Article de méthode

La caractérisation in situ des protéines hydratés dans l'eau par Salvi TOF-SIMS

DOI :

10.3791/53708

⸱

15 février 2016

 ,  ,  ,  , 
1Fundamental & Computational Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail présente un protocole pour la manipulation de liquides et introduction de l'échantillon à un microcanaux pour in situ à temps de vol des ions secondaires masse analyse par spectrométrie de biomolécules de protéines dans une solution aqueuse.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail démontre la caractérisation in situ de biomolécules de protéines dans la solution aqueuse en utilisant le Système d'analyse à l'interface de vide Liquide (SALVI) et d'ions secondaires spectrométrie de temps de vol de masse (TOF-SIMS). Le film de protéine de fibronectine est immobilisé sur la membrane de nitrure de silicium (SiN) qui forme la zone de détection SALVI. Lors de l'analyse TOF-SIMS, trois modes d'analyse ont été menées, y compris haute spatiale spectrométrie de résolution en masse, en deux dimensions (2D) imagerie, et le profilage en profondeur. Les spectres de masse ont été acquises dans les deux modes positif et négatif. eau désionisée a également été analysée comme échantillon de référence. Nos résultats montrent que le film fibronectine dans l'eau a des pics de cluster de l'eau plus distinctes et plus forte par rapport à l'eau seule. des pics caractéristiques des fragments d'acides aminés sont également observables dans la protéine hydratée spectres ToF-SIMS. Ces résultats montrent que l'adsorption des protéines molécule sur une surface peut être étudiée dynamically utilisant SALVI et ToF-SIMS dans le milieu liquide pour la première fois.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'hydratation est essentielle pour la structure, une conformation, 2 3 et l'activité biologique des protéines. Protéines sans les molécules d'eau qui les entourent ne seraient pas avoir des activités biologiques viables. En particulier, les molécules d'eau interagissent avec la surface et de la structure interne de protéines, et les différents états d'hydratation de protéines font de telles interactions distinctes. 4 L'interaction des protéines avec des surfaces solides est un phénomène fondamental avec des implications dans les nanotechnologies, les biomatériaux et les processus d'ingénierie tissulaire. Des études ont indiqué que les temps des changements conformationnels peuvent se produire en tant que protéine rencontre une surface. ToF-SIMS a été envisagé que la technique qui a le potentiel d'étudier l'interface protéine-solide 7.5. Il est important de comprendre l'hydratation de protéines sur des surfaces solides, qui fournit potentiellement une compréhension fondamentale du mécanisme de leur structure, conformation et biologiqueactivité al.

Cependant, les techniques d'analyse de surface importante sont pour la plupart à base de vide et des applications directes pour les études liquides volatils sont difficiles en raison de l'évaporation rapide de liquide volatil dans l'environnement sous vide. Nous avons développé un vide Interface microfluidique compatible, Système d'analyse à l'interface de vide Liquide (SALVI), pour permettre l'observation directe des surfaces liquides et les interactions liquide-solide en utilisant des ions secondaires spectrométrie de temps de vol de masse (TOF-SIMS). 8- 11 les aspects uniques sont les suivants: 1) la fenêtre de détection est une ouverture de 2-3 um de diamètre et permettant l'imagerie directe de la surface du liquide, 2) la tension de surface est utilisé pour maintenir le liquide dans l'ouverture, et 3) Salvi portable entre plusieurs plates-formes d'analyse. 11,12

SALVI se compose d'un nitrure de silicium (SiN) membrane en tant que zone de détection et un microcanal en polydiméthylsiloxane (PDMS). Il est fabricated dans la salle blanche, et les facteurs de fabrication et de conception clé ont été détaillés dans les documents précédents et les brevets. 8-12 Les applications de TOF-SIMS comme un outil d'analyse ont été démontrées en utilisant une variété de solutions aqueuses et les mélanges de liquides complexes, dont certains qui contenait des nanoparticules. 13-17 précisément, SALVI liquide TOF-SIMS permet dynamique de sondage de l'interface liquide-solide des systèmes vivants biologiques (ie, les biofilms), des cellules individuelles, et l'interface électrolyte solide, ouvrant de nouvelles perspectives pour la phase in situ condensé études, y compris les liquides à l'aide de TOF-SIMS. Cependant, la conception actuelle ne permet pas encore les interactions gaz-liquide. Ceci est une direction pour le développement futur. SALVI a été utilisée pour étudier le film de protéine hydratée dans ce travail pour la première fois.

