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Article de méthode

Isolement de CD 90+ fibroblastes / myofibroblastes de spécimens humains congelés gastro-intestinaux

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DOI :

10.3791/53691

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31 janvier 2016

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1Surgery, University of Texas Medical Branch, 2Internal Medicine, University of Texas Medical Branch, 3Molecular Genetics and Microbiology, University of New Mexico

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole permettant d’isoler et d’établir des cultures primaires de fibroblastes/myofibroblastes (MF) à partir de cellules congelées produisant du tissu gastrique, de l’intestin grêle et du côlon avec un phénotype MF est présenté. Ces cellules expriment CD90, α-SMA et vimentine. Les MF peuvent être utilisés pour une variété de tests fonctionnels, y compris l’activité enzymatique et la production de cytokines.

Résumé

Fibroblastes / myofibroblastes (PDE) ont gagné une attention croissante pour leur rôle dans la pathogenèse et leurs contributions à la fois la cicatrisation des plaies et la promotion du microenvironnement de la tumeur. Bien qu'il existe actuellement de nombreuses techniques pour l'isolement de la MFS de (GI) tissus gastro-intestinaux, ce protocole introduit un élément original de l'isolement de ces cellules stromales de tissu congelé. La congélation des échantillons de tissus de GI non seulement permet au chercheur d'acquérir des échantillons de collaborateurs à travers le monde, les biobanques et les fournisseurs commerciaux, il permet également le traitement retardé d'échantillons frais. Le protocole décrit va toujours produire des cellules fusiformes avec le phénotype caractéristique MF qui expriment les marqueurs CD90, α-SMA et la vimentine. Comme ces cellules sont dérivées à partir d'échantillons de patients, l'utilisation de cellules primaires confère également le bénéfice de la MFS imitant de près depuis des états pathologiques, à savoir le cancer et les maladies inflammatoires de l'intestin. Cette technique a l'abeillen validée dans l'estomac, l'intestin grêle et du côlon MF génération de culture primaire. MF cultures primaires peuvent être utilisés dans une vaste gamme d'expériences sur un certain nombre de passage et leur pureté évaluées à la fois par immunocytochimie et cytométrie de flux.

Introduction

Myofibroblastes / fibroblastes (PDE) représentent une population abondante de cellules dans gastro-intestinal (GI) muqueuse. Ces cellules stromales sont situés juste en dessous de l'épithélium et forment un réseau interconnecté à l'intérieur de la muqueuse de la lamina propria dans l'intestin. MF ne sont pas seulement responsables pour le dépôt de la matrice extracellulaire, mais par la réglementation paracrine peut influencer le transport de l'électrolyte, la restitution et la fonction de barrière de l'épithélium adjacente 1, 2. En outre, la MFS ont été montré à jouer un rôle clé dans l'inflammation et les tissus remodelage 3, 4. Myofibroblastes sont un élément important du microenvironnement de la tumeur, où ils sont également connus comme les fibroblastes associés au cancer, et de contribuer à la croissance des cellules tumorales et servent comme une niche pour les cellules souches du cancer 3. De nouvelles données suggèrent que MFS peut également servir de cellules présentatrices d'antigènes que locales. En outre, la fonction de FM des régulateurs importants de réponses immunitaires innées et adaptatives, produCing une variété de cytokines et de facteurs de croissance 5.

Chez les individus en bonne santé, des cellules MFs On pense que les différencier des cellules souches mésenchymateuses et d'exprimer sur leur surface cellulaire, le marqueur mésenchymateux, CD90 3, 5. Ces cellules sont également positives pour la vimentine, mais négatif pour épithéliale et le marqueur de cellules hématopoïétiques, EpCAM et CD45 respectivement. Les myofibroblastes sont proposés pour être une forme activée de fibroblastes et peuvent être distingués des fibroblastes non activées par l'expression d'α-SMA 5.

Au cours de la dernière décennie, plusieurs approches pour l'isolement de myofibroblastes de la muqueuse du côlon humain ont été publiés sur la base de la plupart du temps, la méthode décrite à l'origine par Mahida et al., 8.5. Bien que des études particulières signalent des modes opératoires d'isolement de divers muqueuse intestinale, aucun protocole universel pour l'isolement de MFs à partir de plusieurs régions du tractus gastro-intestinal (par exemple, de l'estomac, les petites et lmuqueuse intestinale ARGE) a été publié. Le protocole présenté ici a été testée et utilisée avec succès pour tous les trois type de tissu mentionné ci-dessus. . En outre, les procédures pour isoler les CM de la muqueuse gastro-intestinaux congelés ont pas été signalés.

