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Article de méthode

Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode

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DOI :

10.3791/53712

⸱

28 mars 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

Dans cet article

Résumé

Ici, nous détaillons des protocoles spécifiquement conçus pour surveiller les défauts morphogéniques qui se produisent pendant les phases précoces et tardives de l’élongation embryonnaire du nématode Caenorhabditis elegans. En fin de compte, ces protocoles sont conçus pour identifier les gènes qui régulent ces phases et pour caractériser leurs besoins différentiels le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Résumé

La dissection des voies de signalisation qui contrôlent l’altération des processus morphogéniques au cours du développement embryonnaire nécessite des mesures robustes et sensibles. L’allongement embryonnaire du nématode Caenorhabditis elegans est un stade tardif de développement consistant en l’allongement de l’embryon le long de son axe longitudinal. Cette étape de développement est contrôlée par la communication intercellulaire entre les cellules hypodermiques et les muscles sous-jacents de la paroi corporelle. Ces mécanismes de signalisation contrôlent la morphologie des cellules hypodermiques en remodelant le cytosquelette et les jonctions cellule-cellule. La mesure de la létalité embryonnaire et de l’arrêt du développement aux stades larvaires, ainsi que l’altération du cytosquelette et des structures d’adhésion cellule-cellule dans les cellules hypodermiques et musculaires, sont des phénotypes classiques qui sont utilisés depuis plus de 25 ans pour disséquer ces voies de signalisation. Des études récentes ont nécessité la mise au point de nouvelles mesures ciblant spécifiquement l’élongation précoce ou tardive et caractérisant les défauts morphogéniques le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés permettant de mesurer avec précision la longueur et la largeur des embryons allongés ainsi que la longueur des larves synchronisées. Ces méthodes constituent des outils utiles pour identifier les gènes contrôlant l’élongation, pour évaluer si ces gènes contrôlent à la fois les phases précoces et tardives de ce stade et sont nécessaires uniformément le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Introduction

Depuis près de 50 ans , les nématodes Caenorhabditis elegans est établi comme un modèle puissant pour étudier des questions importantes dans le développement, la neurobiologie, l' évolution, les interactions hôte-pathogène, etc. 1 La force de ce modèle dans l'étude du développement réside dans: son cycle de vie court de 3 jours; la facilité avec laquelle ces animaux peuvent être génétiquement modifiées; sa transparence qui permet l'observation du déplacement de la cellule et de la morphologie des animaux vivants et de son développement qui est la plupart du temps extra-utérine. Les stades de développement du nématode impliquent l'embryogenèse et quatre stades larvaires (L1 à L4), suivie par l'âge adulte. Au cours du développement embryonnaire, épidermique morphogenèse a attiré une attention considérable pour sa capacité à permettre une meilleure compréhension de la façon dont épithéliales cellules migrent en tant que groupe, comment ils réorganisent leurs jonctions et modifier leur morphologie individuelle, ainsi que leur positionnement relatif dans un épithélium fonctionnel.Epidermal morphogenèse est divisé en quatre étapes: intercalation dorsale consistant en la réorganisation des cellules épidermiques dorsale, appelée l'hypoderme; enceinte ventrale, consistant à la migration des cellules hypodermiques ventrale vers la ligne médiane ventrale enrobant ainsi l'embryon dans une monocouche de cellules épithéliales; début et fin de l'allongement transformer l'embryon en forme de haricot en larves vermiform. Après morphogenèse, embryon éclosent et les larves L1 commencent à se nourrir en utilisant des bactéries disponibles dans leur environnement immédiat.

allongement embryonnaire est donc une phase tardive du développement embryonnaire. Il est constitué de l'extension de l'embryon, le long de son axe longitudinal, et une réduction de son diamètre transversal. Cela implique une modification spectaculaire de la forme des cellules hypodermiques. Allongement est divisé en un début et une phase tardive. La première phase commence au stade de la virgule et se termine lorsque les muscles corps à parois commencent à contracter à l' étape 1.75 fois dans wild type ( en poids) des embryons - correspondant à des embryons qui sont 1,75 fois la longueur par rapport à des embryons non-allongée. Morphogenèse se produisant à ce stade sont principalement motivés par la contraction des faisceaux filamenteux d'actine (FB) situés au pôle apical des cellules hypodermiques qui conduisent leur allongement le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon 2. Contraction de FBs est le contrôle par phosphorylation des chaînes de myosine-lumière par trois kinases LET-502 / ROCK, MRCK-1 et PAK-1 5. La phase tardive de l'allongement, commence lorsque les muscles corps à parois deviennent fonctionnels et commencent à contracter. Elle implique la signalisation de transduction mécanique des muscles corps de paroi aux cellules dorsale et ventrale hypodermiques et se termine lorsque les animaux éclosent 3.