La fibronectine est une protéine dimère couramment utilisé, constitué de deux monomères à peu près identiques reliées entre elles par une paire de liaisons disulfure, 18 qui is bien connu pour sa capacité à se lier aux cellules. 19,20 Il a été choisi comme système modèle pour illustrer le fait que le film de protéine hydratée pourrait être sondée dynamiquement en utilisant le liquide SALVI TOF-SIMS approche. La solution de protéine a été introduit dans le microcanal. Après une incubation de 12 heures, un film de protéine hydratée formée sur le côté arrière de la membrane SiN. Déminéralisée (DI) a été utilisé pour rincer le canal après l'introduction de protéines. Des informations ont été recueillies auprès de hydratés molécules de protéines de la fibronectine dans le microcanal SALVI utilisant dynamique TOF-SIMS. l'eau DI a également été étudié en tant que témoin de comparer avec les résultats obtenus à partir de couches minces fibronectine hydraté. On a observé des différences marquées entre le film protéique hydratée et de l'eau DI. Ce travail démontre que l'adsorption des protéines sur la surface dans le milieu liquide peut être étudiée en utilisant l'SALVI de roman et de liquide approche TOF-SIMS. Le protocole vidéo est destiné à fournir des conseils techniques pour les gens qui sont intéressésdans l'utilisation de ce nouvel outil d'analyse pour des applications diverses de SALVI avec TOF-SIMS et de réduire les erreurs inutiles dans la manipulation de liquides ainsi que l'acquisition de données TOF-SIMS et l'analyse.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. nettoyage et la stérilisation de l'Microchannel SALVI

  1. Stérilisation du Microchannel dans SALVI
    1. Piochez 2 ml de solution aqueuse à 70% d'éthanol dans une seringue, connecter la seringue à l'extrémité d'entrée de SALVI, et injecter lentement 1 ml de liquide dans 10 min. Retirer la seringue en fin d'injection. Ensuite, connectez l'entrée et la sortie de SALVI utilisant une polyétheréthercétone (PEEK) union. Vous pouvez également utiliser une pompe à seringue pour effectuer la même procédure. Par exemple, régler la vitesse d'écoulement à 100 pi / min.
    2. Gardez le microcanal SALVI rempli d'une solution d'éthanol à 70% à la température ambiante pendant 4 heures.
  2. Présentez déminéralisée (DI) de l'eau dans SALVI
    1. Piochez 2 ml d'eau DI stérilisés dans une seringue, connecter la seringue avec l'entrée de SALVI, et injecter lentement 1 ml de liquide dans 10 min. Retirez la seringue, et relier l'entrée et la sortie de SALVI utilisant une union PEEK. Vous pouvez également utiliser une pompe à seringue comme mentionné dansétape 1.1.1.

2. L'immobilisation du film de protéine dans SALVI

  1. Immobiliser le film de protéine dans SALVI
    1. Piochez 2 ml de fibronectine (10 pg / ml dans un tampon phosphate salin, PBS) dans une seringue, connecter la seringue avec l'entrée de SALVI, injecter lentement 1 ml de liquide dans 10 min, retirer la seringue, et relier l'entrée et la sortie de SALVI utilisant une union PEEK.
    2. Incuber l'SALVI rempli avec la solution de fibronectine dans une boîte de culture propre, garder le plat dans la hotte à température ambiante pendant 12 heures.
    3. Piochez 2 ml d'eau DI stérilisés dans une seringue et connecter la seringue avec l'entrée de SALVI. injecter lentement 1 ml d'eau en 10 minutes, retirer la seringue, et relier l'entrée et la sortie de SALVI.
      Remarque: Si équipé d'un microscope optique, vérifier la SALVI sous le microscope pour veiller à ce que la membrane SiN est intact avant l'analyse TOF-SIMS. Maintenant l'appareil est prêt pour SALVI TOF-SIMS unaly.