Ici, nous présentons une méthode optimisée, qui est basé sur la digestion enzymatique, et permet en même temps pour l'isolement de la muqueuse de l'intestin humain MF pour la culture et la cytométrie en flux analyse fraîchement digérés, monocellulaires, préparations muqueuses. Cette technique donne de manière fiable des cultures primaires avec un phénotype MF. En outre, les mêmes méthodes peuvent être utilisées pour isoler les CM à partir de spécimens congelés de tissus intestinaux et gastriques petits ainsi. Isolement de myofibroblastes de tissu frais GI a été décrite précédemment; cependant, l'utilisation des échantillons congelés présente de nombreux avantages. A savoir, les chercheurs seront en mesure de recueillir et de stocker des tissus de tout nombre de collaborateurs à travers le monde qui ont la capacilité à expédier des échantillons de tissus congelés. En outre, les chercheurs peuvent trouver la collection de tissus enlevés de la salle d'opération et / ou salle d'endoscopie et le traitement immédiat du tissu pour l'isolement en conflit avec leur horaire de l'expérimentation en cours. Aussi, en raison de la nature imprévisible de la chirurgie, l'obtention de tissus peut se produire très tard dans la journée, ce qui limitera le temps restant pour le tissu de traitement. Geler les tissus pour un traitement ultérieur sera atténuer ces défis.

Enfin, ces méthodes ont été utilisées avec succès dans l'isolement des myofibroblastes intestinale du côlon, de l'estomac et dans les petits états pathologiques tels que le cancer colorectal et les maladies inflammatoires de l'intestin.

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Protocole

Le protocole pour l'obtention de tissus humains jetés de patients chirurgicaux et la mise en place de cultures primaires a été approuvé par l'Université du Texas Medical Branch et de l'Université du Nouveau-Mexique Institutional Review Board. Les exigences générales pour l'obtention d'échantillons de tissus humains est décrite ci-dessous. Notez que depuis MFS peut être isolé à partir de tissus congelés, les biobanques et de fournisseurs commerciaux sont également des options viables.

1. Obtenir tissus humains

  1. Proposez un protocole pour obtenir des tissus du côlon humain à la commission d'examen institutionnel pour approbation.
  2. Établir des collaborations avec des chirurgiens généraux et / ou des chirurgiens colorectaux afin d'obtenir les tissus humains pour la recherche. La collaboration avec le département de pathologie est également obligatoire, car ils seront déterminer les tissus qui ne sont pas requis pour le diagnostic et peut être désigné pour la recherche.
  3. Conseiller pathologiste de fournir des tissus de la tumeur, puis grosslmuqueuse normale y au moins 5 cm de la tumeur. Placer immédiatement les échantillons dans des milieux de lavage glacées et les placer sur la glace. Le pathologiste de déterminer la quantité de tissu qui peut être administré en toute sécurité pour la recherche. Le tissu minimale requise pour MF isolement est de 1,5 mm 2.
  4. Utilisez le tissu obtenu soit immédiatement pour établir les cultures primaires ou de gel et lieu à -80 ° C pour l'isolement avenir.
    1. Si le gel pour l'isolement plus tard, couper le tissu en environ 1 - 2 mm 2 pièces, placer dans un tube cryogénique avec 1 ml de gel des médias (voir ci-dessous), et conserver à -80 ° C. Remarque: En utilisant ce protocole, isolement réussi de la MFS à partir de tissus congelés pendant plus de 4 ans a été observé.

2. Préparer Réactifs

  1. Pour une solution de collagénase: Préparer 100 U / ml de collagénase I, II et IV dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec Ca2 + / Mg2 + (voir Tableau Matériaux ). ATTENTION: la collagénase concentration d'unité active et la pureté peut varie d'un fournisseur à ce qui peut entraver l'efficacité de la digestion des tissus et / ou de conservation de l'épitope sur la surface des cellules de la muqueuse. Pour éviter ces écueils potentiels, utilisez la collagénase avec plus haut degré de pureté (≥95%) et de préparer la solution d'actions fondée sur la concentration des unités actives.
  2. DNase solution d'achat d'actions à base d'eau Préparer à 10 mg / ml (3,55 UA / mg).
  3. Préparer Laver les médias: (MEM: 89 ml, antibiotiques antimycosique, 100x: 1 ml; FCS inactivé à la chaleur: 10 ml)
  4. Préparer la croissance des fibroblastes médias: MEM: bouteille de 500 ml; L-glutamine (200 mM): 5 ml; MEM non-acides aminés essentiels, 100x solution: 5 ml; ciprofloxacine HCl (10 mg / ml): 570 ul; Antibiotique-antimycosique, solution 100x: 10 ml; pyruvate de sodium (100 mM): 5 ml; FCS inactivé à la chaleur: 50 ml
  5. Préparer les médias Gel: les milieux de croissance des fibroblastes (réactif 2.4) avec l'ajout de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO), puis filtrez-sterilize avec un filtre de 0,22 pm.

