Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans Arabidopsis Roots pour surveiller cellulaire spécifique d'un tissu mural Modifications

Summary

La cellulose cristalline est un constituant important de la paroi cellulaire végétale. Cependant, sa quantification à une résolution cellulaire est techniquement difficile. Ici, nous rapportons l’utilisation de la technologie de la lumière polarisée et des sections efficaces des racines pour obtenir des informations sur la composition de la paroi cellulaire à une résolution spatio-temporelle.

Abstract

Les cellules végétales sont entourées d’une paroi cellulaire dont la composition détermine leur taille et leur forme finales. La paroi cellulaire est composée d’une matrice complexe contenant des polysaccharides qui comprennent des microfibrilles de cellulose qui forment à la fois des structures cristallines et des chaînes cellulosiques d’organisation amorphe. L’orientation des fibres de cellulose et leurs concentrations dictent les propriétés mécaniques de la cellule. Plusieurs méthodes sont utilisées pour déterminer les niveaux de cellulose cristalline, chacune apportant à la fois des avantages et des limites. Certains peuvent distinguer la proportion de régions cristallines dans la cellulose totale. Cependant, elles sont limitées aux analyses d’organes entiers qui manquent d’informations spatio-temporelles. D’autres, qui s’appuient sur l’imagerie en direct, sont limitées par l’utilisation de colorants imprécis. Ici, nous rapportons un système sensible basé sur la lumière polarisée pour la quantification spécifique de l’arriération relative de la lumière, représentant l’accumulation de cellulose cristalline dans les coupes transversales des racines d’Arabidopsis thaliana. Dans cette méthode, la résolution cellulaire et les données anatomiques sont maintenues, ce qui permet des comparaisons directes entre les différents tissus composant la racine en croissance. Cette approche ouvre une nouvelle dimension analytique, mettant en lumière le lien entre la composition de la paroi cellulaire, le comportement cellulaire et la croissance de l’organe entier.

Introduction

La paroi de la cellule végétale est une structure dynamique. les cellules en croissance sont entourées d'une paroi cellulaire primaire, dont l'organisation permet aux cellules de se développer. Les cellules qui cessent de croître dépôt d'une paroi secondaire plus rigide qui améliore le support mécanique de la plante. Les deux parois cellulaires sont composées de microfibrilles de cellulose noyées dans une matrice de polysaccharides de structures différentes (par exemple, l' hémicellulose et la pectine) qui varient selon les différents stades de développement et des tissus ^1,2. La cellulose est synthétisée sous la forme de chaînes (1,4) -β-D-glucane qui sont étroitement alignées pour former la microfibrilles d'une structure cristalline. cellulose Amorphous fait référence aux régions où les chaînes glucane sont moins ordonnés. Le rapport entre les domaines cristallins et amorphes , est un paramètre pensé à affecter les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire, en offrant une résistance mécanique et les caractéristiques viscoélastiques, respectivement ^3. Plusieurs méthodes ont étédéveloppé pour détecter et quantifier les deux formes d'arrangement de cellulose, dont la diffraction des rayons X et de polarisation croisée / l' angle magique RMN du solide ^4. Diffraction des rayons X peut être utilisée pour déterminer la proportion des domaines cristallins par rapport à la cellulose amorphe dans l'échantillon ^5. Une méthode alternative utilise le fractionnement du contenu de la paroi cellulaire en matière insoluble en milieu acide et soluble dans l'acide, de faire la distinction entre le cristallin et la cellulose amorphe ou d'autres polymères, respectivement. Dans cette approche, l' incorporation de glucose marqué ^([14 C] glucose) est utilisé pour quantifier le ^6,7 de cellulose. Ces procédés nécessitent de grandes quantités de matériel végétal pour l'analyse d'organes entiers, au mieux, et, par conséquent, ne sont pas suffisamment sensibles à une variation spécifique au tissu dans la structure de la paroi cellulaire. Visualisation des microfibrilles de cellulose à une résolution cellulaire peut être obtenue dans les études d'imagerie en temps réel associées à des colorants fluorescents ^8,9, qui peuvent identifier les changements dansl'orientation des microfibrilles de cellulose. Cependant, ces colorants ne sont pas utilisés pour la quantification, ils ne sont pas spécifiques à la cellulose cristalline et peuvent interférer avec la structure normale de la paroi cellulaire ^8. Polscope est une technique d'imagerie qui repose sur la capacité de cellulose cristalline pour diviser les faisceaux lumineux et à retarder une partie de la lumière ^10. un retard de lumière est la plus forte pour les microfibrilles qui se situent perpendiculairement à la direction de propagation de la lumière. Pour microfibrilles avec une orientation similaire, plus le degré de cristallinité, plus la lumière retardance ^11. Par conséquent, polscope est utilisé pour étudier à la fois les niveaux et l'orientation des microfibrilles de cellulose relative.

