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Synthèse de Cd sans InP / ZnS Quantum Dots Convient pour des applications biomédicales

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DOI :

10.3791/53684

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6 février 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Missouri State University, 2Center for Molecular Microscopy, Leidos Biomedical Research, Inc., Frederick National Laboratory for Cancer Research

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Résumé

Dans ce protocole, la synthèse de points quantiques InP/ZnS (QD) sans Cd est détaillée. Les QD à base d’InP gagnent en popularité en raison de la toxicité des ions Cd2+ qui peuvent être libérés par la dégradation des nanoparticules. Après synthèse, les QD sont solubilisés dans l’eau à l’aide d’un polymère amphiphile pour une utilisation dans des applications biomédicales.

Résumé

Les nanocristaux fluorescents, en particulier les points quantiques, ont été un outil utile pour de nombreuses applications biomédicales. Pour une utilisation réussie dans les systèmes biologiques, les points quantiques doivent être hautement fluorescents et de petite taille/monodisperse. Bien que les points quantiques à base de cadmium couramment utilisés possèdent ces qualités, ils sont potentiellement toxiques en raison de la libération possible d’ions Cd2+ par la dégradation des nanoparticules. Les points quantiques à base d’indium, en particulier InP/ZnS, ont récemment été explorés comme une alternative viable aux points quantiques à base de cadmium en raison de leurs caractéristiques de fluorescence et de leur taille relativement similaires. La synthèse présentée ici utilise des techniques standard d’injection à chaud pour une croissance efficace des nanoparticules ; Cependant, les propriétés des nanoparticules telles que la taille, la longueur d’onde d’émission et l’intensité d’émission peuvent changer radicalement en raison de petits changements dans les conditions de réaction. Par conséquent, les conditions de réaction telles que la température, la durée de la réaction et la concentration des précurseurs doivent être maintenues avec précision pour produire des produits reproductibles. Étant donné que les points quantiques ne sont pas intrinsèquement solubles dans les solutions aqueuses, ils doivent également subir une modification de surface pour conférer une solubilité dans l’eau. Dans ce protocole, un polymère amphiphile est utilisé pour interagir avec les ligands hydrophobes à la surface des points quantiques et les molécules d’eau solvante en vrac. Ici, un protocole détaillé est fourni pour la synthèse de points quantiques InP/ZnS hautement fluorescents qui conviennent à une utilisation dans des applications biomédicales.

Introduction

Points quantiques (PQ) sont semi-conducteur des nanocristaux fluorescents qui présentent des propriétés lorsqu'il est irradié par la lumière 1. En raison de leur petite taille (2-5 nm), ce qui est similaire à de nombreuses biomolécules plus grandes, et la facilité d'biofonctionnalisation, QDs sont un outil extrêmement intéressant pour les applications biomédicales. Ils ont trouvé une utilisation dans l'étiquetage biologique, une seule molécule imagerie des cellules vivantes, l'administration de médicaments, l'imagerie in vivo, la détection de pathogènes, et le suivi de la cellule, parmi beaucoup d'autres utilisations 2-8.

QDs sur CD ont été le plus souvent utilisé dans des applications biomédicales en raison de leur fluorescence intense et largeurs de pic d'émission étroites 9. Toutefois, des préoccupations ont été soulevées en raison de la toxicité potentielle de Cd 2+ 10 qui peut être libérée par la dégradation de la nanoparticule. Récemment, des points quantiques à base de InP ont été explorés en tant qu'alternative à boîtes quantiques à base de Cd, car ils conservent de nombreuses caractéristiques de fluorescencedes Cd-base QDs et peut-être plus biocompatible 11. QDs sur CD ont été trouvés à être beaucoup plus toxiques que les points quantiques à base de InP dans des essais in vitro à des concentrations aussi faibles que 22 heures, après seulement 48 h 11.

La couleur d'émission de fluorescence QDs est taille-réglable 1. Autrement dit, comme la taille des QD augmente, l'émission de fluorescence est décalée vers le rouge. La taille et la dispersité de taille des produits QD peut être modifiée en changeant la température, la durée de réaction, ou dans des conditions de concentration précurseurs pendant la réaction 12. Alors que le pic d'émission de InP QDs est généralement plus large et moins intense que les points quantiques à base de Cd, InP QDs peut être fait dans une grande variété de couleurs conçus pour éviter tout chevauchement spectral, et sont suffisamment intense pour la plupart des applications biomédicales 12. La synthèse détaillée dans ce protocole donne QDs avec un pic d'émission rouge centrée à 600 nm.

Plusieurs mesures sont prises afsynthèse ter des noyaux de QD pour maintenir l'intégrité optique des points quantiques et les rendre compatibles pour des applications biologiques. La surface du noyau de QD doit être protégée contre les défauts d'oxydation ou de surface qui peuvent causer une trempe; par conséquent, une coquille ZnS est appliquée sur le noyau pour produire InP / ZnS (core / shell) QDS 13. Ce revêtement a été montré pour protéger la photoluminescence du produit une fois par jour. La présence d'ions de zinc pendant la synthèse InP QD a été montré pour limiter les défauts de surface, ainsi que la distribution de taille de 12 diminution. Même en présence de Zn2 + dans le milieu réactionnel, la synthèse de InZnP sont 12 hautement improbable. Après revêtement, résultant QDs InP / ZnS sont enrobés dans des ligands hydrophobes tels que l'oxyde de trioctylphosphine (TOPO) ou l'oléylamine 12,14. Un polymère amphiphile peut interagir avec des ligands hydrophobes sur la surface de QD ainsi que des molécules d'eau en vrac pour conférer une solubilité dans l'eau 15. Les polymères amphiphiles avec carboxylate groupes chimiques peuvent être utilisés comme des «poignées chimiques" pour fonctionnaliser davantage les boîtes quantiques.

Ce protocole détaille la synthèse et la fonctionnalisation de hydrosolubles InP / ZnS QDs très intense émission de fluorescence et de la taille relativement petite-dispersité. Ces boîtes quantiques sont potentiellement moins toxiques que couramment utilisés QDs CdSe / ZnS. Ici, la synthèse de InP / ZnS QDs offre une alternative pratique à boîtes quantiques à base de Cd pour des applications biomédicales.