les défauts de Allongement sont généralement caractérisés par le pourcentage d'animaux qui meurent comme des embryons (létalité embryonnaire; Emb) et ceux d'arrêter leur développement en tant L1 larves (larvaire arrestation phénotype; Lva) et étant sensiblement plus courte que poids. Identification de la scène de l' arrestation de développement nécessite une observation microscopique des embryons morts et arrêté Larves 3-6.

Il a été récemment montré que plusieurs gènes, comme le régulateur / Cdc42 Rac et effecteur pix-1 et pak-1, contrôlent la morphogenèse au cours précoce et tardive allongement 3,7. Nous avons récemment montré que morphogenèse diffèrent selon l'axe antéro-postérieur de l'embryon lors de l' allongement précoce 3 7. Ces résultats ont motivé l'élaboration de nouvelles mesures ciblant spécifiquement les étapes d'allongement précoce ou tardive et d'autres mesures permettant la caractérisation de la morphologie des embryons le long de leur axe antéro-postérieur lors de l'allongement précoce.

Ces nouveaux procédés consistent à mesurer la longueur des embryons au début et à la fin de l'allongement précoce, ainsi que la largeur de leur ilannonces et les queues. 7 Deux protocoles ont également été développés pour mesurer la longueur des larves nouvellement écloses, synchronisé à l' étape L1 7.

Les coquilles des embryons de les protéger contre le traitement d'hypochlorite alcalin alors que les larves, les adultes et les bactéries présentes dans les milieux de culture sont dissous par le traitement. Ce traitement est ensuite utilisé pour purifier les embryons provenant d' une population non synchronisée contenant une majorité des adultes bien nourris 8. La restriction alimentaire est utilisé pour synchroniser les larves nouvellement écloses. Mesurer la longueur de ces larves est ensuite utilisé pour détecter des défauts d'allongement. Cette mesure est préférable à la mesure des larves arrêtés sur des plaques de culture parce que les larves qui éclosent de non-entièrement embryons allongés peut récupérer à "longueur normale" lors de l'alimentation, mais maintiendra leur taille réduite lors de son arrestation en l'absence de nourriture.

Ici, nous présentons des protocoles détaillés permettant la mesure du chierngth d'allonger les embryons ainsi que la largeur de la tête et la queue à l'aide de time-lapse DIC microscopie et l'analyse de l'image (Protocole 1). Nous fournissons également des protocoles détaillés pour mesurer la longueur des larves synchronisée par analyse d'image (protocole n ° 2) et Flow-cytométrie (protocole n ° 3).