Roots présentent une croissance linéaire, au cours de laquelle les cellules provenant à la niche de cellules souches, à la pointe de la racine, subir une série de divisions cellulaires, avant de se développer rapidement ^12. Les cellules comprenant la racine se développer dans un unidirectionnel (anisotrope)Ainsi, comme dicté par les petites molécules de signalisation des hormones qui ont une incidence sur les propriétés de la paroi de la cellule ^13. Réponses différentielles aux hormones, dans le temps et l' espace, constituent un moyen d'assurer une croissance équilibrée de l' organe ^14. Par conséquent, l'analyse à haute résolution de la structure de la paroi cellulaire peut fournir des informations importantes nécessaires pour mieux comprendre le lien entre les réponses spécifiques de type cellulaire à la croissance organe entier. Nous rapportons ici la mise en œuvre de polscope pour étudier l' accumulation spécifique de tissu de cellulose cristalline dans les racines d' Arabidopsis, comme observé dans les sections anatomiques de haute qualité. Cette méthode a récemment découvert la cellule accumulation de cellulose cristalline spécifique de type en réponse à une perturbation spatiale de l' activité hormonale ^15.

Protocol

1. Croissance des végétaux

1. Stériliser la surface des graines.
   1. Stériliser les graines (jusqu'à 30 mg) par voie humide ou sèche. A titre d'exemple, pour la méthode de stérilisation à sec, ajouter HCl 1 ml glacial 37% dans 50 ml eau de Javel, dans un récipient en verre dans un dessiccateur fermé pendant au moins 4 heures et jusqu'à la nuit. Effectuez cette étape dans une hotte chimique.
2. Etaler les semences stériles sur des plaques avec la gélose végétale de 0,8% en 0.5x Murashige & Skoog (MS). Envelopper les plaques avec Parafilm ou ruban poreux et couvrir de papier d'aluminium.
3. Stocker les plaques à 4 ° C pendant 1 - 4 jours pour favoriser la germination uniforme.
4. Transférer les plaques dans une chambre convenable pour la culture de plants d'Arabidopsis de croissance. Placer les plaques verticalement afin d'assurer la croissance des racines sur du milieu d'agar et d'empêcher la pénétration.
5. plantules de transfert à fixateur 7 jours après la germination (DAG).

2. Fixation

1. Préparer 50 ml Richardson Solution en combinant des volumes égaux de 1% Borax (agent tampon), 1% de bleu de méthylène et 1% Azure (colorants histologiques) dans de l'eau distillée deux fois. Filtrer à travers un Seringue Driven 0,22 um PVDF filtre Unité avant utilisation.
2. Préparer 50 ml de fixatif: 1,25% de glutaraldéhyde dans du cacodylate de sodium 0,05 M (agent tampon).
   Remarque: Ces matériaux sont toxiques et doivent être manipulés dans une hotte chimique.
3. Ajouter 100 pi de solution Richardson (voir 2.1) à la solution de fixation (voir 2.2) pour obtenir la solution finale de fixation.
4. Mark chaque puits d'une plaque à 6 puits avec le nom de l'échantillon correspondant.
5. Placez 2 - 3 ml solution finale de fixation (voir 2.3) dans les puits, de sorte que les semis, une fois transférés, seront entièrement couverts en liquide.
6. transférer avec précaution, en utilisant une pince, jusqu'à 10 plants à chaque puits. Sceller les plaques à l'aide de Parafilm. Conserver à 4 ° C, dans l'obscurité, pendant au moins une nuit, et jusqu'à une semaine.

