Gradient de déformation puce pour des comportements cellulaires stimulants en Hydrogel chargés de cellule

Résumé

Cet article présente une approche simple non continu dégradés souches statiques sur un hydrogel concentrique chargés de cellule pour réguler l’alignement de la cellule pour l’ingénierie tissulaire.

Résumé

Guide artificiel pour alignement cellulaire est un sujet d’actualité dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. La plupart de la recherche antérieure a enquêté sur alignement cellulaire induite par la souche unique, sur un hydrogel de cellules chargées en utilisant des procédés expérimentaux complexes et massive, contrôle des systèmes, qui sont généralement associés aux problèmes de contamination. Ainsi, dans cet article, nous proposons une approche simple pour renforcer un gradient allongement statique à l’aide d’une puce fluidique avec un couvercle en plastique de PDMS et un substrat de verre transparent UV pour la stimulation du comportement cellulaire dans un hydrogel en 3D. Prépolymère de cellule photo-en surcharge dans la chambre fluidique peut générer une membrane PDMS courbe convexe sur la couverture. Après réticulation UV, grâce à une composition circulaire concentrique sous la membrane PDMS incurvé et tampon de lavage, un micro-environnement pour cellule chargée de l’enquête comportements sous une variété de souches dégradés est autonome établie sur un seul circuit fluidique, sans instruments externes. Les cellules NIH3T3 ont été démontrées après avoir observé le changement dans la tendance de l’alignement cellulaires sous la direction de géométrie, en collaboration avec stimulation de souche, qui variait de 15 à 65 % sur hydrogels. Après 3 jours d’incubation, la géométrie de l’hydrogel a dominé l’alignement de la cellule sous contrainte de compression faible, où les cellules alignement le long de la direction d’élongation hydrogel sous contrainte de compression élevé. Entre eux, les cellules ont montré alignement aléatoire en raison de la dissipation de l’orientation radicale de l’allongement de l’hydrogel et la direction de la géométrie de l’hydrogel à motifs.

Introduction

Agissant comme un matériel de bloc qui imite un micro-environnement natif, un hydrogel contenant la matrice extracellulaire (ECM) peut reconstruire biomimétique tissu échafaudages pour soutenir la croissance des cellules. Pour posséder les fonctions d’un tissu, alignement de cellule organisée est une condition essentielle. 2D (c'est-à-dire les cellules cultivées sur une surface) et 3D (c.-à-d. les cellules encapsulées dans un hydrogel) divers alignements de cellules ont été obtenues en culture ou d’encapsulation des cellules dans ou sur des substrats flexibles avec micro- ou nano-modèles¹. Alignement de cellule 3D en microarchitecture est plus attrayant, car le microenvironnement est plus proche au tissu native construct^2,3,4. Une approche courante pour l’alignement de la cellule 3D est le repère géométrique de l’hydrogel forme^2,3. En raison de l’espace restreint de la prolifération cellulaire dans la direction de l’axe court, cellules visent à aligner le long de la direction de l’axe dans un hydrogel micro à motifs. Une autre approche consiste à appliquer la traction extensible pour les hydrogels à obtenir un alignement de cellule parallèle à la direction extensibles^4,5.

Stimulation biophysique sur ECM hydrogels, comme souche de compression ou un champ électrique, peut réguler les fonctions des cellules pour l’intégration tissulaire adéquate, la prolifération et la différenciation^1,2,3. Beaucoup de recherches ont été effectuée pour étudier comportement cellulaire en appliquant une condition de déformation à l’aide de plusieurs unités de contrôle mécanique^4,6,7,8,9. Par exemple, l’utilisation des moteurs mécaniques pas pressé ou tendu sur un hydrogel de collagène de cellules encapsulées 3D a été une approche commune^7,10. Toutefois, ce dispositif contrôle nécessite plus d’espace et fait face à la question de la contamination dans l’incubateur^7,9,11,12. En outre, le grand instrument ne peut pas donner un environnement de contrôle précis pour fournir la reproductibilité élevée¹³.

Étant donné que chargés de cellule hydrogels travaillent habituellement à l’échelle micro pour des applications biomédicales, il est avantageux de combiner les techniques de MEMS pour générer un ensemble de souche/tronçon stimulation d’étudier simultanément les comportements cellulaires en biomimétique 3D constructions in vitro^{2,14,15,16,17,18}. Par exemple, en utilisant la pression de gaz pour déformer la membrane PDMS de puces microfluidiques peut donner lieu à différentes souches, la différenciation cellulaire au volant de différentes lignées^9,16. Cependant, il y a de nombreux défis techniques, tels que les procédés de fabrication de puces compliquée dans une salle blanche et de l’intégration de contrôle de logiciel des moteurs, pompes, vannes et les gaz comprimés.