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Protocole

1. Caractérisation des défauts Allongement précoce dans WT et mutantes Animaux

  1. Embryons de montage pour Normarski DIC Microscopie
    1. Préparer les médias et le matériel de culture suivants:
      1. M9 tampon, dissoudre 12,8 g / l de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O 3 g / KH 2 PO 4, L 5 g / L de NaCl, 0,25 g / l MgSO 4 • 7H 2 O dans de l' eau distillée et l' autoclave pour stériliser.
      2. Des plaques NGM, dissoudre 3 g / L de NaCl, 16 g / l d' agar, 2,5 g / l bactopeptone dans ddH 2 O. Autoclaver et ajoute 1 mM de MgSO 4, 1 mM CaCl2, 1 mM de tampon phosphate et de 5 ug / ml de cholestérol. Verser 6 ml de NGM par boîtes de 60 mm. Laisser le milieu se solidifier pendant 24 heures à température ambiante. Ajouter quelques gouttes d'une culture saturée de E. bactéries OP50 coli cultivées dans du bouillon de Luria (LB). Laissez les bactéries se développent pendant 48 heures et de stocker les plaques à 4 ° C.
      3. Pour générer le pi verck, monter un fil de platine 0,01 "de diamètre sur une pipette Pasteur courte. Fixer le fil de platine à l'extrémité de la pipette de verre en chauffant cette extrémité avec un brûleur de benzène. Aplatir l'extrémité du fil pour générer une sorte de pelle.
    2. Cultivez la souche ver sur 60 mm plaques NGM avec OP50 à 20 ° C.
      NOTE: allèles thermosensibles peuvent exiger de plus en plus les animaux à des températures non permissives jusqu'à 25,5 ° C. Les plaques doivent contenir beaucoup de jeunes adultes et encore beaucoup de nourriture afin de poursuivre les protocoles.
    3. Placez une lame de microscope entre deux lames d'espacement couvertes par deux couches de ruban de masquage (figure 1A).
    4. Préparer une solution d'agarose à 3% (poids / volume) dans du tampon M9 en dissolvant 0,6 g de poudre d'agarose dans 20 ml de tampon M9 par chauffage au micro-ondes pendant 30 secondes. Laisser la solution refroidir pendant 5 min.
      NOTE: La solution d'agarose peut être utilisé pendant quelques jours après la fusion dans un four micro-ondes. Ilpeut également être aliquotés et conservés à 4 ° C pendant une semaine.
    5. Déposer une goutte de solution d'agarose à 3% à chaud sur la lame de verre située entre les deux diapositives d'espacement. Eviter la formation de bulles.
    6. Couvrir rapidement l'agarose avec une autre diapositive comme le montre la figure 1B et appuyez doucement. La lame supérieure va aplatir la goutte d'agarose et générer un tampon avec l'épaisseur de deux couches de ruban adhésif.
    7. Permettre à l'agarose se solidifie pendant au moins 1 minute à la température ambiante ou jusqu'à ce que les embryons sont prêts à être transférés dans le tampon.
    8. Avec une pointe à vis sans fin, transférer 20 à 30 jeunes adultes bien nourris de la NGM-plaque dans un tube de micro-centrifugeuse contenant 400 pi de tampon M9.
    9. Autoriser les vers dans les sédiments par gravité pendant environ 5 minutes et retirer le surnageant à l'aide d'une micropipette. Cette étape vise à éliminer le maximum de bactéries cueillies avec les nématodes.
    10. Ajouter 200 pi de tampon M9 à chaque tube.
    11. L'utilisation d'un pip Pasteurette, transférer le contenu du tube (tampon et nématodes) à un verre de montre.
    12. Utilisez un ou deux 25G 5/8 "aiguilles pour couper les animaux à la section du milieu du corps (entre la spermathèque et la vulve).
      REMARQUE: une lame de scalpel peut également être utilisé comme une alternative à l'aiguille (s). Pour ce faire, sur les nématodes de natation et peut nécessiter une certaine pratique. L'idée est d'utiliser des aiguilles comme des ciseaux ou un couteau selon le nombre d'aiguilles sont utilisées. Une fois que les animaux sont coupés ouverte, hermaphrodites libèrent leurs embryons dans le tampon.
    13. Concentrer les embryons au centre de la glace de la montre par la génération d'un tourbillon circulaire au sein du liquide.
    14. Retirer la plupart des M9 du verre de montre à l'aide d'une micropipette. Laissez environ 30 pi de M9 avec les embryons.
    15. Retirer la lame recouvrant le coussin agarose (figure 1B) en le faisant glisser le pad.
    16. Couper le tampon avec une lame de rasoir afin d'être en mesure de couvrir complètement avec une lamelle (La figure 1C).
    17. En utilisant une pipette Pasteur, transférer tous les embryons (et les débris de ver) sur le tampon d'agarose.
    18. Groupe les embryons au centre du pavé en utilisant un cil collé à l'extrémité d'une pointe utilisée pour 200 micropipettes ul.
    19. Lentement placer une lamelle sur le pad en évitant la formation de bulles et de le sceller.
      NOTE: Plusieurs scellants peuvent être utilisés. Nous utilisons la gomme trouvés dans l'art et les magasins d'artisanat (généralement utilisé comme masquage de la gomme pour la peinture aquarelle) dessin. Cette gomme est utilisée parce qu'elle est hydrophile et se solidifie suffisamment rapide et ne sont pas toxiques pour les vers. Les diapositives peuvent également être scellé avec du vernis à ongles ou valap (mélange composé de vaseline, de lanoline et la cire de paraffine).
    20. Laisser le dessin sec de gomme pendant environ 15 min.
  2. Enregistrement précoce Allongement utilisant quatre dimensions Normarski DIC Microscopie