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Protocole

1. Synthèse de phosphure d'indium / sulfure de zinc (InP / ZnS) Quantum Dots

  1. Synthèse de phosphure d'indium (InP) Quantum Dot Cores
    1. Monter un fond de 100 ml rond, à 3 cols, ballon d'un condenseur de 12 pouces. Ajouter 30 ml oléylamine (LLO), 0,398 g d'indium (III) chlorure (y compris 3), 0,245 g de zinc (II) chlorure (ZnCl2) et agiter tout en évacuant à la température ambiante en utilisant un vide pendant 1 heure. La solution doit être incolore avec un précipité blanc.
    2. Utilisation d'une enveloppe chauffante et d'un thermocouple proportionnel-intégral-dérivé (PID) régulateur de température, d'augmenter la température de la solution à 120 ° C. Évacuer la solution sous vide pendant 20 minutes pour éliminer les impuretés de bas point d'ébullition qui peuvent influer sur la croissance de base.
      Remarque: Bien qu'il soit possible d'utiliser un bain de sable et d'un thermomètre, à l'aide d'une enveloppe chauffante et PID augmente l'uniformité et la reproductibilité des produits de réaction.
    3. Sous gaz inerte (par exemple,, N 2), le reflux de la solution et d'augmenter la température à 220 ° C pendant 15 min. Le InCl3 et ZnCl2 dissoudre complètement, résultant en une solution jaune pâle. Laisser la température se stabiliser pendant 10 min.
    4. Purger un jetable, 3 ml seringue en plastique et 4 pouces, 22 aiguille G avec de l'azote gazeux. Utilisation de la seringue, de livrer rapidement 0,5 ml de tris (diméthylamino) phosphine (TDMAP) à la solution InCl 3. La température de la solution diminue légèrement et revient à 220 ° C. La solution passe d'transparent, jaune pâle à l'opaque, noir.
    5. Après 9,5 min, enlever le ballon de réaction du manteau de chauffage jusqu'à ce que la température descend en dessous de 200 ° C. Pour protéger l'intégrité des noyaux InP, passez directement à la couche ZnS à l'étape 1.2.1.
  2. Synthèse du sulfure de zinc (ZnS coquillages) Quantum Dot
    1. Placer le ballon réactionnel de l'étape 1.1.5 sur une enveloppe chauffante et de stabiliser le temperature à 200 ° C. Ajouter lentement 3,58 g dodécanethiol (DDT) au cours de 15 sec à la solution contenant InP QDs. Laisser la solution réagir pendant 1 heure.
      Remarque: épaisseur de coquille de ZnS peut être modifiée en augmentant ou en diminuant la quantité de stéarate de zinc ajouté à l'étape 1.2.4. Modifier la quantité de ZnCl 2 ou dodécanethiol dans les étapes 1.1.1 et 1.2.1 peut avoir un impact significatif de la qualité de points quantiques en modifiant la cinétique de réaction.
      1. Par la suite, retirer le récipient de réaction de l'enveloppe chauffante et laisser la solution refroidir à environ 60 ° C.
    2. Une fois la solution InP / ZnS atteint ~ 60 ° C, ajouter 10 ml d'hexanes et de transférer la totalité de la solution d'environ 45 ml dans un tube à centrifuger de 50 ml en polypropylene. Centrifuger l'échantillon (3000 xg pendant 10 min) pour éliminer les précurseurs solides ayant pas réagi.
    3. Soigneusement transférer le surnageant dans un 250 ml polypropylène centrifugeuse bouteille, ajouter 200 ml d'acétone, et centrifuger la solution (3000 xg pendant 10 minutes) pour précipiter les points quantiques InP / ZnS. Ce volume peut également être réparti de manière égale en quatre tubes de 50 ml pour centrifugation si une centrifugeuse avec le rotor / accessoires nécessaires ne sont pas disponibles. Décanter le surnageant et le culot sécher QD soigneusement avec de l'azote gazeux pour éliminer l'acétone.
    4. Remettre en suspension les points quantiques dans 20 ml LLO utilisant ultrasons, transférer à un fond 50 ml rond, à 3 cols, flacon contenant 0,474 g de stéarate de zinc, et remuer. Évacuer la solution sous vide pendant 20 min à température ambiante.
    5. Sous atmosphère d'azote, d'augmenter la température jusqu'à 180 ° C et laisser la réaction se dérouler pendant 3 h. Bien qu'il n'y ait pas de changements visuels visibles à la solution de réaction qui se produisent au cours de cette réaction, ajoutant stéarate de zinc augmente l'épaisseur de la coquille ZnS, augmentant ainsi QY en améliorant passivation de surface des points quantiques 12.. Une fois que la réaction est terminée, enlever le ballon de l'enveloppe de chauffage et laisser la solution refroidir à environ 60 ° C.
    6. Une fois les soluti InP / ZnSsur atteint ~ 60 ° C, ajouter 20 ml d'hexanes et transférer dans un tube à centrifuger de 50 ml en polypropylene. Centrifuger l'échantillon (3000 xg pendant 10 min) pour éliminer le stéarate de zinc qui n'a pas réagi.
    7. Soigneusement transférer le surnageant dans un flacon de centrifugation de 250 ml en polypropylène, ajouter 200 ml d'acétone, et centrifuger la solution (3000 g pendant 10 min) pour précipiter InP / ZnS QDs. Décanter avec soin le surnageant et sécher soigneusement avec de l'azote pour éliminer l'acétone.
    8. Dissoudre le culot InP / ZnS QD dans 30 ml d'hexane. Vortex et de traitement par ultrasons la solution brièvement pour assurer une dispersion complète.
    9. Répétez les étapes de purification 1.2.6-1.2.8 plus de deux fois pour assurer l'élimination complète des ligands organiques en excès. Les interactions entre le polymère amphiphile et la DQ à l'étape 1.2 peut être compromise en présence de ligands en excès.
    10. Avec des calculs détaillés par Xie, et al. 16, déterminer la taille et la concentration des points quantiques InP / ZnS synthétisés en utilisant la spectroscopie UV-Vis.
      Remarque: La caractéristique spectrale importante pour cette analyse est l'épaulement du pic d'absorption. La valeur de longueur d'onde et l'absorbance de la valeur maximale de cet épaulement est utilisé pour calculer la taille et la concentration des points quantiques, respectivement. Cette réaction donne typiquement d'environ 5 pmol de points quantiques ayant un pic d'émission à 600 nm. Pour synthétiser les points quantiques de couleurs différentes, la durée et / ou la température de la réaction peut être changé. Un temps de réaction plus long et / ou à une température plus élevée de la solution conduit à un pic d'émission décalés vers le rouge. Par exemple, en augmentant la température de réaction à 240 ° C et le maintien d'un temps de réaction de 10 min donnera lieu à points quantiques avec un pic de 680 nm au maximum d'émission. De même, la réduction du temps de réaction de 2 min et en doublant le chlorure de zinc utilisée se traduira par points quantiques avec une nm crête maximale d'émission de 470. Ces QDs InP / ZnS sont stables pendant au moins un mois à 4 ° C dans l'obscurité sous gaz inerte.

