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Article de méthode

Imagerie fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris Utilisation du CLARITY / Technique CUBIC

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DOI :

10.3791/53673

⸱

26 février 2016

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

Dans cet article

Résumé

Les projections supraspinales sont importantes pour la perception de la douleur et d’autres comportements, et les fibres sérotoninergiques sont l’un de ces systèmes de fibres. La présente étude s’est concentrée sur l’application du protocole combiné CLARITY/CUBIC à la moelle épinière de souris afin d’étudier la terminaison de ces fibres sérotoninergiques.

Résumé

fibres descendantes longues à la moelle épinière sont essentiels pour la locomotion, la perception de la douleur, et d'autres comportements. Le motif de terminaison des fibres dans la moelle épinière de la plupart de ces systèmes de fibres n'a pas été complètement étudiée chez toutes les espèces. fibres sérotoninergiques, qui projettent de la moelle épinière, ont été étudiés chez des rats et des opossums sur des coupes histologiques et leur signification fonctionnelle a été déduite en fonction de leur motif de terminaison de fibre dans la moelle épinière. Avec le développement de CLARITY et techniques CUBES, il est possible d'étudier ce système de fibre et de sa distribution dans la moelle épinière, ce qui est susceptible de caractéristiques inconnues des voies sérotoninergiques supraspinales révéler. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'imagerie des fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris à l'aide du CLARITY combiné et techniques CUBES. Le procédé implique la perfusion d'une souris avec une solution d'hydrogel et la clarification du tissu avec une Combination de la compensation des réactifs. le tissu de la moelle épinière a été effacé en un peu moins de deux semaines, et la coloration immunofluorescence ultérieure contre la sérotonine a été achevée en moins de dix jours. Avec un microscope à fluorescence multi-photon, le tissu a été numérisé et une image en 3D a été reconstruit en utilisant un logiciel Osirix.

Introduction

Les projections supraspinales sont responsables de la modulation de divers comportements tels que la perception de la douleur. L’une des projections porteuses d’informations nociceptives contient des fibres sérotoninergiques, qui proviennent du raphé du cerveau postérieur et des noyaux réticulaires adjacents1,2. Des études physiologiques et pharmacologiques ont démontré une libération accrue de sérotonine dans la corne dorsale de la moelle épinière après stimulation électrique des noyaux du raphé dans le cerveau postérieur3-5. Chez le rat et l’opossum, les fibres raphéspinales sérotoninergiques ont des terminaisons denses, non seulement dans la corne dorsale6-8, mais aussi dans la zone intermédiaire7,9,10, la corne ventrale7,11 et même la lame 1012,13. Il n’y a pas d’études similaires chez la souris. La présente étude visait à cartographier le schéma de terminaison des fibres sérotoninergiques provenant des noyaux du raphé du cerveau postérieur et de leurs noyaux réticulaires adjacents dans la moelle épinière de souris en utilisant la méthode CLARITY14 récemment publiée et sa modification - CUBIC15.

L’immunohistochimie conventionnelle de la moelle épinière par fluorescence ou peroxydase montre clairement la distribution des fibres sérotoninergiques dans la matière grise de la moelle épinière en coupes transversales de 30 à 40 μm d’épaisseur. Cependant, cette approche ne montre pas la continuité des faisceaux de fibres sérotoninergiques dans la substance blanche et de leurs collatéraux dans la substance grise. Bien que la reconstruction 3D des coupes histologiques ait fait progresser nos connaissances sur les faisceaux de fibres, il reste un défi pour les histologistes et les anatomistes de suivre un seul faisceau en raison de petites distorsions dans le tissu causées par la coupe. Pour contourner cet obstacle, un certain nombre de chercheurs ont mis au point divers protocoles permettant de rendre l’ensemble de la structure tissulaire transparente et de collecter une image de tissu non altéré dans un seul fichier vidéo17-21. Jusqu’à présent, la technique d’hydrogel tissulaire (CLARITY), développée par le groupe14,15 de Deisseroth, ainsi que CUBIC, développée par Susaki et al16 sont les plus réussies. Depuis la publication des protocoles, de nombreux chercheurs ont commencé à utiliser ces techniques pour étudier divers aspects des tissus biologiques, y compris, non seulement le cerveau22-25, mais aussi le cœur, les reins, l’intestin et les poumons26,27.

En fixant la moelle épinière de souris avec la solution d’hydrogel (CLARITY) et en l’éclaircissant avec les réactifs CUBIC (ce qui est une méthode beaucoup plus rapide que celle décrite par le protocole CLARITY original14,15), un bloc de tissu de la moelle épinière de 2 à 3 mm de long a été éliminé en deux semaines et la coloration par immunofluorescence pour la sérotonine s’est terminée en huit jours. Avec une simple combinaison d’agents chimiques, l’immunohistochimie conventionnelle peut être utilisée pour créer une image de faisceaux de fibres individuels dans un fichier vidéo 3D en un mois environ.