Dans ce travail, nous démontrons une approche simple pour obtenir une puce microfluidique gradient de déformation statique autosuffisante en employant un modèle hydrogel circulaires concentriques et une membrane souple de PDMS. Contrairement à la plupart des approches existantes, notre plate-forme est un appareil miniature portable et jetable qui peut être fabriqué à l’extérieur de la chambre jaune et qui possède des souches dégradés sur concentriques hydrogels cellule encapsulée, sans équipement mécanique externe au cours de l’incubation de l’auto-production. Comportements de cellules fibroblastes 3 t 3 influencé par une combinaison de forme hydrogel et une variété des repères d’orientation stretch traction ont été démontrées lors de l’observation de l’alignement de la cellule dans des environnements 3D ECM-mimétique à la puce de souche dégradé pendant 3 jours.

Protocole

1. Synthèse GelMA

1. Pesez 10 g de poudre de gélatine et ajoutez-la dans une fiole en verre avec 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco. Placez un barreau d’agitation magnétique dans le ballon et placez le ballon sur une plaque chauffante à agiter.
2. Couvrez le ballon d’une feuille d’aluminium pour éviter l’évaporation de l’eau. Réglez la température de la plaque chauffante à 50-60 °C et l’agitateur à 100 tr/min pendant 1 h pour bien dissoudre la poudre de gélatine.
3. Une fois la gélatine dissoute, ajoutez 8 ml d’anhydride méthacrylique très lentement (une goutte par seconde) à l’aide d’une pipette. Laisser réagir à 60 °C pendant 3 h.
4. Ajouter le DPBS préchauffé (40 °C) dans le ballon jusqu’à ce qu’il atteigne un volume final de 500 mL et bien laisser mélanger pendant 15 minutes pour arrêter la réaction.
5. Pendant ce temps, coupez une membrane de dialyse (poids moléculaire de coupure de 14 kDa) en plusieurs tubes de 25 cm de long. Immergez-les dans de l’eau déminéralisée (DI) pendant 15 min et faites un nœud pour fermer une extrémité des tubes de dialyse.
6. Chargez la quantité appropriée (30 à 60 ml) de la solution de polymère dans les tubes de dialyse et fermez l’autre extrémité. Placez-les dans un bécher en plastique de 5 L avec de l’eau DI pendant une semaine. Renouvelez l’eau DI deux fois par jour et maintenez la solution à 40 - 50 °C pendant le processus de dialyse.
7. Prélever la solution du tube dans une bouteille en verre de 500 ml. Verser ~450 à 500 mL de solution dans une coupelle filtrante de 500 mL (taille des pores de 0,22 μm) et appliquer un vide sur la coupelle filtrante pour forcer la solution à passer à travers la membrane filtrante pour la stérilisation.
8. Transférez le polymère stérilisé dans plusieurs tubes stérilisés de 50 ml et conservez-les dans un congélateur à -80 °C pendant 3 à 5 jours.
9. Lyophiliser le polymère à -80 °C pendant 1 semaine à l’aide d’un lyophilisateur pour former GelMA. Conservez le GelMA dans un congélateur à -80 °C.

2. Modification du méthacrylate de 3-(triméthoxysilyl)propyle (TMSPMA)

1. Coupez les lames de verre du commerce en deux petits morceaux (25 mm x 37,5 mm) et immergez-les dans une solution NaOH de 0,5 M pendant 4 h. Lavez les lames avec une grande quantité d’eau DI.
2. Placez la lame sur une grille à l’intérieur d’un récipient en verre avec de l’éthanol à 95 % et nettoyez-la à l’aide d’un ultrasoniseur à 43 kHz pendant 15 min. Faites sécher la lame de verre à l’air libre.
3. Immergez les lames de verre dans 5 % de TMSPMA dans de l’éthanol à 99,5 % pendant 1 h.
4. Lavez les lames avec de l’éthanol à 95 %, séchez-les à l’air libre et recuit le revêtement TMSPMA dans un four à 80 °C pendant 2 h.