2. L'eauSolubilisation de InP / ZnS Quantum Dots l'aide d'un polymère amphiphile

  1. La solubilisation de l'eau
    1. En utilisant les points quantiques InP / ZnS de l'étape 1.2.10, diluer une partie des boîtes quantiques avec de l'hexane pour obtenir 1 ml de 1 pm QDs.
      1. Dans un tube de centrifugation, transférer 0,25 ml InP / ZnS QDs dans chaque tube. Ajouter 1 ml d'acétone ou de méthanol dans le tube de centrifugeuse et la centrifugeuse (3000 xg pendant 10 min). Retirez délicatement le surnageant et dissoudre chaque précipité dans 1 ml de tétrahydrofuranne (THF).
      2. Transférer les points quantiques InP / ZnS dissous dans le THF dans 100 ml de ballon à fond rond et diluer avec 16 ml de THF. Pour réduire le nombre d'agrégats en solution, sonication les QDs pendant 5-10 min.
    2. Dissoudre 30 mg de poly (maléique alt andhydride- -1-octadécène), 3- (diméthylamino) -1-propylamine (pMAL-d) dans 10 ml d'eau moléculaire de qualité. traitement aux ultrasons à bain d'eau ou une agitation douce jusqu'à ce que la solution est translucide est suffisante pour dissoudre complètement le polymère. leutilisation de vortex ou agitation vigoureuse peut produire beaucoup de bulles, ce qui entrave l'interaction du polymère avec le QD. Ajouter la solution de polymère de 10 ml à 100 ml ballon à fond rond contenant InP / ZnS points quantiques dans le THF.
    3. Évaporer le THF de la solution QD / polymère en utilisant un évaporateur rotatif. Placer la fiole dans un bain de glace tandis qu'on évapore pour faciliter l'interaction entre le polymère et QD. Selon la force du vide, la plupart du THF est évaporé après 10 min et la solution trouble apparaît.
      1. Une fois que la solution est évaporée à 10 ml, enlever le ballon de l'évaporateur rotatif et ajouter 30 ml d'eau moléculaire de qualité. Retour le ballon à l'évaporateur rotatif et continuer à évaporer à 2 ml. Cette étape d'évaporation finale peut prendre plusieurs heures; assurer le bain de glace est maintenue.
    4. Retirer les boîtes quantiques InP / ZnS solubles dans l'eau à partir du ballon à fond rond avec une pipette. Filtrer la solution QD utilisant une seringue en plastique de 3 ml attaché à un nylon sy 0,1 umfiltrer dans un tube de centrifugeuse de 5 ml ringe.
    5. Placez les boîtes quantiques dans une unité de dialyse à membrane 20.000 MWCO et dialyser contre 0,05 M tampon borate pH 8,5 pour éliminer les excès de polymère. (Ajouter lentement le tétraborate de sodium 0,05 M décahydraté à 0,05 M d'acide borique, en agitant vigoureusement, jusqu'à ce que le pH est de 8,5 à rendre cette solution de tampon borate.) En utilisant un concentrateur sous vide, on concentre les points quantiques dans un tampon borate à 1 ml.
    6. Pour le stockage, la solution de purge avec de l'azote avant de sceller avec du Parafilm. Les boîtes quantiques InP / ZnS solubles dans l'eau sont stables pendant au moins 4 mois à 4 ° C dans l'obscurité.