    NOTE: L'objectif de cette étape est d'enregistrer un allongement début de la virgule au début de la fin de l'allongement- Défini comme le moment où les muscles corps à paroi commencent traitance. Nous visons également à enregistrer plus d'un embryon à l'époque. Huit heures d'enregistrement sont généralement nécessaires pour enregistrer un allongement tôt pour un groupe d'embryons non synchronisés.
    1. Placez le-coulisseau monté sur la scène d'un microscope. Assurez-vous que le microscope est équipé de 10X et 60X objectifs, ainsi que des lentilles DIC, prisme, appareil photo et le logiciel de capture permettant la microscopie time-lapse et génération de Z-piles (automatisé Z-plateforme).
      REMARQUE: veiller à ce que la température est constante entre 20 et 23 ° C dans la salle de microscopie. Une chambre de chauffage et de refroidissement peut être nécessaire sur la platine du microscope, en particulier lors de l'utilisation des mutants thermosensibles.
    2. Identifier un groupe d'embryons à des stades pré-morphogenèse en utilisant l'objectif 10X.
    3. Une fois localisé, glisser l'objectif 10X et ajouter une goutte d'huile à immersion sur la diapositive.
    4. Utilisation de l'objectif 60X, identifier le haut et le bas de l'embryos pour configurer les paramètres d'imagerie Z-stack.
      REMARQUE: Ne pas hésiter à définir le Z-pile supérieure à l'épaisseur des embryons. Régler la distance entre deux plans adjacents de 0,8 um. Cela permettra de couvrir la profondeur totale des embryons en 35 à 50 Z-plans.
      NOTE: Si le microscope contient une plate-forme xy automatisé, les embryons situés à différents endroits du pad peuvent être enregistrées simultanément. Pour ce faire, fiche coordonnées xy de chaque emplacement sur le pad que vous souhaitez analyser au cours de l'expérience. Assurez-vous de sélectionner le xy lors du réglage du paramètre d'enregistrement et suivez le reste du protocole comme indiqué. Thin Z-tronçonnage de l'embryon lors de l'enregistrement ne doit pas nécessairement pour les mesures décrites dans le présent protocole. Enregistrement du développement embryonnaire des animaux wt et mutantes avec la résolution maximale est cependant une bonne pratique afin de construire une bibliothèque d'enregistrements capables de supporter des analyses supplémentaires.
    5. Ensemblele time-lapse avec des intervalles de 2 min entre deux acquisitions durant 8 heures.
      NOTE: Le temps d'exposition dépendra de l'intensité lumineuse fixée pour le microscope. Le mouvement des cellules lors de l'allongement précoce est très lent; l'exposition-temps pourrait être d'environ une image par seconde ou moins. Si les embryons sont à des étapes de morphogenèse précoce (dorsale d'intercalation, enceinte ventrale), l'allongement précoce serait enregistré à 1 h. Assurez-vous que l'obturateur de lumière est fermé entre chaque acquisition.
    6. Exécutez l'acquisition et l'enregistrer.
  3. Mesure des défauts Allongement précoces à l' aide de l' analyse d'image
    1. Logiciel Fiji-ImageJ ouverte ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
    2. Dans le menu, sélectionnez Analyser / Set Mesures, sélectionnez Perimeter. Pour chaque embryon, d' ajuster la barre Z-échelle pour se concentrer sur le pharynx de l'embryon , comme représenté sur la figure 2A. Cela garantira que vous vous concentrez sur le centre de l'embryon.
    3. Pour mesurer la longueur de l'embryon, ajuster la barre d'échelle de temps pour avoir l'embryon d'intérêt au début du début d' allongement (stade de la virgule; Figure 2A). Notez l'heure ( «Time-début").
    4. Choisissez l'outil de ligne segmenté. Tracez une ligne segmentée de la pointe de la bouche de l'embryon jusqu'à la pointe de sa queue suivant la ligne médiane de l'embryon (figure 2A). Utilisation de l'onglet de menu Analyser / Mesure, obtenir la longueur de la ligne tracée ( "Longueur début").
    5. Répétez cette mesure pour le même embryon, à la fin de l'allongement précoce (moment où les muscles commencent à contracter). Notez le temps ( "Time-end") et de mesurer la longueur de l'embryon ( "Longueur-end") tel que décrit ci - dessus (figure 2B).
    6. Calculer la durée (D) de l'allongement précoce et l'augmentation de la longueur (L) au cours de cette étape comme suit:
      D = "Time-end" - "Time-début"
      & #160; L = "Longueur-end" - "Longueur-début"
    7. Pour mesurer la largeur de la tête, ajustez la barre d'échelle de temps pour avoir un embryon au stade de l'intérêt (stade 1,2 fois ou à la fin de l'allongement précoce). Choisissez l'outil en ligne droite. Dessiner la ligne médiane transversale (axe dorso-ventral) de la tête. Cette section est la partie la plus épaisse de l'embryon (figure 2C). Utilisation du menu Analyser / Mesurer, obtenir la longueur de la ligne correspondant à la largeur de la tête.
    8. Au même point de temps, répétez cette étape en traçant la ligne médiane transversale de la queue ( à mi-ligne entre la vanne intestinale et la pointe de la queue; la figure 2C) et de le mesurer pour obtenir la largeur de la queue.
      REMARQUE: Utilisez cette mesure pour comparer les embryons au même stade dans les différents phénotypes. Pour assurer la reproductibilité de cette mesure, assurez-vous de trouver un emplacement situé autour de la ligne médiane de la queue de l'animal qui peut facilement être reconnu d'un animal à unnother.
    9. Pour calculer la tête à la queue rapport de largeur, diviser la largeur de la tête par la largeur de la queue.

