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Article de méthode

Magnétique alternatif microgels de gélatine hybride sensible au champ de libération contrôlée de médicaments

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DOI :

10.3791/53680

⸱

13 février 2016

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1Department of Biological Sciences, Kent State University, 2Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Chemical Physics Interdisciplinary Program, Kent State University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une méthode facile à fabriquer une plate-forme de libération de médicament à base de gélatine biodégradable qui est magnéto-sensible à la chaleur. Ceci a été réalisé en incorporant des nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer et de poly (co-isopropylacrylamide- acrylamide N) au sein d'un réseau de micro-sphérique de gélatine réticulée par la génipine, en conjonction avec un système alternatif de l'application du champ magnétique.

Résumé

Magnétiquement sensibles nano / micro-ingénierie des biomatériaux qui permettent, d'une livraison étroitement contrôlé sur la demande de drogues ont été mis au point de nouveaux types de dispositifs intelligents souples pour des applications biomédicales. Bien qu'un certain nombre de systèmes d'administration de médicaments à réponse magnétique ont démontré des efficacités à travers soit la preuve in vitro des études de concept ou dans des applications précliniques in vivo, leur utilisation dans les milieux cliniques est encore limitée par leur biocompatibilité ou biodégradabilité insuffisante. En outre, la plupart des plates-formes existantes reposent sur des techniques sophistiquées pour leurs fabrications. Nous avons récemment démontré la fabrication de biodégradable, thermo-sensible microgel à base de gélatine en piégeant physiquement poly (acrylamide N-co isopropylacrylamide-) des chaînes en tant que composant mineur dans un réseau de gélatine à trois dimensions. Dans cette étude, nous présentons une méthode facile à fabriquer une plateforme de libération de médicament biodégradable qui permet à un magnéto-thermally déclenché la libération du médicament. Ceci a été réalisé en incorporant des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétique et les polymères sensibles à la chaleur à l'intérieur de microgels colloïdales à base de gélatine, en conjonction avec un système alternatif de l'application du champ magnétique.

Introduction

Stimuli-sensibles des systèmes d'administration de médicaments qui permettent une administration de médicaments étroitement contrôlé en réponse à des stimuli soit endogènes ou exogènes (par exemple., De température ou de pH) ont été largement étudiés comme de nouveaux types de dispositifs intelligents douces pour la délivrance de médicaments. Hydrogels micrométriques ont été largement utilisé comme une plate-forme de distribution de médicaments en ce sens qu'ils confèrent des profils de libération de médicament contrôlables et durables ainsi que des produits chimiques accordable et des propriétés mécaniques 1-3. En particulier, les microgels colloïdales présentent de nombreux avantages comme un véhicule pour l'administration de médicaments en raison de leur réactivité rapide aux stimuli externes et injectabilité adapté au tissu locale d'une manière minimalement invasive 4. Le poly (N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) ou ses copolymères ont été largement adoptés dans la synthèse de microgels sensibles à la chaleur par greffage pNIPAM avec des polymères biodégradables biocompatibles / y compris la gélatine, le chitosane, l'acide alginate, ou l'acide hyaluronique 5,6Dans lequel une caractéristique de transition de phase de pNIPAM à sa température de solution critique inférieure (LCST) peut être utilisé comme un déclencheur de libération du médicament 7. Nous avons récemment démontré une fabrication de biodégradable, thermo-sensibles microgel à base de gélatine en incorporant poly (co N-isopropylacrylamide- acrylamide) [p (NIPAM- co -AAm)] chaînes comme un composant mineur au sein des réseaux de gélatine en trois dimensions 8. La gélatine / p (NIPAM- co -AAm) microgel présentait un dégonflement accordable à l'augmentation de la température, qui corrélée positivement à la libération de la sérum albumine bovine (BSA).

Au cours des dernières années, il a augmenté les efforts pour développer une plate-forme de distribution de médicaments magnétiquement sensible qui peut déclencher la libération du médicament dans un 9,10 de la mode à la demande. Le principe de base pour la synthèse de magnétiquement sensible plate-forme de délivrance de médicament utilise la caractéristique de nanoparticules superparamagnétiques (MNP) pour générer de la chaleur quand ils reçoivent une fréquence élevée champ magnétique alternatif (AMF), qui déclenche une libération du médicament sensible à la température. Cela est prometteur pour des applications cliniques futures que ce système peut cibler profondément dans les tissus, permet une libération du médicament non invasive et contrôlé à distance et peut être combiné avec le traitement de l'hyperthermie et la résonance magnétique système d'imagerie 10-12. Ces plates-formes suivantes: (1) des particules MNP / pNIPAM hybride de microgel 13-15 et (2) les échafaudages d'hydrogel macroscopiques incorporant immobilisés MNP 16-18. Les plates-formes de microgel à base de pNIPAM finement démontré une réactivité accordable transition de phase de volume à des stimuli magnéto-thermique. Cependant, ils comptent encore sur des techniques complexes et sophistiqués dans la fabrication et l'utilisation de polymères pNIPAM à haute teneur peut être potentiellement cytotoxiques aux cellules 19, ce qui peut limiter leurs applications in vivo. Les échafaudages macroscopiques présentent un rapportly réponse lente aux stimuli externes et nécessitent une transplantation chirurgicale invasive par rapport à microgels colloïdales.