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Protocole

Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des sujets animaux suivent les directives du Comité des soins aux animaux et de l'éthique (ACEC) à l'Université de Nouvelle-Galles du Sud (le nombre AFIC approuvé est 14 / 94A).

1. Préparation du cordon spinal de souris transparent

  1. Préparation de Ice Cold Hydrogel Solution
    1. Préparation d'une solution de paraformaldéhyde à 16% (PFA)
      1. Ajouter 16 g de paraformaldéhyde poudre dans 70 ml-pré réchauffé l'eau distillée (50-55 ° C) et agiter sur un agitateur magnétique chauffé jusqu'à ce que le paraformaldéhyde est dissous. Remarque: Ne laissez pas la solution à la chaleur supérieure à 55 ° C et être conscient que paraformaldéhyde est toxique.
      2. Transférer la solution de paraformaldéhyde à un cylindre et d'ajouter de l'eau distillée jusqu'à 100 ml. Refroidir la solution de paraformaldehyde en utilisant un C réfrigérateur 4 °.
    2. Dissoudre 125 mg VA-044 initiateur dans 26,25 ml d'eau distillée et refroidir la solution dans un 4° C réfrigérateur.
    3. Laisser refroidir 5 ml de solution d'acrylamide (40%), 1,25 ml de solution de bis (2%) (ATTENTION: Bis et des solutions d'acrylamide sont toxiques, peuvent induire des anomalies génétiques ou de cancer), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% solution PFA, et solution d'initiateur VA-044 sur la glace.
    4. Mélanger les solutions ci-dessus sur la glace.
      Remarque: le volume total est de 50 ml.
  2. Perfusion et Collection de la moelle épinière de souris
    1. Anesthésier une souris avec une injection intraperitoneale de kétamine (80 mg / kg) et xyzaline (5 mg / kg) dilué dans 0,9% de solution saline normale. La posologie pour les souris peut être inférieur à celui des rats.
    2. Sur une surface plastique appropriée dans une hotte, fixer les membres de la souris à partir du corps (ruban adhésif est efficace) une fois que la souris ne répond pas à une pincée de sa peau du pied.
    3. Couper la peau de la souris sur la poitrine, puis la poitrine osseuse pour exposer le cœur avec une paire de ciseaux.
    4. En utilisant une pompe péristaltique, avec une aiguille 25 G fixée à the extrémité du tube, insérer l'aiguille dans le ventricule gauche du cœur, snip l'oreillette droite pour créer un point pour le sang de sortie et puis commencer à laver avec 40 ml de 0,9% de solution saline normale un taux d'environ 10 ml / min.
    5. Une fois terminé, perfuser la souris avec 35 ml de glace solution d'hydrogel froid.
      Remarque: perfuser à une vitesse de 10 ml / min pour éviter le gonflement du tissu nerveux.
    6. Inciser la peau sur le dos avec une lame, puis retirez les muscles à côté du vertébré. Après avoir coupé les arcs vertébraux d'un côté et en les retournant de l'autre côté, prendre la moelle épinière de la colonne vertébrale d'une amende de ciseaux.
  3. Effacement de la moelle épinière de souris
    1. Placer la moelle épinière dans 15 ml de solution d'hydrogel pendant une nuit à 4 ° C.
    2. Prélever 10 ml de la solution d'hydrogel et verser le reste de la solution avec les segments de la moelle épinière dans un tube de 5 ml. Remplir le tube 5 ml de la solution d'hydrogel jusqu'à ce qu'il soit complètement rempli.
    3. Tendez un petit morceau de parafilm sur le dessus du tube de 5 ml, puis les envelopper parafilm autour du col du tube. Remarque: Vérifiez que les contacts de parafilm la solution d'hydrogel et il n'y a pas de bulles entre la solution d'hydrogel et le parafilm.
    4. Mettre le tube de 5 ml dans un 37   Four ° C pendant une nuit. Observer la solution d'hydrogel jusqu'à ce qu'il devienne un gel.
    5. Prenez le tube de 5 ml sortie du four et retirer le gel du tube avec une clé (comme un 1 ml pointe de la pipette pelleté). Retirer le gel du tissu de la moelle épinière en collant le tissu grossier pour le gel, puis prendre le tissu grossier de suite (le gel va coller au tissu et sera donc éliminé par le tissu).
    6. Après avoir enlevé le gel du tissu de la moelle épinière, la moelle épinière laver 4 fois avec 1 x PBS (pH 7,4) pendant 24 heures sur un agitateur.
    7. Préparer la solution de compensation CUBIQUE en dissolvant 3,85 g d'urée et 3,85 g de N, N, N ', N'-tétrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine dans 5,38 ml d'eau distillée.
      Note: Un agitateur à chaud est utilisé. Ajouter 2,31 g de polyéthylène glycol éther mono-p-isooctylphényle / Triton X-100 à la solution une fois qu'il est clair et se refroidit à la température ambiante.
      Note: 10 g de ces trois produits chimiques sont pour une souris.
    8. Couper la moelle épinière de souris coronale dans 2-3 mm de long segments avec une lame de rasoir et les mettre dans 5 ml de la solution de compensation CUBIC ci-dessus. Placer sur un agitateur dans le four à 37 ° C   ° C pendant 3 jours.
    9. Trois jours plus tard, changer la solution de compensation à une nouvelle. Note: la solution ci-dessus est préparée avant utilisation.
    10. Deux à trois jours plus tard, après avoir rafraîchi la solution de compensation CUBIC, vérifier la transparence du tissu contre un papier avec les polices 8 lettres. Si elle est transparente, les lettres peuvent être vus à travers le tissu effacé. Retirer la solution de compensation et ajouter 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) pour laver le tissu 4 fois par jour (toutes les 6 heures).