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Résultats

Les noyaux InP non couchés ne démontrent pas de fluorescence visible et substantielle à l'œil nu. Cependant, InP / ZnS (core / shell) points quantiques apparaissent fluorescence brillamment à l'oeil sous irradiation UV. La fluorescence de InP / ZnS QDs a été caractérisé par spectroscopie de fluorescence. Le spectre de fluorescence des points quantiques dans l'hexane (figure 1) est excité à 533 nm montre un pic majeur centré à 600 nm avec une largeur à mi-haut...

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Discussion

Ce protocole détaille la synthèse de très fluorescentes QDs InP / ZnS qui peuvent être utilisés dans de nombreux systèmes biologiques. Les produits synthétisés QD ici présentaient un pic unique d'émission de fluorescence centré à 600 nm avec une FWHM de 73 nm (Figure 1), ce qui est comparable à d'autres synthèses décrites précédemment 12. Le temps de réaction et la température de réaction sont des étapes très importants en raison de leur effet profond sur la qualité de la synthèse des...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient le Département de chimie et le Collège d'études supérieures à l'Université de l'état du Missouri pour leur soutien à ce projet. Nous reconnaissons également le Laboratoire de microscopie électronique au Laboratoire national Frederick for Cancer Research pour l'utilisation de leur microscope électronique à transmission et grilles revêtues de carbone.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
OleylamineAcros129540010
Chlorure de zinc(II)Sigma030-003-00-2
Chlorure d’indium(III)Chem-Impex24560
Tris(diméthylamino)phosphineEncompass50-901-10500
1-dodécanéthiolAcros117625000
HexanesFisher SciH292-4
AcétoneTransChemicalUN 1090
Stéaratede zinc Aldrich Chem307564-1KG
TétrahydrofuraneAcros34845-0010
Eau moléculaireFisher SciBP2470-1
Poly(maleic anhyrdride-alt-1-tétradécène), 3-(diméthylamino)-1-propylamine dérivéSigma90771-1G
Acide boriqueFisher SciBP168-500
Tétraborate de sodium décahydratéFisher SciBP175-500
Rhodamine BAldrich ChemR95-3
Azotegazeux AirgasUN1066
Bleu trypanThermo SciSV30084.01
Seringue Luer-lock en plastique de 3 mlBD309657
Luer-lock NeedleAir-Tite83000144714 pouces, calibre 22
50 ml tube à centrifuger en polypropyèneFalcon352098
flacon à centrifuger 250 mlThermo Sci05-562-23Nalgene PPCO
5 ml tubes à centrifugerArgos-TechT2076
1,5 ml tubes à centrifugerBio Plas4150
0,1 &mu ; m Filtre à seringueWhatman6786-1301Puradisc Filtre en nylon 13 mm
Slide-A-Lyzer MINI Unité de dialyseThermo Sci6959020 000 MWCO
Évaporateur rotatifHeidolph
Centrifuge 5072EppendorfGodet oscillant avec 50  ; ml Adaptateur de tube
Spectromètre UV/VIS Lambda 650 Spectromètre UV-VISPerkin ElmerSpectrophotomètre LS
55 Spectromètre de fluorescencePerkin ElmerFluorimètre
Axio Observer.A1Microscope à épifluorescenceZeiss
AxioCam MRmCaméra CCDZeiss
Tecnai TF20 MicroscopeFEITransmisison Electron Miscroscope
TEM Eagle CCDFEITEM CCD NanoBrook
Omni DLSBrookhavenInstrument de diffusion dynamique de la lumière

Références

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications
Posted by JoVE Editors on 2/29/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications. There was an error with an author's given name. The author's name was corrected to:

Katye M. Fichter

from:

Kathryn M. Fichter

Mots-clés

Synth se de points quantiquestechnique d injection chaudmodification de surfacesolubilit aqueusespectroscopie UV visiblemicroscopie lectronique transmissionessai de viabilit cellulairespectroscopie de fluorescence

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