La mise en émulsion eau-dans-huile a été la méthode standard pour produire submillimétrique ou de gel de micromètre particules de taille 20. À l'interface eau-huile de l'émulsion, de particules de microgel forme une forme sphérique en raison de la minimisation de l'énergie de surface de la goutte d'eau sous une force de cisaillement mécanique. Ce procédé permet la production d'une grande quantité de gouttelettes de gel aqueux sphériques dans un procédé de fabrication simple et a été adoptée avec succès pour la fabrication de microgels à base de gélatine pour des applications d'administration de médicaments 21-23.

Ici, nous présentons une méthode facile à synthétiser un magnetothermally sensibles microgels à base de gélatine pour l'application d'administration de médicament en utilisant le procédé d'émulsification eau dans l'huile. On y est parvenu en incorporant physiquement MNP d'oxyde de fer et p (co NIPAM- -AAM) chaînes comme un élément mineur dans un réseau de gélatine micro-sphérique qui est réticulé de manière covalente par un genipin de réticulation d'origine naturelle, en conjonction avec un alternatif à haute fréquence de champ magnétique (AMF) système d'application.

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Protocole

Remarque: L'ensemble du processus de fabrication magnétiques microgels de gélatine terrain sensible est illustrée à la figure 1A.

1. préparer des solutions et suspensions

  1. Préparer un génipine de réticulation (1% p / v) une solution en dissolvant 20 mg de génipine dans 2 ml de tampon phosphate salin (PBS 1x, pH 7,4). Vortex la solution et placer dans un bain d'eau à 50 o C pendant 2 heures pour dissoudre complètement la solution.
  2. Préparer une solution d'agent tensio-actif en dissolvant 20 mg de poly (éthylène glycol) -poly (propylèneglycol) -poly (éthylène glycol) (Mw = 2900 Da, dénommé L64) dans 200 ml de PBS pour être à la concentration de 100 ppm.
  3. Préparer un 15% (p / v) d'une solution de gélatine en dissolvant 64,5 mg de gélatine dans 0,43 ml de PBS. Vortex la solution et le placer dans un bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce qu'il atteigne une phase de sol, où la solution devient fluide. Ensuite, vortex de la solution de gélatine à 2 - 3 fois pour assurer èmee l'homogénéité de l'échantillon.
  4. Préparation de p (NIPAM- co -AAm) Solution / MNP avec un médicament modèle (BSA):
    1. 10,75 mg de disperser hydrophile MNP dans 0,43 ml de PBS, puis dissoudre 12,9 mg de p (NIPAM- co -AAm) MNP dans la suspension pour obtenir une concentration de 3% (p / v). La concentration accrue de p (NIPAM- co -AAm) peut être utilisée pour obtenir un comportement d'augmentation de dégonflement de microgels.
    2. Utilisez albumine conjuguée Texas-Rouge de sérum bovin (TR-BSA; M w ~ 66 kDa) comme médicament modèle. Dissoudre 0,5 mg de TR-BSA dans le mélange de p (NIPAM- co -AAm) / MNP.
  5. Préparer des mélanges de gélatine / p (NIPAM- co -AAm) / MNP solution / BSA (0,86 ml) par addition de mélange de p (NIPAM- co -AAm) / MNP (0,43 ml) dans la solution de gélatine (0,43 ml), puis soigneusement les vortex pour faire un mélange homogène. Ainsi, les concentrations de polymères et MNP deviennent moitié de la concentration initiale dans le mélange final.

2. émulsification

  1. Verser 15 ml d'huile de silicone [polydiméthylsiloxane (viscosité 350 cSt)] dans un bêcher propre et stérile.
  2. Ajouter immédiatement les mélanges aqueux préparés à l'avance de la gélatine / p (NIPAM- co -AAm) / MNP solution / BSA (0,86 ml) dans de l'huile de silicone et émulsifier le mélange aqueux dans la phase huileuse en agitant avec un barreau d'agitation magnétique à 900 rpm à 30 ° C pendant 30 min.