Tissue 3. Digest enzymatique humain

  1. Si le tissu a été gelé dans les médias gel, lieu cryovial dans (~ 37 ° C) jusqu'à ce que l'eau chaude des tissus et des médias doit être décongelée.
  2. Pour 4 - 5 de 2 mm 2 morceaux de tissu, lavez le tissu deux fois avec 10 ml de HBSS sans Ca 2+ / Mg 2+.
  3. Une fois que le tissu a réglé par gravité, prenez soin de le surnageant sans essorage échantillon.
  4. Ajouter 10 ml de la solution de collagénase à l'échantillon et transférer le mélange tissu-solution dans un tube stérile, DNase / RNase avec haut-rotors pour échantillon dissociation. Utilisation de la collagénase pour dissocier la matrice extracellulaire qui entoure l'aspect basal des cellules épithéliales et constitue la fraction non-cellulaire de la muqueuse de la lamina propria.
  5. Fermer hermétiquement le tube et l'attacher à l'envers sur la manche de la dissociateur (par exemple, gentleMACS). Si le laboratoire n'a pas accès à la til susmentionnées équipements, augmenter le temps de chaque étape de digestion pour obtenir des résultats comparables.
  6. Exécutez le h_tumor_01 du programme, un profil prédéfini fourni avec la machine (durée totale de 36 sec, avec des impulsions intermittentes allant de 1000 - 4000 rpm, avec 268 tours par course).
  7. Après la fin du programme, retirez le tube de la dissociateur.
  8. Incuber l'échantillon pendant 45 min à 37 ° C sous rotation continue sur agitateur à 140 tours par minute. Remarque: Pour les quantités d'échantillons de tissus divers, temps de digestion peut être proportionnellement réduite ou augmentée (par exemple, de plus grandes quantités de tissu peuvent être plus longues).
  9. Attacher le tube à l'envers sur le manchon du dissociateur.
  10. Choisissez et exécutez le h_tumor_02 de programme (durée totale de 37 sec, avec des impulsions intermittentes allant de 1000 - 4000 rpm, avec 235 tours par course).
  11. Après la fin du programme, retirez le tube de la dissociateur.
  12. Ajouter 50 pi de DNase solution stock. Utilisez DNAse de dissocier / éliminer les cellules mortes et fraction d'ADN des débris cellulaires qui mène à la cellule agglutination.
  13. Incuber l'échantillon pendant 30 min à 37 ° C sous rotation continue sur un agitateur à 60 tpm.
  14. Attacher le tube à l'envers sur le manchon du dissociateur nouveau.
  15. Choisissez et exécutez le h_tumor_03 de programme (durée totale de 37 sec, avec des impulsions intermittentes allant de 1000 - 4000 rpm, avec 168 tours par course).
    Remarque: Si le tissu est complètement digéré pas, centrifuger à 250 g pendant 10 min à 20 ° C, éliminer le surnageant, remettre en suspension dans 2 ml de solution de dissociation cellulaire et incuber à température ambiante pendant 10 min.
  16. Passez la suspension de cellules à travers stérile 70 um tamis cellulaire.
  17. Centrifugeuse suspension de cellules à 250 g pendant 10 min à 20 ° C. Aspirer le surnageant complètement.
  18. Laver culot cellulaire à deux reprises avec 25 ml de HBSS sans Ca 2+ / Mg 2+ et jeter le surnageant.
  19. Avant la dernière étaith, compter le nombre de cellules en utilisant un système de comptage de cellules automatisé disponible dans le laboratoire ou manuellement en utilisant un hémocytomètre. Pour MF génération de culture primaire de procéder pour l'étape 3.19.1, pour l'analyse ou le tri de la MFS en utilisant la cytométrie de flux de procéder pour l'étape 3.19.2.
    1. Pour l'isolement et la croissance de la culture MF pur (figure 1), jeter le surnageant à partir de la dernière centrifugation, culot de cellules de remettre en suspension dans la quantité appropriée de support d'isolation des fibroblastes nécessaire pour ensemencer jusqu'à 4 x 10 6 cellules dans 3 ml du milieu par puits dans 6 assiettes bien, la culture de cellules traitées. Passez à l'étape 3.20.
    2. Pour l'analyse ou le tri de la MFS en utilisant la cytométrie de flux, placer jusqu'à 2 x 10 6 dans 2 ml de milieux d'isolement des fibroblastes dans 24 puits, plaque bas-liaison et incuber O / N à 37 ° C avec 5% de CO 2. Ceci est de restaurer les épitopes de surface cellulaire qui peuvent être affectés par la procédure enzymatique. Ensuite collecter suspension cellulaire et compter les cellules récupérées et procéderpour l'immunocoloration et cytométrie de flux analyse 8.
  20. Cultiver les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. Changer de support tous les 2 - 3 jours jusqu'à la formation de ~ 80% de confluence MF monocouche (figure 1D-E).
  21. Cellules Passage dans des flacons T25 avec plaque de 6 puits à un rapport de 1: 1 et croître pendant ~ 10 - 14 jours dans les médias de croissance des fibroblastes pour atteindre 80 - 100% de confluence.
  22. Développer culture par passage de cellules à partir de cellules T25 à T75 à un rapport 1: 2. Une fois que les cellules atteignent la confluence, utiliser un flacon pour l'analyse de la pureté isolé MF utilisant par cytométrie de flux comme décrit précédemment 5. De geler ou de passage dans un autre ballon T75 de la culture MF au rapport 1: 3.
    Remarque: Lors de l'analyse par cytométrie de flux, il est prévu que la muqueuse GI stromales mésenchymateuses MF d'origine lors de la croissance dans la culture aura phénotype suivant: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentine +, α-SMA +, CD90 +.