3. Fabrication de puces

1. Prenez une plaque de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) de 2 mm et de 0,3 mm d’épaisseur, appliquez du ruban adhésif double face sur un côté de la surface du PMMA et relâchez la doublure d’un côté. Laissez deux plaques en PMMA de 2 mm d’épaisseur et une plaque de 1 mm d’épaisseur sans ruban adhésif double face.
2. Découpez au laser une plaque PMMA de 2 mm d’épaisseur sans ruban adhésif double face à 42 mm x 30 mm pour fabriquer la plaque inférieure. Découpez une plaque PMMA de 2 mm d’épaisseur avec du ruban adhésif double face pour réaliser le cadre de délimitation, avec des dimensions extérieures de 42 mm x 30 mm et des dimensions intérieures de 37,5 mm x 25 mm.
3. Découper au laser la plaque PMMA de 0,3 mm d’épaisseur avec du ruban adhésif double face dans un cercle central de 12 mm avec deux canaux d’écoulement de 2 mm de large et 8 mm de long sur les côtés opposés du cercle (Figure 1a).
4. Pour préparer le moule en PMMA pour la coulée du couvercle PDMS, assemblez les trois pièces de composants en PMMA des étapes 3.2-3.3 (Figure 1b) à l’aide de ruban adhésif double face.
5. Découpez au laser une plaque de PMMA de 2 mm d’épaisseur avec du ruban adhésif double face en une pièce de 5 cm x 5 cm avec un ensemble de 3 x 3 rectangles creux de 8,5 mm x 8,5 mm. Coupez un autre morceau de 5 cm x 5 cm avec un ensemble de 3 x 3 cercles creux de 4 mm. Découpez au laser une plaque de PMMA de 1 mm d’épaisseur sans ruban adhésif double face dans une plaque inférieure en PMMA de 5 cm x 5 cm.
6. Préparez le moule PMMA pour la coulée de la prise PDMS en assemblant les trois pièces de composants PMMA de l’étape 3.5 (Figure 1c) à l’aide de ruban adhésif double face.
7. Préparez le couvercle et la prise PDMS en mélangeant correctement 30 g d’élastomère PDMS et 3 g d’agent de durcissement PDMS ; dégazez le mélange sous une chambre à vide pendant 1 h.
8. Coulez 1,8 à 2,0 g du mélange dans le moule en PMMA pour le couvercle PDMS et utilisez la quantité appropriée pour remplir chaque cavité du moule en PMMA pour la prise PDMS. Couler 10 g de mélange PDMS non durci dans une plaque en plastique vierge de 10 cm. Mettez ces moules dans une chambre à vide pour dégazer pendant 30 min.
9. Durcissez le PDMS pendant 2 h à 80 °C. Après avoir refroidi le PDMS durci sur le moule, détachez les couvercles PDMS et les bouchons PDMS des moules PMMA.
10. Percez deux trous d’un diamètre d’environ 3 mm aux extrémités des canaux d’écoulement des couvercles PDMS.
11. Découpez la feuille PDMS moulée à partir de la plaque en plastique de 10 cm en plusieurs cubes de 1 cm x 1 cm et percez un trou de 3 mm dans chaque cube PDMS. Collez deux cubes PDMS non polymérisés de 1 cm x 1 cm sur les ouvertures du couvercle PDMS (pour servir de réservoirs moyens et pour faciliter le processus de durcissement des motifs d’hydrogel circulaires dégradés) et durcissez pendant 1 h à 80 °C.
12. Collez les couvercles PDMS avec les deux réservoirs PDMS sur une lame revêtue de TMSPMA en prétraitant le côté de collage du couvercle PDMS et la lame revêtue de TMSPMA sous une machine à plasma d’oxygène (puissance RF de 30 W (mode élevé) et air comprimé de 600 mTorr) ou un générateur corona électronique haute fréquence (115 V, 50/60 Hz, 0,35 A) pendant 90 s de traitement au plasma O₂.
13. Contactez la surface traitée au plasma des couvercles PDMS et de la lame TMSPMA et pressez-les étroitement pour une liaison permanente grâce à la formation d’une liaison Si-O-Si.
    REMARQUE : Placer la puce dans un four à 80 °C pendant 1 h peut encore améliorer la force de liaison.
14. Après refroidissement, plongez les copeaux dans de l’éthanol à 95 % pendant 15 min et séchez-les à l’air. Ensuite, stérilisez les copeaux sous irradiation UV pendant 1 h et stockez-les dans une boîte enveloppée dans du papier d’aluminium dans le capot laminaire.