3. Installez SALVI dans le sas Chambre TOF-SIMS

Note: Les gants doivent être portés en tout temps lors de la manipulation du dispositif SALVI et de l'installer sur la scène TOF-SIMS pour éviter les contaminations potentielles lors de l'analyse de surface.

  1. Mont SALVI sur la scène
    1. Poser le stade TOF-SIMS sur une surface plane et propre. Mettez le dispositif SALVI sur la scène avec la tranche de silicium et de la membrane SiN vers le haut. Fixer le SALVI aide de quatre pièces de métal de serrage et visser les pièces métalliques qui maintiennent le coin de l'appareil dans la plaque de métal par quatre vis.
    2. Roulez doucement le tube de PTFE relié au canal microfluidique. Utilisez quatre pièces de métal et quatre vis pour maintenir la partie raide vers le bas. Assurez-vous que le dispositif est positionné dans l'espace ouvert sur la scène SIMS afin qu'il ne gêne pas le faisceau d'ions primaires au cours de l'analyse. Image supplémentaires et l'illustration de la fabricat SALVIion et l'installation sont disponibles dans les publications précédentes. 8,9,11
  2. Monter la Coupe de Faraday sur la scène
    1. Fixer la cage de Faraday sur la scène par une vis.
  3. Chargez la scène dans les TOF-SIMS sas Chambre
    1. Ouvrir le sas TOF-SIMS, détenir et préparer le terrain à l'horizontale sur la plate-forme de chargement, et fermer la porte du sas.