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Résultats

En utilisant ce protocole de digestion enzymatique, nous avons toujours été en mesure d'isoler et de cultiver CD90 + cellules stromales de la muqueuse intestinale MF population de GI spécimens et des biopsies (Figure 1) chirurgicales. Visible colonie prolifération MF a pu être observée le jour 2 - 5 après le semis suspensions cellulaires mononucléaires dans des plaques de 6 puits (figure 1A-B). Les cultures primaires MF atteignent ~ 50 - 7...

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Discussion

Bien que ce protocole a été développé pour l'application de recherche uniquement, à la lumière de l'importance croissante critique de cellules stromales comme un cancer potentiels biomarqueurs pronostiques et cible thérapeutique, la capacité de geler biospécimens «fonctionnelles» pour une utilisation ultérieure offre un avantage significatif. Cela représente un avantage unique pour la création de banques de tissus biologiques cliniques, qui peuvent servir d'outils supplémentaires servant à faire progresser l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) et l’Institute for Translational Sciences de la branche médicale de l’Université du Texas, ainsi qu’un prix de science clinique et translationnelle (8UL1TR000071).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MEM, 1xCorningMT-10-010-CV
Solution saline équilibrée de HanksSigma-AldrichH6648
Pyruvate de sodiumSigma-AldrichS8636
Antibiotique-antimycosique, 100xGibco15240-062
Ciprofloxacine HClCorning61-277-RF
L-Glutamine, 100xCorning25-005-CI
MEM Acides aminés non essentielsCorning25-025-CI
Diméthylsulfoxyde (DMSO) Hybri-MaxSigma-AldrichD2650
DL-Dithiothreitol solution (DTT)Sigma-Aldrich646563
0,5 M EDTA, pH 8,0Cellgro46-034-CI
DNAseWorthingtonLS002139
Collagénase de  ; Clostridium histolyticum, Type ISigma-AldrichC1639
Collagénase de  ; Clostridium histolyticum, Type IISigma-AldrichC1764
Collagénase de Clostridium histolyticum, Type IVSigma-AldrichC5138
Solution de dissociation cellulaire AccumaxSigma-AldrichA7089
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentleDissociateur MACSMiltenyi Biotec130-093-235
Compteur de cellules automatisé CountessInvitrogenC10227
Filtre de cellules (70 µ ; m)Corning352350
PE Souris Anti-Humain VimentinBD Biosciences562337Clone RV202
FITC Monoclonal Anti-Actine, &alpha ;-Muscle LisseSigma-AldrichF3777Clone 1A4
APC Souris Anti-Humain CD90BD Biosciences559869Clone 5E10

Références

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Réimpressions et autorisations

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