4. Déformation à gradient statique sur l’hydrogel chargé de cellules

1. Imprimez et découpez un morceau de photomask, d’une taille de 25 mm x 37,5 mm, en imprimant la mise en page en Figure 2b sur un film transparent. Ajustez la taille imprimée de Figure 2b pour correspondre à la dimension de Figure 2a.
2. Préparez 100 ml de milieu DMEM avec 10 % de FBS, 1 % de Pen-Strep et 250 ml de DPBS dans un bain-marie à 37 °C pour l’utiliser comme milieu de culture cellulaire.
3. Peser 25 mg de GelMA lyophilisé dans 0,3 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé (37 °C) dans un tube de microcentrifugation noir de 1,5 mL. Placez le tube de microcentrifugation sur un agitateur/plaque chauffante de laboratoire jusqu’à ce que le GelMA se dissolve dans le fluide.
4. Peser 50 mg de photo-initiateur dans 1 ml de DPBS dans un tube de microcentrifugation et le placer dans un four à 80 °C pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que le photoinitiateur soit dissous.
5. Prélever 25 μL du photoinitiateur à 10 % de l’étape 4.4 et l’ajouter dans le tube de la microcentrifugeuse de l’étape 4.3. Pipeter plusieurs fois pour bien mélanger.
6. Comptez 3 x 10⁶ cellules NIH 3T3 à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Centrifuger la suspension à 200 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 175 μL de milieu de culture cellulaire.
7. Ajouter la solution cellulaire de l’étape 4.6 dans le tube de microcentrifugation de l’étape 4.5 pour obtenir une solution cellulaire prépolymère de 5 % de GelMA, de 0,5 % de photoinitiateur et de ~6 x 10⁶ cellules 3T3/mL. Après le mélange, chargez 100 μL de prépolymère cellulaire dans une micro-seringue de 100 μL.
8. Alignez manuellement (voir Figure 3a) un morceau du photomasque sur la lame inférieure de la puce de contrainte à gradient stérilisée et fixez simplement la position à l’aide d’une petite goutte d’eau DI entre les deux. Connectez la micro-seringue de 100 μL chargée d’une solution cellulaire de prépolymère à l’entrée de la puce.
9. Placez (voir Figure 3b) 50 μL de solution cellulaire de prépolymère dans le canal d’écoulement à l’aide de la micro-seringue, puis bouchez la sortie à l’aide d’une prise PDMS. Injectez 40 μL supplémentaires de solution pour créer un renflement convexe dans la membrane circulaire PDMS.
10. Déplacez la puce avec le photomasque (en bas), la micro-seringue (entrée) et la fiche PDMS (sortie) de l’étape 4.9 sous une lampe UV (365 nm, 9 mW/cm²) et exposez-la pendant 30 à 45 s pour réticuler l’hydrogel circulaire concentrique dans la chambre fluidique.
11. Retirez le bouchon PDMS et la micro-seringue pour relâcher la pression du liquide (voir Figure 3c). À l’aide d’une seringue de 1 ml remplie de DPBS préchauffé, il faut laver 3 fois les résines non réticulées en rinçant de l’entrée à la sortie.
12. Remplissez le canal d’écoulement avec environ 100 μL de milieu de culture cellulaire.
13. Placez la puce dans une boîte de culture stérilisée et cultivez dans une atmosphère à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant une semaine. Rafraîchissez le support tous les jours.
14. Prenez des images de trois puces le jour 0 après 4 h d’incubation, en tant que groupe témoin, et de trois puces le jour 3, en tant que dispositif expérimental, à l’aide d’un microscope avec un objectif 20X. Mesurez la largeur de chaque ligne de chaque hydrogel de la ligne 1 à la ligne 12 à l’aide d’un logiciel (par exemple, ImageJ) pour calculer les déformations de compresse ( Figure 4).
    REMARQUE : Le pourcentage d’allongement est calculé en divisant la valeur de la différence de largeur de trait entre 40 μL et 0 μL par la largeur de ligne à 40 μL.