3. La gélification et du transfert des micro-gouttelettes à une solution aqueuse

  1. Transférer l'émulsion (~ 16 ml) à partir bêcher dans un tube de 50 ml.
  2. Refroidir le tube pendant 10 min à 4 ° C pendant la gélification des micro-gouttelettes dans l'huile.
  3. Remplir le tube avec la solution L64 préparé (à 4 ° C) jusqu'à 50 ml et agiter vigoureusement le tube. Il peut être possible qu 'une partie des tensioactifs L64 serait dans les microgels.
  4. Centrifuger le tube pendant 20 min à 2300 g à 4 o C.
  5. Regularly vérifier la présence de la pastille de particules de gel sur le côté du tube. Si les particules ne sont pas visibles, centrifuger pendant 20 minutes à la même vitesse et la température. Passez à retirer soigneusement surnageant sans perturber le culot formé sur la paroi intérieure du tube.
  6. Répétez les étapes (3.3) à (3.5) une fois de plus. Chaque fois, le transfert de l'échantillon dans un nouveau tube pour éviter l'inclusion de toutes les gouttelettes d'huile dans la suspension de microgel. Après cette étape, faire en sorte que des tensioactifs ou des gouttelettes d'huile ne sont pas présents dans la suspension de l'échantillon. Toutefois, les étapes répétées de séparation peuvent conduire à la perte de matières premières.

4. réticulation covalente des microgels

  1. Ajouter 2 ml de solution de genipin (préparé dans la section 1) au culot de particules de gel et bien mélanger au vortex la solution.
  2. Transférer rapidement le tube de la suspension dans un bain d'eau à 23 o C pour initier une réaction de réticulation covalente au cours d'une des(. par exemple, de 5 à 120 min) Temps de réticulation IRED.
  3. Après réticulation, immédiatement supprimer tous les agents de réticulation excessives en rejetant la solution de genipin, remise en suspension des microgels dans du PBS et centrifugation du tube pendant 20 min à 2300 x g (4 ° C). Si nécessaire, prudemment briser formé culot avec une pipette. Cette étape de lavage peut être répété jusqu'à 3 fois si le genipin est en restant dans la solution.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les microgels dans du PBS à une densité désirée (par ex., 5 × 10 6 microgels / ml) en comptant le nombre d'un hémocytomètre.
  5. Pour les observations microscopiques, charger la suspension de microgel dans l'espace entre une lame de verre et d'une lamelle et sceller la frontière de la lamelle avec de la résine époxy.

5. Application du champ magnétique alternatif pour le déclenchement de distribution de médicaments

  1. Placer le tube avec la concentration souhaitée de microgels dans des milieux aqueux dansla chambre de bobines magnétiques. Si nécessaire, insérer une sonde de température à fibre optique dans le tube pour surveiller les changements de température des médias au cours de l'application de l'AMF.
  2. Appliquer à haute fréquence (> 100 kHz) AMF à une intensité de champ défini (> 5 kA / m) et pour une durée déterminée. Suite à l'application de l'AMF, centrifugeuse le tube d'échantillon pendant 20 min à 2273 x g (4 ° C) et de recueillir le surnageant de quantifier la quantité de TR-BSA libérée de microgel aux milieux environnants par spectrophotométrie. Les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission pour le rouge Texas sont 584 nm et 612 nm, respectivement.

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Résultats

Lorsque le protocole est effectuée correctement, les microgels fabriqués doivent présenter une morphologie sphérique et bien caractérisé de dispersion colloïdale ayant un diamètre compris dans l'intervalle de 5 um à 20 um (figure 1B et C). Soit MNP fluorescents ou BSA fluorescente peut être utilisé pour confirmer si MNP ou de drogues (BSA dans cette étude) sont bien encapsulées dans le microgel (figure 1D). Les microgels fabriqués peuvent être stable...

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Discussion

La technologie décrite ici démontre une preuve de concept sur l'utilisation d'hybrides nanoparticules microgel pour la libération du médicament magnéto-thermique déclenchée. Ceci a été réalisé en piégeant physiquement MNP et P (NIPAM- co -AAm) des chaînes au sein d'un réseau tridimensionnel gélatine réticulée par micro-génipine. La plate-forme sensible au champ magnétique est suffisante pour générer de la chaleur dans le microgel en réponse à une AMF appliquée à distance, qui à son tour déclenche la...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le Prix Innovation de la famille Farris et NIH 1R01NR015674-01 à MK. Les auteurs remercient Josep Nayfach (Qteris, Inc) pour fournir un système de générateur électromagnétique ainsi que son consultation technique. Les auteurs remercient également Huan Yan (Programme interdisciplinaire Physique LCI & Chemical, Kent State University) pour ses assistants techniques.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GélatineSigma-Aldrich, MO, USAG2500Gélatine de type A, peau porcine
poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)  ;Sigma-Aldrich, MO, États-Unis738727MW = 20 000, LCST = 34 - 38 ° ; C
Huilede silicone Sigma-Aldrich, MO, États-Unis378372Viscosité 350 cSt
Pluoronic L64Sigma-Aldrich, MO, États-Unis435449poly(éthylène glycol)-block-poly(propylène glycol)-block-poly(éthylène glycol)
génipinTimTec LLC, DE, ÉTATS-UNISST080860 MW = 226.23
Nanoparticules magnétiques (MNP)Micromod Inc, Allemagne79-00-102nanomag-D-spio, 100 nm
TR-BSALife Technologies, NY USAA23017Albumine de sérum bovin (BSA), Texas Red conjugué

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