire sur de longues périodes de temps. Cette méthodologie se distingue d'un confocal simple, ou la microscopie de cellules vivantes, car elle permet à l'observateur d'identifier en temps réel une seule protéine fluorescente étiquetée et suivre sa dynamique à l'intérieur d'une seule cellule vivante. En fait,.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Corning Life Science	10-013-CV	Préchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
DMEM sans phénol	Corning Life Science	17-205-CV	Préchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
Sérum fœtal bovin	Sigma-Aldrich	F2442	Préchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
L-Glutamine	Gibco	25030	Préchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
Pénicilline/streptomycine	Corning Life Science	30-002-CI	Préchauffage à 37 ° ; C avant utilisation
Vecteur d’expression EYFP-PARKIN	Addgene	23955
Vecteur d’expression pDsRed2-Mito	Clontech	632421
Nucleofector 2B dispositif	LONZA	AAD-1001S
Nucleofector pour kit R NIH/3T3	LONZA	VCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M microscope inversé	CARL ZEISS
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)-phénylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
	MetaMorph Molecular Devices	Constructeur expérimental ImageJ
	Institut national de la santé	Constructeur

expérimental