2. Caractérisation des défauts de Allongement tardif Utilisation de l'analyse d'image

  1. Synchronisation de L1 Larves en utilisant Alkaline traitement hypochlorite
    1. A partir d'une plaque non affamé mm 60 contenant de nombreux adultes gravides, de recueillir tous les vers dans un tube de micro-centrifugeuse en lavant les nématodes de la plaque avec 1 ml de tampon M9 à l'aide d'une pipette Pasteur.
    2. nématodes de sédiments à 3500 xg pendant 3 min à température ambiante et retirer le surnageant à l'aide d'une micropipette sans perturber le culot à vis sans fin.
    3. Ajouter 1 ml de solution d'hypochlorite à chaque tube (0,4 M hypochlorite, NaOH 0,5 M) et agiter pendant 3 min.
      REMARQUE: une solution d'hypochlorite alcaline doit être fraîchement préparée et les embryons dans cette solution doit être agitée doucement mais de manière continue pour optimiser la dissolution des adultes et l'oxygénation de l'embryos. Après 3 min agitation, la plupart des adultes devraient libérer leurs œufs dans la solution.
    4. Spin à 3500 xg pendant 3 min à température ambiante et rapidement éliminer le surnageant à l'aide d'une micropipette sans perturber le culot.
    5. Laver quatre fois avec 1 ml de tampon M9 suivie d'une centrifugation à 3500 g pendant 3 min.
    6. Après le quatrième lavage, retirer le surnageant et resuspendre oeufs dans 700 pi de tampon M9 sans pipetage les œufs (comme les oeufs colleraient à la matière plastique de la pointe).
    7. Tape le tube sur un agitateur orbital 3 mm placé dans un incubateur à la température de croissance approprié et agiter à 600 tours par minute pendant la nuit.
  2. Mesure de la longueur de Synchronized Larves
    1. Centrifugeuse arrêté larves L1 à 3500 xg pendant 3 min à température ambiante et retirer le surnageant. Remettre en suspension les larves dans 100 ul de tampon M9 et de les transférer sur un tampon d'agarose à l'aide d'une pipette Pasteur (tampons d'agarose à préparer doivent êtred tel que décrit à la section 1.1.2 à 1.1.8). Placez une lamelle sur le pavé.
      REMARQUE: Le tampon n'a pas besoin d'être scellé avec de la gomme pour cette expérience qui implique l'acquisition courte.
    2. Utilisez un objectif et le contraste de phase illumination 10X pour mesurer la longueur des larves si un appareil photo haute résolution est utilisé. Augmentez l'intensité de la lumière pour être en mesure de capturer des images en quelques millisecondes et par conséquent obtenir une image claire des larves (figure 2D).
      REMARQUE: Alors que les poubelles de nage des larves sont réduites par le tampon d'agarose, ils sont toujours en mouvement. Par conséquent, l'enregistrement rapide est essentielle pour obtenir une image claire.
    3. Ouvrez Fidji-ImageJ et répétez l'étape 1.3.1. Pour mesurer la longueur des larves, choisissez l'outil de ligne segmenté. Tracez une ligne segmentée de la pointe de la tête jusqu'à la pointe de la queue qui suit la ligne médiane des larves (figure 2D, panneau de droite).
    4. Utilisation du menu Analyse / Mesure, obtenir la longueur de laligne tracée correspondant à la longueur des larves au micromètre.

