Ce protocole décrit un test à haut débit pour tester les préférences de ponte de Drosophila melanogaster à une résolution d’un seul animal. Ce test fournit une plate-forme simple, efficace et évolutive pour identifier les gènes et les composants de circuit qui contrôlent un processus de prise de décision simple.
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Article de méthode
High Throughput Assay pour examiner les préférences de ponte de l'individu
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Récemment, la préférence de la drosophile ponte a émergé comme un modèle génétiquement traitable pour étudier les bases neurales des processus de prise de décisions simples. Lors de la sélection des sites pour déposer leurs œufs, les mouches femelles sont capables de classer l'attractivité relative de leurs options et en choisissant les "plus de deux produits." Cependant, la plupart des essais de préférence ponte ne sont pas pratiques si l'on veut adopter une approche de dépistage génétique systématique à la recherche de la base de circuits qui sous-tend ce processus de prise de décision simple, comme ils sont et laborieux à mettre en place basée sur la population. Pour augmenter le débit de l'étude des préférences de ponte des femelles simples, nous avons développé personnalisés chambres que chacun peut les préférences de ponte simultanément dosage allant jusqu'à trente individu vole ainsi qu'un protocole qui assure chaque femelle a un taux de ponte élevé (de sorte que leur préférence est facilement discernable et plus convaincante). Notre approche est simple à exécuteret produit des résultats très cohérents. En outre, ces chambres peuvent être équipées de différents accessoires pour permettre l'enregistrement vidéo des animaux de ponte et de fournir de la lumière pour les études de optogénétique. Cet article fournit les plans pour la fabrication de ces chambres et la procédure pour la préparation des mouches à doser dans ces chambres.
Introduction
Drosophila melanogaster est un organisme modèle génétique puissant pour étudier la base neurale des comportements. Le développement rapide d’outils génétiques permettant de manipuler les neurones de manière ciblée et l’émergence d’outils d’analyse comportementale sophistiqués ont considérablement amélioré notre capacité à disséquer les mécanismes de circuit qui sous-tendent les processus de transformation sensori-motrice de plusieurs comportements innés et appris1-3.
La ponte de drosophile est un modèle approprié pour étudier la base neurale de processus simples de prise de décision. En particulier, il a été démontré que les femelles drosophiles possèdent la capacité de comparer et de classer leurs options avant de s’engager à déposer un œuf sur une optiondonnée 4-8. Par exemple, lorsqu’on ne leur donne qu’un substrat ordinaire (sans saccharose) ou seulement un substrat contenant du saccharose, les femelles acceptent facilement l’une ou l’autre option pour la ponte. Cependant, lorsqu’on leur présente les deux options, les femelles rejettent vigoureusement le substrat du saccharose dans certains contextes7,9,10. Cependant, on sait relativement peu de choses sur les mécanismes neuronaux qui permettent aux femelles de « choisir le plus grand de deux biens ». L’un des principaux obstacles a été l’absence d’une méthode efficace pour évaluer les préférences en matière de ponte, de sorte que l’on puisse utiliser une approche de dépistage génétique systématique pour étudier ce problème.
Dans ce rapport, nous décrivons le protocole que nous avons développé qui permet d’analyser les préférences de ponte des femelles à une résolution d’un seul animal et avec un débit et une cohérence considérablement améliorés par rapport aux méthodes précédentes. Plus précisément, nous fournissons les plans pour la construction des chambres que nous avons conçues, le protocole pour préparer les femelles afin que chacune soit prête à pondre de nombreux œufs, et le protocole pour l’utilisation des chambres.
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Protocole
1. Préparation de mouches à doser
- Culture vole sur la mélasse standards / media à la semoule de maïs incubateur réglé à 25 ° C et 65% d'humidité. Prenez soin de ne pas surcharger les flacons. Par exemple, mettre 8 femmes et 6 hommes dans un flacon alimentaire étroite.
Note: "flacon alimentaire étroite» utilisée ici a un diamètre intérieur de 2,3 cm. Nous généralement distribué environ 10 ml de nourriture à la mouche dans chaque flacon. La recette de la nourriture à la mouche, nous avons utilisé est décrit ici: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 jours après les femelles eclosion, préparer des flacons avec de la pâte de levure fraîche comme le montre la figure 1E. Faire de la pâte de levure fraîche en mélangeant 6 g de levure active avec 10 ml d'acide propionique 0,5%. Utiliser une spatule pour appliquer la pâte de levure sur la paroi latérale des flacons de produits alimentaires. Collecter 30 - 35 femelles éclos avec 20 - 25 mâles dans les flacons.
- En général, de recueillir les mâles des mêmes flacons où les femelles sont collectées(Afin de gagner du temps et de l'effort). Toutefois, si l'on se préoccupe de la fertilité des mâles, utilisez les mâles WT à la place. En outre, la pâte de levure est important pour stimuler la production d'œufs donc le préparer frais tous les jours.
- Maintenir les hommes / femmes recueillies à 25 ° C, 65% d'humidité, à moins que les mouches sont sensibles à la température.
- