Stimulation à courant continu et multi-réseau d'électrodes d'enregistrement de la capture comme activité chez la souris Cerveau Slice Préparation

Summary

Des études ont montré que la stimulation transcrânienne cathodique à courant continu peut produire des effets suppressifs sur les crises résistantes aux médicaments. Dans cette étude, un dispositif expérimental in vitro a été conçu dans lequel la stimulation à courant continu et l’enregistrement en réseau multiélectrodes de l’activité convulsive ont été évalués dans la préparation de coupes de cerveau de souris. Les paramètres de stimulation en courant continu ont été évalués.

Abstract

la stimulation directe du courant transcrânienne cathodique (STCC) induit des effets suppresseurs sur les saisies résistantes aux médicaments. Pour effectuer des actions efficaces, les paramètres de stimulation (par exemple, l' orientation, l' intensité du champ, et la durée de stimulation) doivent être examinés dans les préparations de tranche des souris du cerveau. Agencer les essais et l'orientation de l'électrode par rapport à la position de la tranche de cerveau des souris sont possibles. La présente méthode permet de conserver la voie thalamocingulate pour évaluer l'effet du DCS sur les activités de saisie comme cortex cingulaire antérieur. Les résultats des enregistrements de matrice à canaux multiples indiquent que DCS cathodique diminué de manière significative l'amplitude de la réponse de stimulation évoquée et la durée de la 4-aminopyridine et l'activité épileptique analogue induite par la bicuculline. Cette étude a également révélé que les applications DCS cathodiques à 15 min causé la dépression à long terme dans la voie thalamocingulate. La présente étude examine les effets de DCS sur thalamocingulate plasticité synaptique et les activités de saisie comme aiguë. La procédure actuelle permet de tester les paramètres de stimulation optimale dont l' orientation, l' intensité du champ et de la durée de stimulation dans un modèle in vitro de la souris. En outre, la méthode peut évaluer les effets de DCS sur les activités de saisie comme corticales aux niveaux cellulaires et réseau.

Introduction

L’épilepsie est un trouble neurologique courant. Trente pour cent des patients atteints d’épilepsie souffrent de crises résistantes aux médicaments¹. La stimulation transcrânienne à courant continu (tDCS) offre une approche non invasive pour contrôler ou modifier les activités du réseau dans de grandes zones du cerveau, telles que les convulsions. Des études cliniques ont montré que la tDCS traite efficacement les crises réfractaires² et peut produire des effets suppressifs à court et à long terme sur les crises^{3 à 5}. Cependant, le mécanisme thérapeutique des actions de la tDCS n’est pas encore clair. Le modèle de coupe de cerveau présenté est une méthode in vitro pour étudier comment le mécanisme thérapeutique des actions de la tDCS modifie les symptômes des activités cérébrales de type convulsif. Par conséquent, pour obtenir ses effets optimaux, des paramètres de stimulation spécifiques, notamment l’orientation, l’intensité du champ et la durée de la stimulation, doivent être testés dans un modèle expérimental. Des études antérieures ont montré que l’orientation du champ électrique est importante pour obtenir des effets thérapeutiques⁶. Ainsi, il est possible de tester et d’organiser l’orientation des électrodes par rapport à la position de la tranche de cerveau testée.

L’épilepsie du lobe frontal et les crises du cortex cingulaire antérieur (ACC) sont souvent résistantes aux médicaments^7,8. Certaines études ont rapporté l’application de la tDCS dans le cortex cingulaire^9-11. Il a été démontré que la tDCS affecte la vigilance, la prise de décision et les émotions en modifiant les activités de l’ACC, et peut moduler l’excitabilité neuronale et l’activité convulsive dans cette région du cerveau¹². Par conséquent, les effets suppressifs de la tDCS sur les crises d’ACC pourraient être utiles pour le traitement clinique et l’évaluation de traitements alternatifs.

Le présent protocole décrit la préparation d’une électrode dans la chambre d’enregistrement pour la DCS d’une tranche de cerveau et son effet sur l’enregistrement de l’activité convulsive avec un réseau de multiélectrodes (MEA).

Protocol

Les procédures qui impliquent des sujets animaux ont été approuvés par le Comité d'utilisation des institutions de protection des animaux et, Academia Sinica, Taipei, Taiwan.

1. Préparation de la solution expérimentale et équipements pour multiélectrodes Tableau d'enregistrement

1. Préparer artificielle liquide céphalo - rachidien (aCSF; 124 mM de NaCl, KCl 4,4, 1 mM de NaH ₂ PO _3, 2 mM _MgSO4, CaCl2 ₂ mM, 25 mM NaHCO ₃ et du glucose 10 mM, à barboter avec 95% de O ₂ et 5% de CO _2).
2. Utilisez deux types de sondes MEA: 6 x 10 plane MEA et 8 x 8 MEA. La première sonde couvre la région qui comprend le cortex, striatum et le thalamus. Cette dernière sonde ne couvre que la région corticale.
3. Utilisez un amplificateur 60 canaux avec un filtre passe-bande située entre 0,1 Hz et 3 kHz à 1200 amplification. Acquérir des données à un taux d'échantillonnage de 10 kHz.
4. Placez deux fils d'argent AgCl revêtues dans la chambre de MEA pour DCS. Utilisez le AgCldes fils d'argent revêtues d'pour produire des champs électriques qui sont générés par un stimulateur isolé.
5. Placez une électrode en tungstène (diamètre, 127 um, longueur, 7,62 cm; 8 ° AC pointe effilée, la résistance, 5 MQ) pour la stimulation thalamique, et placer l'électrode de référence dans la chambre de MEA. Délivrer les courants de l'électrode en tungstène en utilisant un stimulateur isolé qui est commandé par un générateur d'impulsions.

2. Cerveau Slice Préparation

1. Utilisez mâles C57BL / 6J, âgées 4-8 semaines. Maison les animaux dans une pièce climatisée (21-23 ° C; 50% d'humidité, 12 h / 12 h cycle lumière / obscurité, allume à 08h00) avec un accès libre à la nourriture et de l'eau.
2. Prendre 250 ml aliquote de la LCRa qui a été préparé à l'étape 1.1, et le placer dans un bécher contenant de la glace. Dans le même temps, fourniture de gaz continu qui se compose de 95% O ₂ et 5% de CO _2.
3. Chirurgie
   1. Anesthetize l'animal avec 4% d'isoflurane dans un verreboîte pour environ 3 min. Une fois que l'animal atteint une profondeur de l'anesthésie chirurgicale (indiquée par l'absence d'une réponse à pincement de l'orteil), placez-le sur un plateau peu profond qui est rempli avec de la glace pilée, et retirer la tête à l'aide de ciseaux.
   2. Exposer le crâne, et couper le muscle restant. Ensuite, en utilisant rongeurs, décoller la surface dorsale du crâne du cerveau. Coupez les côtés du crâne en utilisant Rongeurs. Stériliser l'ensemble des instruments chirurgicaux avec une solution d'éthanol à 75%.
   3. Avec une spatule, couper les bulbes olfactifs et les connexions nerveuses le long de la surface ventrale du cerveau, et retirer le cerveau. Après la décapitation, transférer rapidement le cerveau dans un bécher rempli de LCRa oxygéné glacée.
4. Préparation de Medial Thalamus (MT) -ACC cerveau Slice
   Note: Préparer les tranches qui contiennent la voie de la MT ACC ^13.
   1. Main-couper le bloc de cerveau avec deux coupes sagittales 2,0 mm latéralement de la ligne médiane dans chaque hémisphèrepour afficher l'anatomie sous-corticale. Ensuite, faire deux coupes en angle. Faire la première coupe transversale parallèle au tube de fibre visible dans le striatum.
   2. Effectuer la seconde coupe transversale de la liaison entre le cervelet et le cortex visuel à mi-chemin entre la commissure antérieure et des voies optiques qui sont ventrale et parallèle à la voie de thalamocingulate.
   3. Fixer le bloc de cerveau à une plaque angulaire (~ 120 °) avec de la colle cyanoacrylate, et faire une coupe juste au-dessus du point de la voie de virage. Déplier la plaque, l'aplatir et le coller sur la scène de la chambre d'un vibratome.
   4. Faire médiales cerveau tranches de thalamus-ACC (500 um d'épaisseur), puis plongez-les dans oxygénés tranches aCSF.Transfer de glace-froid à la chambre d'enregistrement, et de garder à 32 ° C sous perfusion continue (12 ml / min) avec oxygénée LCRa pour 1 heure.

3. Préparation de Perfusion Chambre pour multiélectrodes Tableau d'enregistrement

1. Préparationde Perfusion Chambre
   1. Placer une sonde de MEA sur un système multi-canal, et utiliser deux tubes en polyéthylène séparés pour relier la sonde à une pompe péristaltique. Utilisez un tube pour guider le LCRa dans la chambre de la MEA et l'autre tube pour guider le LCRa hors de la chambre. Enfin, perfuser en continu avec la préparation à chaud (29-30 ° C) LCRa oxygénée (8 ml / min).
2. Transfert tranche de cerveau à MEA. Maintenez la tranche de cerveau sur la MEA en utilisant un coton-tige humide. Déplacez doucement la tranche de cerveau pour assurer l'ACC est orienté au-dessus des électrodes.
3. Utilisez des kits d'ancrage de tranche et les dispositifs de retenue pour presser la tranche de cerveau. Cette étape assure une bonne connexion électrique entre la tranche et les électrodes.