3. déshydratation

1. déshydrater semis. Transférez entre les puits de nouvelles plaques de 6 puits, contenant des concentrations croissantes d'éthanol, comme indiqué ici: 10% d'éthanol pendant 15 min; 30% d'éthanol pendant 15 min; éthanol à 50% pendant 15 min; éthanol à 70% pendant 15 min; éthanol à 85% pendant 15 min; éthanol à 95% pendant 15 min; 95% d'éthanol à 4 ° C pendant une nuit, au minimum. Traiter les semis en les saisissant avec soin par leurs cotylédons préférables avec des pinces en plastique.

4. infiltration

1. Préparer le milieu d'infiltration. Mélanger le contenu de 1 sachet de la historesin kit activateur avec 50 ml Kit de base de résine liquide dans une petite bouteille en verre. Remuer avec aimant pour 20 min. support d'infiltration peut être conservé à 4 ° C pendant quelques semaines.
2. Mark chaque puits d'une nouvelle plaque de 6 puits avec le nom de l'échantillon correspondant et remplir avec 2 - 3 ml de milieu d'infiltration.
3. Transférer les plantules dans la solution d'éthanol à 95% dans le milieu d'infiltration en utilisant une pince. Assurez-vous que les plants sont fully couverte par le milieu.
4. Conserver à 4 ° C pendant au moins 4 jours, afin d'assurer une pénétration maximale dans les tissus végétaux.

5. Bloc Préparation

1. Placez de petites étiquettes, crayon marqués avec le nom de l'échantillon, à l'intérieur de chaque puits d'incorporer des moules.
2. Préparer l'intégration moyenne en ajoutant 1 ml de durcisseur à 15 ml de milieu d'infiltration (voir 4.1). Ne pas essayer de préparer un volume inférieur à 15 ml, pour éviter les problèmes de polymérisation.
3. Remplissez la moitié de chaque puits dans le moule avec 200 ul milieu d'enrobage et couvrir avec un morceau de film en tête coupé à la forme du moule, mais à une taille de 1 mm de plus de chaque côté. Incuber à température ambiante pendant au moins 2 heures, pour permettre la polymérisation. Ne pas dépasser 5 heures.
4. Préparer un lot supplémentaire de milieu d'inclusion (voir 5.2) et garder sur la glace, pour éviter la polymérisation en pointes des racines sont disposées dans le moule.
5. Couper chaque extrémité de la racine sous un champ de dissection en utilisant scalpel et positionner très soigneusement it: verticalement pour des sections transversales ou horizontalement, de la section longitudinale, à environ 2 - 3 mm de la périphérie du moule. Remplissez le moule complètement avec une solution de blocage et le couvercle avec un film en tête. A noter que la solution de blocage se rétracte légèrement lorsqu'elle est polymérisée.
6. Conserver à température ambiante pendant 2 heures, au minimum.
7. Pour sécher les blocs, placer dans une boîte de gel de silice sec et laisser à température ambiante pendant la nuit, au minimum.

6. sectionnement

1. Préparer des couteaux de verre de tiges de verre avec un fabricant de couteau. Utilisez les couteaux de verre pour la coupe de tissu. Couper la baguette de verre dans un carré et puis couper le carré en diagonale pour produire deux couteaux, en utilisant un outil diamant de notation.
2. Section blocs dans 2 - 3 um tranches de largeur, en utilisant une machine de découpe. Placer les tranches sur une lame de verre, sur le dessus de gouttelettes d'eau distillée et placer la lame sur un bloc chauffant à basse température (50 - 60 ° C), jusqu'à évaporation de l'eau.