3. Caractérisation des défauts de Allongement tardif par cytométrie en flux

  1. Synchroniser larves
    1. Purifier embryons en utilisant le traitement à l'hypochlorite alcaline comme décrit dans la section 2.1 de plein plaques de 100 mm de jeunes adultes bien nourris et laissez la trappe de l'embryon et l'arrestation L1 dans un tampon M9 pendant 16 à 24 heures à 20 ou 25,5 ° C en fonction de la souche analyser.
      NOTE: Une assiette pleine d'adultes bien nourris par souche est suffisante pour l'analyse décrite ci-dessous.
  2. Calibrage de la Sorter Worm
    NOTE: La cytométrie de flux utilisé ici est un flux de particules grande cytomètre (ci-après dénommé le trieur à vis sans fin). Le trieur à vis sans fin comprend une nm laser à diode rouge 670, qui est situé en face d'un détecteur d'extinction. Le trieur de ver contient aussi un laser argon multi-ligne pour l'excitation fluorescente. Les sles instruments de tandard ont trois tubes photomultiplicateurs détecteurs (FPM) de fluorescence utilisés pour détecter les émissions de fluorescence dans les régions vertes, jaunes et rouges du spectre. Dans le protocole décrit ici, TOF sera utilisée pour mesurer la taille des larves, le canal rouge sera utilisé pour identifier des vers morts qui seront colorées avec l'iodure de propidium (PI). GP (General Purpose) Haute Fluorescence Particules de contrôle utilisé pour étalonner l'instrument et comme contrôle interne dans notre expérience affichage haute fluorescence en vert, jaune et rouge. Ils seront les seuls objets dans l'échantillon analysé avec une grande émission détectée dans le canal vert et seront ensuite identifiés sur la base de cette caractéristique.
    NOTE: Vivre les animaux sont identifiés sur la base de l'absence de fluorescence dans le canal Vert et Rouge, ainsi que sur la TOF. émission autofluorescents de l'intestin des larves est pas détectable au stade L1.
    1. Allumez le bloc laser, l'ordinateur, l'un compresseurd l'instrument ver trieuse. Appuyez sur la touche START sur le logiciel trieur de ver ouvert comme indiqué dans le manuel d'instruction de l'instrument.
    2. Observez la fenêtre pop-up de commande de laser à argon. Sélectionnez le mode RUN et attendez que les puissances laser atteignent 10 ± 1 mW. Sélectionnez FAIT sur la fenêtre de contrôle de laser.
    3. Fixer la gaine et l'échantillon a des pressions allant jusqu'à 5,10 ± 0,02 et 5,51 ± 0,01, respectivement. Laisser la pression à équilibrer pendant au moins 15 min, puis cliquez sur la case à cocher OK PRESSION.
      NOTE: Le débit dépend de la gaine et les pressions échantillons.
    4. Assurez-vous d'éliminer toutes les bulles présentes dans les tubules de canaux d'écoulement entre la coupe de l'échantillon et la chambre d'analyse. Pour ce faire, cliquez sur ACQUIRE et secouez doucement le tubule jusqu'à ce qu'aucune bulle sont acquises (comme on le voit dans la fenêtre d'acquisition).
    5. Configuration de tous les paramètres de mesure et de détection de la manière suivante fluorescent et TOF:
      1. Définissez les échelles pour TOF, Ext, Vert, Jaune et Rouge256. gain de Set comme décrit dans le tableau 1. Control Set PMT à 700 pour le vert et jaune et à 900 pour Red.
        REMARQUE: Les deux filtres d'excitation sont disponibles (488 nm et 514 nm) et peut être utilisé pour exciter soit la protéine fluorescente verte (GFP) ou la protéine fluorescente jaune (YFP) ou tout fluorochromes excités à ces longueurs d'onde avec le laser à argon multiligne. Des filtres appropriés doivent être insérés dans la chambre de l'équipement de filtre. Nous avons utilisé le filtre 488 nm pour l'expérience suivante.
    6. Pour étalonner le trieur à vis sans fin, sélectionnez "particules de commande Exécuter" dans le menu de l'outil. Mettre 20 ml de 1x GP (But général) Particules de contrôle de haute fluorescence dans la tasse (ces particules sont des particules fluorescentes de taille précise, vendus par le fabricant de cytométrie de calibrer leur instrument).
    7. Cliquez sur le bouton ACQUIRE pour commencer la gaine et l'écoulement de l'échantillon.
      REMARQUE: Attendez une moyenne liée à la distribution contrôle des particules de 21 ± 6 et acoefficient de variation autour de cette moyenne (CV) ≤11. Si le CV est> 11 et la moyenne est> 27 essayer de nettoyer les tubules en cliquant plusieurs fois sur le bouton propre ou en effleurant le canal d'écoulement.
  3. Acquisition de TOF animale
    REMARQUE: la lumière diffuse quand un objet passe dans la cellule d'écoulement entre la source laser et le détecteur d'extinction. Le temps qu'il faut pour que la lumière soit diffusée par l'objet de vol (heure de vol, TOF) est utilisé pour mesurer la longueur axiale de l'objet. La mesure de la lumière masquée par l'objet (extinction, EXT) est utilisée comme mesure de l'opacité / ou de densité optique.
    1. Placer 10 ul de type sauvage synchronisé ( en poids) L1 dans un verre de montre et estimer le pourcentage de morts-oeufs en utilisant un microscope à dissection.
      NOTE: Synchronisé L1 affichage haute Emb (supérieure à 20%) en poids ne doit pas être utilisé pour une analyse plus approfondie.