4. TOF-SIMS d'acquisition de données

  1. Tournez sur la pompe à vide et d'assurer vide approprié (par exemple, de l'ordre de 10 -6 mbar ou Torr) est atteinte dans la chambre de sas.
  2. Déplacer le SALVI dans la chambre principale une fois que le vide se stabilise au bout d'environ 30 min.
    Remarque: Le vide doit être inférieure à 5 x 10 -6 mbar vide dans la chambre principale lors de l'acquisition des données. Dans le cas contraire, le vide élevé est indicatif d'une fuite dans le système SALVI.
  3. Régler le faisceau d'ions primaires et d'un analyseur de ToF-SIMS avec unrésolution spatiale d'environ 400 nm selon les recommandations du fabricant. Le courant du faisceau primaire est de 1200 pA tandis que le temps de cycle est de 30 microsecondes de moins de mode DC.
    Remarque: Ce processus suit en grande partie les recommandations du fabricant.
  4. Trouver le canal microfluidique en utilisant le microscope optique. Utilisez le centre optique de l'image de référence et l'aligner à être compatible avec le centre de l'image d'ions secondaires.
  5. Avant chaque mesure, utiliser un 1 keV O 2 + faisceau (~ 40 nA) pour numériser sur la fenêtre SiN avec une zone de 500 x 500 um 2 pour ~ 15 sec pour éliminer la contamination de surface. En outre, utiliser un canon de saturation d'électrons pour compenser la charge de la surface lors de toutes les mesures. Utilisez la fonction automatique de l'arme à feu contre les inondations dans le mode par défaut pour cette étape.
  6. Sélectionnez le mode positif ou négatif avant l'acquisition de données. Utilisez le keV Bi 3 + faisceau 25 que le faisceau d'ions primaires dans toutes les mesures.
    Remarque: Les étapes sont similaires fou des acquisitions de données positives et négatives. Pour l'intérêt de l'espace, le mode positif est décrit en détail ici.
    1. profondeur de profilage
      1. Scannez le + faisceau Bi 3 sur une zone ronde avec un diamètre de ~ 2 um avec 32 pixels par la résolution 32 pixels.
      2. Pour réduire au minimum le temps nécessaire pour percer à travers la membrane-SiN, en utilisant une largeur d'impulsion longue (par exemple, 180 ns, le courant du faisceau ~ 1,0 Pa à une durée de cycle de 100 ps) 3 + Bi faisceau. Les intensités des ions secondaires représentant de l'augmentation de la surface du liquide lorsque punch-through est atteint. Le temps de percement varie de 300 s à 500 s, en fonction de la charge de la membrane SiN.
        Remarque: Cette différence semble être liée au lot de membranes SiN acquises selon notre expérience. Cependant, le temps de punch-through n'a pas vraiment d'incidence sur l'analyse de données.
      3. Après la membrane SiN punch-through, garder le même courant pendant environ 200 secondes pourobtenir suffisamment de données pour images 2D reconstructions.
      4. Réduire la largeur d'impulsion de 80 ns pour la collecte de données pour acquérir des spectres avec une meilleure résolution en masse. Continuer cette acquisition pour environ 200 autres sec. Les données spectrales représentées sur la figure 1 sont obtenus à partir de cette région.
    2. Imagerie 2D et spectres de masse
      1. Recueillir l'imagerie 2D et des données de spectre de masse en même temps lors de la mesure des données de profondeur de profilage. L'instrument TOF-SIMS enregistre toutes les informations de chaque point pendant l'expérience. Les données sont présentées dans des fenêtres différentes (Fpanel - Spectra, Fpanel - Profils et Fpanel - Images séparément) du logiciel de commande numérique. Vérifier les données dans chaque panneau judicieusement lors de l'acquisition de données.

Analyse 5. TOF-SIMS de données

Remarque: L'analyse des données est tout d'abord effectuée en utilisant le logiciel instrumental IonToF ToF-SIMS.