7. Diapositive Préparation pour Microscope Polarized

1. Diluer solution Richardson (voir 2.1) à 0,2% de la solution originale et utiliser 1 ml de celui-ci pour couvrir les tranches. Placer sur le bloc thermique pendant 5 secondes, puis laver avec de l'eau distillée.
2. Sécher la lame sur une plaque chauffante. Observer sous un microscope de dissection et marquer le dos de la lame avec un marqueur, pour indiquer la position des tranches d'intérêt, afin de faciliter leur identification ultérieure au microscope.
3. Ajouter 100 ul de milieu de montage et couvercle avec une lamelle.

8. Image Acquisition

1. Placez la lame recouverte contenant les sections de racines sous un microscope optique équipé d' un système Polscope approprié pour obtenir des informations de retardement et un filtre polariseur / interférence optique (Figure 1 AD).
2. Sélectionnez un grossissement qui permet une visualisation claire de l'ensemble de l' échantillon (par exemple, 40X dans cette étude) et concentrer le Microscopee sur un champ vide qui contient la section de bloc, mais pas de section de la racine. Essayez de trouver une région propre, sans taches. Utilisez cette région pour définir l'arrière-plan.
3. Réglez le système d'imagerie et les paramètres du logiciel: Définir plage à 17 nm. Appliquer "Exposition automatique" et de l'image de fond obtenir du champ vide (voir 8.2). Une image de fond est utilisé par expérience.

9. Polscope Analyse de Cellulose microfibrilles Orientation

1. L'analyse des coupes longitudinales.
   1. Placer une diapositive contenant des sections longitudinales sous le microscope et obtenir une image de retardement de celui-ci. Focaliser le microscope sur une section de racine d'intérêt. Fournir un nouveau nom de fichier.
   2. Capturer une image a ouvert (image avec des informations de retard) par la fenêtre "Live a ouvert". Être sûr de capturer un article qui comprend la paroi cellulaire, ce qui peut être identifié par la cellulose colorée courant le long de la périphérie de la cellule, comme le montre la figure 2C.
2. L'analyse d'image.
   1. Double-cliquez sur l'image pertinente dans la pile d'images. Sélectionnez "Couleur Orientation pseudo" dans l'onglet "Paramètres d'affichage".
   2. Pour estimer l'angle cellulose microfibrilles, correspondre à l'ombre correspondante de la paroi cellulaire pour que, dans la roue des couleurs.
      NOTE: La roue de couleur à la figure 2C reflète l'axe lent de la lumière se trouvant le long de la microfibrilles qui indique la direction le long de l'axe long des microfibrilles. L'angle de microfibrilles de cellulose est l'angle indiqué par la couleur et l'axe long de la cellule. Par exemple, la cellule d'allongement dans l'encart montre la couleur cyan, incliné d'environ 90 ° par rapport à l'axe long des cellules.
   3. Pour quantifier l'angle des microfibrilles moyenne dans la paroi cellulaire, utiliser l'outil "Retardateur et Azimuth Stamp" de la barre d'outils du logiciel. Tout en sélectionnant l'outil, pointez et cliquez sur la région d'intérêt dans l'image obtenue.
      NOTE: Ce will résultat dans l'affichage des angles (azimut) en degrés (figure 2C).
   4. Dans un accès ouvert polarisé logiciel d'analyse d'images de lumière alternative, le déjeuner plugin "Pol-Analyzer" dans le menu du plugin. Dans la nouvelle fenêtre ouverte, sélectionnez l'onglet et ouvert "biréfringence" et puis enregistrez le fichier d'arrière-plan et le fichier d'image.
   5. Dans la fenêtre d'image, sélectionnez "Caractéristiques". et ajuster la «taille de pixel de retour sur investissement '(utilisation de 5 pixels pour cette étude). Dans le "Specs." fenêtre, sélectionnez "Afficher les valeurs dans le tableau de résultats".
   6. Utilisez l'outil Polygon pour marquer la zone d'intérêt dans la fenêtre d'image. Sélectionnez "Lignes d'orientation" pour obtenir l'orientation de la microfibrilles de cellulose.
      NOTE: Cela se traduira par l'affichage des angles (azimut) en degrés.
      Remarque: L'angle calculé par une moyenne des deux méthodes doivent ensuite être étalonnée par rapport à la position de la section de base le long de la glissière. Pour corriger l'écart dele positionnement horizontal de la partie entière de la racine le long de la glissière, quantifie l'angle de microfibrilles moyenne de la paroi de la cellule adjacente à la cellule le long de son axe (qui est perpendiculaire à la section et le long de l'axe de croissance de la racine, la figure 2C). Cet angle est de 180 °, quand la partie de pied est positionné avec précision le long de la glissière. Pour le calcul de l'angle de microfibrilles, soustraire l'angle de microfibrilles moyenne mesurée de la paroi cellulaire flanquant de 180 °. Ajouter la différence abouti à l'angle de la paroi cellulaire de microfibrilles moyenne mesurée qui repose à plat sur la diapositive.

