La caractérisation in situ des protéines hydratés dans l'eau par Salvi TOF-SIMS

Résumé

Ce travail présente un protocole pour la manipulation de liquides et introduction de l'échantillon à un microcanaux pour in situ à temps de vol des ions secondaires masse analyse par spectrométrie de biomolécules de protéines dans une solution aqueuse.

Résumé

Ce travail démontre la caractérisation in situ de biomolécules de protéines dans la solution aqueuse en utilisant le Système d'analyse à l'interface de vide Liquide (SALVI) et d'ions secondaires spectrométrie de temps de vol de masse (TOF-SIMS). Le film de protéine de fibronectine est immobilisé sur la membrane de nitrure de silicium (SiN) qui forme la zone de détection SALVI. Lors de l'analyse TOF-SIMS, trois modes d'analyse ont été menées, y compris haute spatiale spectrométrie de résolution en masse, en deux dimensions (2D) imagerie, et le profilage en profondeur. Les spectres de masse ont été acquises dans les deux modes positif et négatif. eau désionisée a également été analysée comme échantillon de référence. Nos résultats montrent que le film fibronectine dans l'eau a des pics de cluster de l'eau plus distinctes et plus forte par rapport à l'eau seule. des pics caractéristiques des fragments d'acides aminés sont également observables dans la protéine hydratée spectres ToF-SIMS. Ces résultats montrent que l'adsorption des protéines molécule sur une surface peut être étudiée dynamically utilisant SALVI et ToF-SIMS dans le milieu liquide pour la première fois.

Introduction

L'hydratation est essentielle pour la structure, ^une conformation, ^{2 3} et l'activité biologique des protéines. Protéines sans les molécules d'eau qui les entourent ne seraient pas avoir des activités biologiques viables. En particulier, les molécules d'eau interagissent avec la surface et de la structure interne de protéines, et les différents états d'hydratation de protéines font de telles interactions distinctes. ⁴ L'interaction des protéines avec des surfaces solides est un phénomène fondamental avec des implications dans les nanotechnologies, les biomatériaux et les processus d'ingénierie tis....

Protocole

1. nettoyage et la stérilisation de l'Microchannel SALVI

1. Stérilisation du Microchannel dans SALVI
   1. Piochez 2 ml de solution aqueuse à 70% d'éthanol dans une seringue, connecter la seringue à l'extrémité d'entrée de SALVI, et injecter lentement 1 ml de liquide dans 10 min. Retirer la seringue en fin d'injection. Ensuite, connectez l'entrée et la sortie de SALVI utilisant une polyétheréthercétone (PEEK) union. Vous pouvez également utiliser une pompe à seringue pour effectuer la même procédure. Par exemple, régler la vitesse d'écoulement à 100 pi / min.
   2. Gardez le microcanal SALVI rempli d'une solution d'é....

Résultats

Un couple de résultats représentatifs sont présentés pour démontrer les avantages du protocole proposé. En utilisant l'interface microfluidique SALVI, le faisceau d'ions primaires (Bi ⁺ ₃₎ peut bombarder directement sur ​​le film de fibronectine hydraté dans de l'eau DI. Ainsi, la cartographie chimique moléculaire de la surface du liquide peut être acquis avec succès.

Figure 1a et

Discussion

SALVI est une interface qui permet microfluidique surface du liquide dynamique et liquide-solide analyse d'interface par des instruments d'aspiration en fonction, comme TOF-SIMS et microscopie électronique à balayage (MEB). En raison de l'utilisation de petites ouvertures pour exposer liquide directement dans le vide, SALVI est adapté à de nombreuses techniques de spectroscopie et imagerie finement ciblées sans aucune modification; ²² la portabilité et la polyvalence de la microfluidique en font u.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ToF-SIMS	IONTOF	TOF. Résolution SIMS 5	: >10 000 m/&Delta ; m pour résolution de masse ; >4 000 m/&Delta ; m pour haute résolution spatiale  ;
Système d’analyse à l’interface du vide liquide (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI est un outil d’analyse unique, autonome et portable qui, pour la première fois, permet aux instruments scientifiques basés sur le vide, tels que la spectrométrie de masse d’ions secondaires à temps de vol (ToF-SIMS), d’analyser les surfaces liquides à l’état naturel au niveau moléculaire.
Union PEEK	Valco	ZU1TPK	pour le raccordement de l’entrée et de la sortie de l’étage d’échantillonnage SALVI
5 axes	IONTOF	N/A	La platine est fabriquée par ses soins pour le montage de SALVI dans le
système de purification d’eau nanopure	Barnstead Thermo Fisher Scientific	D11921	Module de filtration par osmose inverse ROpure LP (D2716)
Seringue	BD	309659	Pipette de 1 ml
	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Gamme : 100 à 1 000 ml Pointe de
pipette	Neptune	2112.96.BS	1 000 & micro ; l
Tube à centrifuger	Corning	430791	15 ml
Fibronectine	Sigma-Aldrich	F1141	1 mg/ml
Éthanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95 % dénaturé
Gibco PBS	Thermo Fisher Scientific	10010-023	pH 7,4

ToF-SIMS