    2. Transfert synchronisé L1 de la microcentrifugeuse (anviron 700 pi de M9 contenant L1) à un tube conique de 15 ml. Ajouter l'iodure de propidium (PI) à une concentration finale de 10 pg / ml (dilution 1/100 e d'un / ml de solution mère à 1 mg) et incuber pendant 30 min à température ambiante.
      NOTE: Les œufs morts et les larves seront colorées en utilisant PI et détectés comme des objets très fluorescentes utilisant le canal rouge.
    3. Ajouter 10 ml de tampon M9 pour diluer les populations colorées. Prendre 5 ml de populations dilués et les diluer quatre fois par l'addition de 15 ml d'M9. Placez cette dilution dans l'échantillon tasse.
    4. Exécutez le flux d'échantillon en cliquant ACQUIRE et observer le débit.
      NOTE: Afin d'avoir une mesure précise, le débit doit rester entre 15 et 25 objets / sec.
    5. Si nécessaire, ajuster la quantité d'animaux dans la coupe pour atteindre le débit souhaité.
      REMARQUE: La volonté de débit dépend de la pression et de l'échantillon (gaine) qui sont constantes, comme indiqué dans 3.2.3 et la concentration des larves in la tasse. Si le débit est supérieur à 25 objets / sec ajouter un peu de mémoire tampon dans la tasse. Si elle est inférieure à 15 objets / sec ajouter L1 concentré (étape 3.3.3) dans la tasse.
    6. Une fois la concentration appropriée de l' objet est atteint, d' évaluer le volume dans la tasse et ajoutez 1/4 ème de ce volume en solution haute Fluorescent GP de contrôle des particules 4x.
    7. Réglez le paramètre de déclenchement et le tri. Pour ce faire, cliquez sur «Gating» dans le menu et sélectionnez 'TOF vs.' et «vert». Cliquez sur 'Tri' dans le menu et sélectionnez 'TOF vs.' et 'Red'. Gating et graphiques de tri apparaissent alors comme le montre la figure 3A.
      NOTE: Cela permettra la visualisation des particules de contrôle (émission en vert et rouge), animaux morts colorés par PI et des bulles (émission en rouge et non vert) et les animaux vivants (pas d' émission dans les canaux ni vert , ni rouge) (figure 3A ).
    8. Exécutez l'expérience en cliquant sur ACQUIRE.
      NOTE: Pour identifier les petites différences de taille entre les larves, d'analyser près de 10.000 objets, donc environ 8000 animaux. Arrêtez l'expérience et d'exporter les données sous format .txt en cliquant sur STORE.
  4. Mesure de la taille relative de la vie Animaux en synchronisé Populations
    1. Ouvrez le fichier .txt à l'aide d'un logiciel capable de gérer de grandes tables de données.
    2. A partir des objets analysés extraire les valeurs TOF associées aux particules de contrôle qui sont caractérisés par l'émission dans le canal vert supérieur à 100 unités arbitraires (cette valeur est fonction des paramètres définis dans la section 3.2.5). Créer une nouvelle colonne et l'appeler «particules de contrôle». Créer une colonne contenant tous les autres objets, à l'exception des particules de contrôle appelé «échantillon». NOTE: l'émission de fluorescence de nouveaux besoins en matière de lots de particules à vérifier avant de commencer les acquisitions. Cela va régler le seuil fluorescent permettant l'identification departicules de contrôle sur CN1.
    3. Pour chaque souche analysée identifier la partie de l'expérience dans laquelle la vitesse d'écoulement a été modifié (en raison de la présence d'un bouchon d'œufs par exemple). Faire cela:
      1. Tracer la TOF des «particules de contrôle» pour chaque échantillon en tant que facteur de temps (figure 3B).
      2. Tracer la courbe de tendance linéaire à l'aide de l'outil de ligne de tendance et d'afficher l'équation sur le graphique.
        NOTE: Le TOF de particules de contrôle doit être constante au fil du temps (ligne horizontale, figure 3B). Compte tenu de l'équation de la courbe de tendance linéaire tracée sur les données y = ax + b, veiller à ce que la valeur «a» est plus faible que 10 -4. Toutes les mesures effectuées dans les tranches de temps présentant une rupture dans l'alignement de contrôle des particules doivent être éliminées de l'analyse.
    4. Retirez les embryons morts et des bulles (émission supérieure à 15 dans le rouge), ainsi que de petits débris et de grandes prises d'œufs (TOF inférieure à 10 et de hauteer à 70 respectivement) de la mesure "de l'échantillon.
    5. Tracer la distribution "particules de contrôle» pour chaque souche analysée. Comme on le voit sur ​​la figure 3C ces distributions devraient recouvrir presque parfaitement. Ceci assure que les mesures TOF obtenus pour différentes souches peuvent être comparés. REMARQUE: la normalisation des éléments de l'échantillon sur TOF particules de contrôle peuvent être utilisées si les répartitions des particules de contrôle dans un échantillon ne se superposent pas avec celle d'échantillons témoins. TOF Normalized sont calculés comme suit:
      1. Normaliser TOF pour le génotype G = (échantillon TOF G) / ( «contrôle particule 'TOF moyenne G) x (moyenne' contrôle des particules 'TOF pour poids) où poids est l'échantillon témoin.
    6. Tracer la distribution Larves TOF pour chaque souche , y compris l' échantillon de contrôle, dans notre cas , en poids des animaux (Figure 3D). Mesurer la moyenne et l'erreur standard de la moyenne (SEM) pour chaque population ( Figure 5A et B).