10. Polscope Analyse de Crystalline Cellulose Accumulation

1. Utilisez les sections transversales (croisées). Notez que l'accumulation de la cellulose cristalline ne peut être comparée entre les cellules lorsque leurs microfibrilles de cellulose sont alignées à un angle similaire (tel que déterminé à 9).
2. Double-cliquez sur l'image pertinente dans la pile d'images. Sélectionnez "Pseudo couleur "dans l'onglet" Paramètres d'affichage ".
3. Pour mesurer retardance. Zoom-in sur l'image. Sélectionnez "Région" et marquer toutes les régions d'intérêt. Déplacer vers l'onglet "mesures" et "Copy to Clipboard" toutes les valeurs.
   1. Transférer les données vers Excel et d'extraire les informations requises (région de retardance moyenne). Normaliser les données.
      NOTE: Pour tenir compte des différences d'épaisseur entre les tranches, d'exprimer les valeurs relatives à un bord de la paroi cellulaire spécifique dans la diapositive. Pour normaliser, diviser la retardance moyenne correspondant à la paroi cellulaire d'intérêt par la retardance moyenne d'une paroi cellulaire différente dans la même image. Par exemple, la paroi cellulaire de l'épiderme externe a été étalonnée par rapport à la paroi de la cellule corticale interne dans notre étude.
4. Répétez les mesures pendant au moins 3 sections par racine, avec un minimum de 3 racines par échantillon.

Results

Nous étudions l'impact des réponses spécifiques de type cellulaire pour brassinostéroïdes (BRS), en utilisant la racine de Arabidopsis comme un organe de modèle ^15-17. Lorsque le récepteur BRI1 BR est ciblée, dans le fond de BRI1 mutante, à un sous - ensemble des cellules de l' épiderme , appelées cellules non capillaires (figure 2A, B), il inhibe l' expansion des cellules unidirectionnel de cellules voisines, et la croissance toute la racine...

Discussion

Ici, nous présentons une méthode de détermination de l'accumulation de cellulose cristalline dans les différents tissus composant les racines d' Arabidopsis, tout en conservant les informations anatomiques. En tant que tel, il fournit une étape supplémentaire vers la compréhension des processus de croissance des plantes à une résolution cellulaire. Cette méthode peut également être appliquée pour l'étude des espèces et des organes végétaux supplémentaires.

Un certain nom...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog (MS)	Duchefa	M0221
Borax	LOBA CHEMIE  ;	6038
Bleu de méthylène	Sigma	M-9140
	Filtre PVDF	Sigma
	MILLEX-GV
Glutaraldéhyde	EMS	16220
Cacodylate de sodium	Sigma	C-0250
Leica kit historesin  ;	Leica	7022 18 500
moules d’enrobage	Agar Scientific	AGG3530
film 100 µ ; P.P.C.  ;			film suspendu
Knivemaker	LKB	7800
Ultratome III	LKB	8800	Ultratome
Shandon immumount  ;	Microscope à	lumière moyenne à montage	9990402
	Nikon	Eclipse 80i
Abrio Système d’imagerie	IRC	Système d’imagerie
Logiciel Abrio V2.2 Logiciel	IRC	Abrio V2.2 Logiciel
d’analyse d’images en lumière polarisée en libre accès	OPS	OpenPolScope	http://www.openpolscope.org/