5. Coloration cellulaire pour l’analyse d’alignement

1. À l’aide d’une seringue, injectez 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans le DPBS à RT dans la puce d’écoulement pendant 15 minutes pour la fixation de l’hydrogel chargé de cellules.
   REMARQUE : Mise en garde. Le PFA est toxique et doit être manipulé avec soin.
2. Remplacer la solution par une solution de perméabilisation de la membrane cellulaire à 0,5 % dans le DPBS pendant 10 min pour perméabiliser la membrane cellulaire à la RT.
3. Le PBS lave les échantillons 3 fois avec un intervalle de 5 à 10 minutes entre les lavages (à l’aide d’une seringue chargée, comme à l’étape 5.1).
4. Chargez la solution BSA à 1 % dans le canal fluidique pendant 45 à 60 min à RT (à l’aide d’une seringue chargée par l’orifice d’entrée).
5. Ajouter 1,5 mL de méthanol dans le flacon avec la phalloïdine Alexa Fluor 488 pour obtenir une concentration finale de solution mère de 6,6 μM.
6. Prélever 5 μL de phalloïdine Alexa Fluor 488 de l’étape 5.5 et les diluer dans 200 μL de DPBS avec 0,1 % de BSA pour former une concentration finale de 0,165 μM de phalloïdine Alexa Fluor 488.
7. Ajouter 200 μL de la solution de mélange dans le canal fluidique à l’aide d’une micropipette et incuber la puce à 37 °C pendant 45 à 60 minutes pour la coloration à l’actine. PBS lave (comme ci-dessus) les échantillons 3 fois.
8. Préparez 1 μg/mL de DAPI dans du PBS, faites-le passer dans la puce et colorez les noyaux cellulaires à 37 °C pendant 5 min.
9. Pipeter le DPBS dans le canal fluidique pour éliminer la solution de coloration et remplir la chambre fluidique avec une solution PBS pour prendre des images avec un microscope à fluorescence.
10. Capturez les images fluorescentes des cellules 3T3 dans les hydrogels à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée sous un grossissement de 40X avec un détecteur CCD et des ensembles de filtres ex/em à 488/520 nm et 358/461 nm pour la phalloidine 488 Alexa Fluor (actine) et le DAPI (noyau), respectivement.

Résultats

Pour comparer les variations mécaniques entre chaque hydrogel circulaire dans la puce de stimulation souche gradient dûment rempli, nous avons mesuré la largeur de chaque circulaire hydrogel dans deux des puces mêmes, avec des volumes d’injection 0 µl (Figure 4 a) et 40 µL (Figure 4 b), respectivement. Les allongements pour cent à chaque cercle ont été calculés en divisant les allongements dans la puce 40 µL-injecté par les large...

Discussion

Dans cet article, nous présentons une approche simple de comparer le comportement de l’alignement de cellule après orientation forme hydrogel et stretch traction. Une membrane souple de PDMS crée une courbe en forme de dôme pour générer les différentes hauteurs des hydrogels circulaires concentriques. Après avoir relâché la pression, la membrane PDMS applique automatiquement la force pour les hydrogels micro à motifs pour former la souche dégradé/allongement, avec un maximum au centre et au moins à la limite extérieure. ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube microcentrifuge noir de 1,5 mL	Argos Technologies  ;	03-391-161 Celui-ci	peut être remplacé par une couleur neutre de tube de 1,5 mL recouvert d’une feuille d’aluminium
10x DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 phalloïdine  ;	Invitrogen	A12379  ;
BSA	Sigma	A1595
Sonde moléculaire	de calcéine	C1430	Pour le marquage de cellules viables
CCD	PCO. Imagerie	Pixelfly qe
Solution de perméation de la membrane cellulaire	Sigma-Aldrich	X100	0,5 % Triton X-100 pour la perméabilité de la membrane cellulaire
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Coloration du noyau cellulaire Membrane
dialyse	Sigma-Aldrich	D9527	Seuil de coupure du poids moléculaire = 14 000
DMEM	Gibco	11995-065
Ruban adhésif double face	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
Gélatine	Sigma-Aldrich	G2500	force du gel 300, type A, à partir de peau de porc
Générateur de couronne électronique haute fréquence	Produits électrotechniques	MODÈLE BD-20
Anhydride méthacrylique	Sigma-Aldrich	276685
Micro seringue	Hamilton	80501	50 &mu ; L  ;
Microscope	Olympus	IX71	Comprend deux jeux de filtres : LF405/LP-B-000 et LF488/LP-C-000 de Semrock Machine à
plasma d’oxygène	Plasma Harrick	PDC-001
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148	Pour la fixation de la cellule
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	Mélange pour la fabrication de moulage de puces PDMS
Pen-Strep	Gibco	10378-016	Pénicilline/Streptomycine
Photoinitiateur	CIBA	Irgacure 2959
Iodure de propidium	Sigma-Aldrich	P4170	Pour l’étiquetage des cellules mortes
Stérile Gobelet de filtration	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	Pour l’immobilisation de l’hydrogel
Ultrasoniseur	Delta	D150H	150W, 43kHz
Lumière UV	DAIHAN	WUV-L10
Lyophilisateur	FIRSTEK	150311025
NIH3T3(fibroblast)	Institut de Recherche et de Développement de l’Industrie Alimentaire(FIRDI)	08C0011
MOXI Z Mini Compteur de Cellules	Automatisé ORFLO	MXZ001