  1. Ouvrez l'unlogiciel de alyse de SIMS (Mesure Explorer), puis cliquez sur les «profils», «boutons d'image« spectres »et«, respectivement, pour traiter profil de profondeur, m / z spectre, et des données d'image.
  2. Ouvrez les fichiers de données qui portent l'extension ".ita".
  3. Sélectionnez pics d'intérêt, tapez le nom de l'espèce dans la case "ionique", et les étiqueter avec des couleurs différentes dans le spectre. Utilisez la molette de la souris pour faire glisser le long de l'axe des x. Utilisez Ctrl et molette de défilement pour ajuster la hauteur des pics et des largeurs. Lettre commutateurs "L" entre les modes linéaires et identifier le long de l'axe des ordonnées.
  4. Mener la reconstruction de données avant l'étalonnage de masse. Dans le cas contraire, il est difficile de choisir l'espacement entre les pics dans l'étape de calibrage de masse.
    1. Sélectionnez les données de profondeur de profilage d'intérêt et de reconstruire les spectres en fonction de la profondeur des séries temporelles profil.
    2. Cliquez sur le bouton de reconstruction. Dans la fenêtre "Démarrer la reconstruction", type dans une plage de balayage de intEREST. Cliquez sur "OK" pour reconstruire les données de profil de profondeur.
  5. Effectuer un étalonnage de masse. Appuyez sur "F3" pour ouvrir la fenêtre "d'étalonnage de masse". Choisissez pics pour l'étalonnage sur la base de l'échantillon spécifique. 21 Dans ce travail, utiliser les pics suivants CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) et H 13 O 6 + (m / z 109) pour le mode positif. Utiliser la pics CH suivante - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), et C 4 H - (m / z 49) pour le mode négatif.
    1. Sélectionnez un pic,Assurez-vous que la flèche vers le bas est pointé sur la crête dans le coin inférieur gauche de la fenêtre. Cliquez sur ce pic et tapez le nom de crête dans la fenêtre "d'étalonnage de masse", cliquez sur "Ajouter", et l'ion d'intérêt est inclus dans l'étalonnage de masse.
    2. Enfin, cliquez sur le bouton "Recalibrate". Vérifiez si les surfaces des pics sont dans les bons endroits en fonction de leur rapports masse sur charge. Dans le menu "Spectrum", sélectionnez et cliquez sur "Appliquer Mass Calibration" à "tous les spectres" ou "spectres sélectionnés", en fonction de l'analyse spécifique en cours.
  6. Comme la sélection pic est nécessaire pour l'analyse de l'échantillon, déterminer des pics caractéristiques de l'échantillon en fonction de la littérature ou d'autres résultats précédents. Comparer l'intensité des pics d'intérêt dans le m / z spectres. Si nécessaire, ajouter de nouveaux sommets ou supprimer sommets inutiles dans la liste de pointe.
    1. Ajouter pics. Cliquez sur un pic, trouver les lignes rouges à la fenêtre en bas à gauche. Hold la touche "Ctrl", faire défiler horizontalement la souris pour définir la largeur de pic, ce qui ajoute un pic à la liste de pointe automatiquement. Une autre façon d'ajouter un pic est de sélectionner un pic dans la fenêtre du spectre principal, puis cliquer sur le bouton "ajouter pic" au-dessus de la fenêtre. S'il y a beaucoup de sommets à ajouter, dans le menu "Spectrum", cliquez sur "Recherche pics", vérifier les spécifications relatives à la nouvelle fenêtre ouverte, puis ajouter des pics en fonction des besoins.
    2. Pour exporter une liste de pointe, dans le menu "Liste Peak", sélectionnez "Enregistrer ..." la liste de pointe dans le format "itmil". Utilisez le bouton gauche Ctrl et faire glisser le long du spectre. Dans la fenêtre de spectres, sélectionner un pic d'intérêt et faites glisser les deux lignes en pointillés à des postes souhaitables.
    3. Pour importer une liste de pointe, dans le menu "Mass Liste intervalle", choisissez "Importer ...", localiser un fichier de liste de pointe existant avec l'extension de fichier ".ITPL". Cliquez sur "Ouvrir".
    4. Pour utiliser un "itmil" liste de pics, dansle menu "Mass Liste Interval", cliquez sur "Open ...", trouver le fichier, puis cliquez sur «Ouvrir».
  7. Appliquer une liste de pointe pour analyser d'autres données. Au fond à gauche de la fenêtre "Spectra", il y a une fenêtre appelée "messe Intervalle Liste". La liste de pointe importé est représenté ici.
    1. Cliquez droit sur le fichier de liste de crête à être utilisé, l'appliquer au "spectre actif" ou "tous les spectres".
  8. Consultez les profils de données. Dans le "profil" fenêtre, utilisez la lettre "M" pour adapter à la fenêtre (de gamme) et la lettre "N" pour répondre à l'axe des ordonnées. Utilisez Ctrl et molette de défilement pour ajuster la largeur de profil. Ou utiliser "/" et "*" sur le clavier pour modifier la plage de l'axe y et la hauteur.
  9. Export des données pour tracer outre l'utilisation d'un autre logiciel graphique après l'analyse initiale.
    1. Pour exporter un profil de profondeur, dans le "profil" fenêtre, cliquez sur le menu "Fichier", puis sélectionnez "Export & #34 ;, puis sélectionnez "Enregistrer sous" un fichier ".txt".
    2. Pour exporter un fichier de spectre m / z, dans la fenêtre "Spectra", cliquez sur le menu "Fichier", puis sélectionnez "Exporter", puis sélectionnez "Enregistrer sous" un fichier ".txt".
    3. Pour exporter un fichier d'image, dans la fenêtre, l'écran d'impression "Image" et enregistrez le fichier image.