4. Génération de champs électriques par DCS

Note: La définition de l'orientation du champ électrique a été basée sur la direction de l'axe axodendritiques du CAC. Les orientations des dendrites et soma compartiments étaientconfirmée en utilisant Golgi coloration ^12.

1. Placer l'AgCl (définie comme étant l'anode) à proximité de l'ACC, et placer l'autre électrode (définie comme étant la cathode) distale par rapport à l'ACC. Enregistrer l'intensité du champ qui est généré par les deux orientations de champ (parallèles et perpendiculaires aux fibres axodendritiques ACC) par la MEA, et de livrer les courants des champs électriques à l'aide d'un stimulateur.
2. Fixer la distance des électrodes AgCl (environ 1,5-2 cm), et ajuster l'intensité du courant du stimulateur pour rendre le DCS entre 0,5 et 2 mA.

5. Électriquement induites réponses corticales synaptiques

Remarque: induire des réponses synaptiques dans le CPA par une stimulation électrique dans le terminal mobile, dans lequel un générateur de stimuli programmable électrique produit des impulsions de courant biphasées rectangulaires.

1. Répétez la section 3 ci-dessus.
2. Placer une électrode en tungstène dans le TM, et délivrer des impulsions du stimulateur à l'Thalrégion amic des tranches via des électrodes de tungstène bipolaires.
3. Utiliser différentes intensités de courant pour déterminer le seuil qui déclenche une réponse ACC. Ici, en utilisant une intensité de ± 150 pA et la durée de 200 microsecondes, ce qui induit une réponse maximale de 80% dans le CPA dans la plupart des tranches.
4. Déplacer l'électrode en tungstène le long de la voie de thalamocingulate (de MT à corps calleux) dans la tranche MT-ACC pour obtenir des profils de réponse optimaux.
5. Faire 10-20 balayages des réponses du CAC, et utiliser le logiciel en moyenne automatiquement tous les ACC évoquée par MT stimulation. Le résultat iss les réponses synaptiques dans ACC induites de MT stimulation par voie MT-ACC.

6. électrique induite par la saisie comme activité

Remarque: L'activité analogue à la saisie a été induite par l'application de la 4-aminopyridine (4-AP, 250 pM) et de la bicuculline (5 uM). Des études antérieures de contrôle du temps ont montré que les réponses maximales et stables sont apparus2-3 heures après l' application de la drogue ^14.

1. Répétez la section 5 ci-dessus.
2. Ajouter des médicaments à la solution de perfusion. Utilisez 4-AP (250 uM) et bicuculline (5 uM). Mélanger les médicaments de manière uniforme et continue perfusion pendant 2-3 heures.
3. Afin de faciliter l'activité de saisie-like, maintenir la pompe de perfusion à une vitesse relativement rapide de perfusion (8 ml / min), ce qui peut aussi aider à prévenir l'accumulation d'un gradient de pH.
4. Placez une électrode en tungstène dans la MT, et de fournir une stimulation électrique (150 pA, 200 microsecondes durée) pour obtenir des profils de réponse ACC.
5. Faire 10-20 balayages et la moyenne des réponses.
6. Remplacer la solution de perfusion avec des produits frais LCRa pour laver les médicaments. Répétez l'étape 6.5.

7. Test Effet de DCS sur les réponses corticales évoqués

1. Répétez les sections 3 et 4. Veiller à ce que les champs électriques uniformes sont générées par le passage des courants entre deux fils parallèles d'argent AgCl revêtus qui sont placés à l'intérieur du Mchambre EA. S'il n'y a aucun problème, la DCS reste entre 0,5 et 2 mA.
2. Éteignez le DCS, et placer une électrode en tungstène pour stimuler le thalamus (± 150 pA, 200 microsecondes durée). Pour obtenir des réponses synaptiques maximales dans le CAC, faire 10-20 balayages et la moyenne des réponses.
3. tourner simultanément sur le DCS (2 mV / mm Résistance à la DCS) et la stimulation thalamique (350 pA, 200 microsecondes durée). Évaluer les changements d'amplitude de la réponse de l'ACC de stimulation évoquée thalamique pendant DCS.
4. Désactiver le DCS et ajouter 4-AP (250 uM) et de la bicuculline (5 pM) à la solution de perfusion. Ensuite, attendre 2-3 heures. Quand les médicaments affectent la tranche de cerveau, la tranche produit des réponses de saisie corticales.
5. Faire 10-20 balayages de réponses ACC, puis mesurer l'amplitude et la durée des réponses de saisie électriques évoqués corticaux.
6. Après l'étape 7.5, tourner simultanément sur le DCS (2 mV / mm DCS force) et la stimulation thalamique (150 pA, 200 duratien microsecondes). Évaluer les changements dans l'amplitude et la durée des réponses de saisie corticales évoquées lors de l'application DCS.
7. Remplacer la solution de perfusion avec des produits frais LCRa pour laver les médicaments, et répétez les étapes 7.2 et 7.3.
8. Recueillir toutes les données d'enregistrement, et regrouper les données dans les différentes conditions expérimentales. Évaluer l'amplitude et la durée des réponses corticales de saisie dans différentes conditions expérimentales.