2. immunofluorescence

  1. Incuber les segments de la moelle épinière dans la solution d'anticorps primaire (anti-sérotonine, élevé chez le lapin, dilué à 1: 100 dans PBST) pendant 3 jours sur un agitateur dans un four à 37 °.
  2. Enlever la solution d'anticorps et ajoute 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) pour laver les segments de la moelle épinière 4 fois par jour (toutes les 6 heures) dans un four à 37 ° C.
  3. Retirer la solution de PBST et on ajoute la solution d'anticorps secondaire (chèvre conjugué 594 IgG anti-lapin, dilué à 1: 100 dans PBST) à incuber le tissu pendant 3 jours sur un agitateur dans un four à 37 °.
  4. On élimine la solution d'anticorps secondaire et ajoute 4 ml de PBST pour laver les segments de la moelle épinière 4 fois par jour (toutes les 6 heures) sur un agitateur dans un four à 37 °. Le lendemain, le tissu est prêt pour l'imagerie.

3. Imaging

  1. Enlever la solution PBST et on ajoute 4 ml de 85% de glycerol pour rendre l'indice de réfraction du tissu même.
  2. Vérifier la clarté du tissu. Une fois qu'il est clair dans environ 1 h, mettre le tissu sur une grande mince lame, de verre qui convient le cadre de maintien de la multi-photo microscope à fluorescence.
  3. Mettre quelques gouttes de 85% de glycerol à côté du tissu de la moelle épinière et Coverslip avec une lamelle en verre de 22 x 50 mm 2.
    Remarque: L'orientation de la moelle épinière décide comment l'image ressemble.
  4. Mettez la lame de verre sur le cadre de maintien de la multi-photons microscope à fluorescence et déplacer le tissu dans la voie de la lumière.
  5. Choisissez Helium Neon ligne laser 594 nm et d'ajuster l'intensité du laser au niveau optimal en vérifiant la luminosité du signal positif dans l'image en direct.
  6. Sélectionnez la zone de balayage du tissu de la moelle épinière en utilisant l'objectif 20X (dans l'eau, NA 0,7) et se préparer à créer un z-stack, et la profondeur de chaque étape fixé à 3 pm.
  7. Balayer le tissu à partir du haut vers le bas de la pile z 20X sous la objective puis objectif 63X (dans l'huile, 1,4 NA) (taille de l'étape 1 a été um), respectivement. Reconstruire vidéos 3D à l' aide d' un logiciel 3D 28.

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Résultats

Cette section présente les résultats de l'anticorps de la sérotonine coloration dans la moelle épinière de souris transparent en utilisant une combinaison des CLARITY et protocoles CUBES. Nous montrons que les fibres sérotoninergiques sont présentes dans toutes les strates de la moelle épinière avec une prédominance dans la partie ventrale de la corne ventrale (figure 1, vous pouvez aussi consulter la vidéo 1). Le contrôle de tissu n'a pas eu de ...

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Discussion

Le protocole décrit montre comment l'image des fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris avec le CLARITY combinés et techniques CUBES. Elle introduit un processus de compensation plus rapide par rapport au protocole de compensation passive développée par Cheung et al. 14 et Tomer et al. 15 et permet le tissu de la moelle épinière à être bien pris en charge par l'hydrogel lors de la compensation.

Une étape importante lors de la ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Centre d’excellence du Conseil australien de la recherche pour la fonction cérébrale intégrative (ARC Centre Grant CE140100007), une subvention de projet NHMRC (#1086643). Le professeur George Paxinos est soutenu par une subvention Senior Principal Research Fellow NHMRC (#1043626).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Photoinitiateur VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
solution d’acrylamide à 40 %Bio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
solution à 2 % BisBio Rad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldéhydeSigma158127http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
uréeMerck Millipore66612http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N',N'-tétrakis (2-hydroxypropyl) éthylènediamineMerck Millipore821940http ://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tétra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100Merck Millipore648462http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
saccharoseSigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
anti-sérotonineMerck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
chèvre anti lapin IgG (H+L) Anticorps secondaire, Alexa Fluor® ; 594 conjuguéLife Technologies  ; A-11012https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
microscope multiphotonsLeicaLeica TCS SP5 MP STEDhttp://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/
anticorps

Références

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