6. TOF-SIMS données de traçage et présentation

Remarque: Utilisez un outil graphique pour tracer les données après les données SIMS sont traitées en utilisant le logiciel instrumentale.

  1. Utilisez un outil graphique pour importer les données.
  2. Faites un terrain en utilisant le m / z comme axe des x et le pic d'intensité que l'axe des ordonnées pour montrer le spectre reconstruit. Un exemple est donné sur la figure 1.
  3. Faites un terrain en utilisant le temps de pulvérisation que l'axe des x et le pic d'intensité que l'axe des ordonnées pour montrer le profil de profondeur série temporelle reconstruite. Un exemple est donné dans Figure 2.
  4. Combiner des images 2D reconstruites des différents m / z et former une matrice pour montrer la cartographie d'ions. Un exemple est donné sur la figure 2.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un couple de résultats représentatifs sont présentés pour démontrer les avantages du protocole proposé. En utilisant l'interface microfluidique SALVI, le faisceau d'ions primaires (Bi + 3) peut bombarder directement sur ​​le film de fibronectine hydraté dans de l'eau DI. Ainsi, la cartographie chimique moléculaire de la surface du liquide peut être acquis avec succès.

Figure 1a et

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SALVI est une interface qui permet microfluidique surface du liquide dynamique et liquide-solide analyse d'interface par des instruments d'aspiration en fonction, comme TOF-SIMS et microscopie électronique à balayage (MEB). En raison de l'utilisation de petites ouvertures pour exposer liquide directement dans le vide, SALVI est adapté à de nombreuses techniques de spectroscopie et imagerie finement ciblées sans aucune modification; 22 la portabilité et la polyvalence de la microfluidique en font u...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants envers le fonds LDRD de l’initiative d’imagerie chimique du Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) - Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) et de l’initiative MS3 (Materials Synthesis and Simulation across Scales). L’accès instrumental a été fourni par le biais d’une proposition sur le thème de la science du Laboratoire des sciences moléculaires environnementales de W. R. Wiley (EMSL). L’EMSL est une installation nationale d’utilisateurs scientifiques parrainée par le Bureau de la recherche biologique et environnementale (BER) du PNNL. Les auteurs remercient M. Xiao Sui, M. Yuanzhao Ding et Mme Juan Yao pour la relecture du manuscrit et les commentaires utiles. PNNL est exploité par Battelle pour le compte du DOE sous le contrat DE-AC05-76RL01830.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ToF-SIMSIONTOFTOF. Résolution SIMS 5: >10 000 m/&Delta ; m pour résolution de masse ; >4 000 m/&Delta ; m pour haute résolution spatiale  ;
Système d’analyse à l’interface du vide liquide (SALVI)Pacific Northwest National LaboratoryN/ASALVI est un outil d’analyse unique, autonome et portable qui, pour la première fois, permet aux instruments scientifiques basés sur le vide, tels que la spectrométrie de masse d’ions secondaires à temps de vol (ToF-SIMS), d’analyser les surfaces liquides à l’état naturel au niveau moléculaire.
Union PEEKValcoZU1TPKpour le raccordement de l’entrée et de la sortie de l’étage d’échantillonnage SALVI
5 axesIONTOFN/ALa platine est fabriquée par ses soins pour le montage de SALVI dans le
système de purification d’eau nanopureBarnstead Thermo Fisher ScientificD11921Module de filtration par osmose inverse ROpure LP (D2716)
SeringueBD309659Pipette de 1 ml
Thermo Fisher Scientific21-377-821Gamme : 100 à 1 000 ml Pointe de
pipetteNeptune2112.96.BS1 000 & micro ; l
Tube à centrifugerCorning43079115 ml
FibronectineSigma-AldrichF11411 mg/ml
ÉthanolThermo Fisher ScientificS25310A95 % dénaturé
Gibco PBSThermo Fisher Scientific10010-023pH 7,4
ToF-SIMS

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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