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Résultats

Head-, caudales et Chef / Ratio de queue-largeur sont Metrics robustes.

Les protocoles décrits ici ont été utilisés avec succès pour caractériser la fonction des régulateurs et des effecteurs de Rho GTPases pix-1, pak-1 et laissez-502 lors de l' allongement précoce

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Discussion

Ce protocole décrit les nouveaux paramètres pour caractériser début et fin des phases d'allongement embryonnaire.

Dans la section 1, l'étape critique est la présence potentielle de bactéries sur le pad. Les embryons sont hermétiquement enfermés entre le patin et la lamelle lors de l'acquisition d'image. La lame d'étanchéité est nécessaire pour éviter la dessication des animaux lors de l'acquisition d'une durée de plus de deux heures. À notre connaissance, aucun de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada et de la Fondation canadienne pour l’innovation. Merci au Dr Paul Mains (Université de Calgary, Calgary, Canada) pour la souche let-502(sb118ts). Certaines des souches ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center, qui est financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Agar  ;BioShopAGR001.500
AgaroseBioshopAGA001.500
CaCl2 (Chlorure de calcium)Bio Basic Inc.CT1330
CholestérolSigma-aldrichC8667
Solution de nettoyage  ;union Biometrica300-5072-000
Lamelles en verreFisherbrand12-542B
Lames en verreFisherbrand12-552-3
Particules de contrôle à haute fluorescenceunion Biometrica310-5071-001
K2HPO4 (phosphate de potassium, dibasique)Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4 (phosphate de potassium, monobasique)Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4 (sulfate de magnésium)Sigma-aldrich230391
Na2HPO4(phosphate de sodium, dibasique)Bio Basic Inc.
NaCl (chlorure de sodium)Bio Basic Inc.DB0483
Pébéo Gomme à Dessin 45  ; MLPé ; bé ; oPDG033000tout magasin d’art/artisanat
PeptoneBioShopPEP403.500
Tampon gaineunion Biometrica300-5070-100
COPAS Biosortunion Biometrica
SDB0487

Références

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