Analyse 8. Données

1. Utilisez un logiciel (par exemple, le logiciel Rack MC) à la moyenne automatiquement les réponses enregistrées, et d' exporter les données brutes à une feuille de calcul. Analyser l'amplitude et la durée des données brutes et de générer des données de couleur.
2. Pour détecter les événements de saisie oscillatoires, utiliser un logiciel pour mesurer la valeur de référence et les écarts-types (SD). Set 3 SD du niveau de bruit que le seuil. Amplitudes des pics lors d'un événement d'oscillation qui dépassent ce seuil sont détectent automatiquemented.
3. Effectuer l'analyse statistique en utilisant ' t -test de Student.
4. Mesures rapides et analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) des résultats dans le texte en tant que moyenne ± SE, avec n indiquant le nombre de tranches étudiées ^12.

Results

Préparation de la configuration Thalamocingulate Slice et système d'enregistrement MEA

La tranche MT-ACC de souris est une préparation de tranche spéciale qui permet l' exploration des propriétés électrophysiologiques de la voie de thalamocingulate. Figure 1A montre la façon dont la tranche MT-ACC a été préparé. Le cerveau de la souris a été rapidement enlevé et conservé dans un endroit frais LCRa oxygéné

Discussion

Dans la présente étude, les effets de la durée et de l'orientation du DCS sur l'activité de saisie de type ACC ont été testés. Pour obtenir des données stables dans des tranches de cerveau de souris, comment garder l'intégrité de la voie MT-ACC et pour éviter tout dommage, il est essentiel, en particulier les étapes dans lesquelles deux coupes ventrales angle et une coupe dorsale du cortex sont faites. De plus, le temps de préparer la tranche de cerveau peut également affecter l'activité de la tranche de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
fort :
Isoflurane	Halocarbon Products Corporation  ;	NDC 12164-002-25	4
%Nom	Company	Numéro de catalogue	Comments
aCSF (total :1 L) :
D(+)-Glucose	MERCK	1.08337.1000	10 mM
Hydrogénocarbonate de sodium	MERCK	1.06329.0500	25 mM
Chlorure de sodium	MERCK	1.06404.1000	124 mM
(+)-L-ascorbate de sodium, >=98 %	SIGMA	A4034-100G	0,15 g/2 c.c
Sulfate de magnésium anhydre, ReagentPlus	SIGMA	M7506-500G	2 mM
Chlorure de calcium dihydraté	MERCK	1.02382.1000	2 mM
Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté	MERCK	1.06346.1000	1 mM
Chlorure de potassium	May & Baker LTD Dagenham Angleterre	MS 7616	4.4 mM
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Drugs :
(+)-Bicuculline	TOCRIS	0130	5 µ ; M dans aCSF
4-Aminopyridine	TOCRIS	0940	250 & micro ; M dans aCSF
Name	Company	>Numéro de catalogue	Comments
Brain slice Préparation :
Vibratome Vibratome		Series 1000	Découpage de bloc en 500 µ ; m tranches épaisses
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
MEA system :
Array) : 6 x 10 systèmes multicanaux MEA planaires		60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	diamètre de l’électrode, 30 & micro ; m; espacement des électrodes, 500 & micro ; m; impédance, 50 k&Omega ; à 200 Hz
Sondes multiélectrodes (MEA) : 8 x 8 MEA  ;	Ayanda Biosystems	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	électrode de forme pyramidale ; diamètre, 40 & micro ; m; hauteur de pointe, 50 & micro ; m; espacement des électrodes, 200 & micro ; m; impédance, 1 000 k&Omega ; à 200 Hz
Un amplificateur à 60 canaux a été utilisé avec un filtre passe-bande réglé entre 0,1 Hz et 3 KHz à une amplification de 1 200X	Systèmes multicanaux	MEA-1060-BC
MC Logiciel de rack à une fréquence d’échantillonnage de 10 KHz	Systèmes		Logiciel pour la collecte de données et les enregistrements
Contrôle d’un générateur d’impulsions	Systèmes multicanaux	STG 1002
Kits d’ancrage de coupe et fixations	Warner Instruments	SHD-26H/10 ; WI64-0250
Pompe péristaltique-minipuls3	Gilsom	MINIPULS3	débit de perfusion : 8 ml/min
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système de stimulation :
Stimulateur isolé	A-M Systems	Model 2100	intensité de ± ; 350 &mu ; A, durée de 200 &mu ;
sec Électrode de tungstène	A-M Systems	575300	placée dans le thalamus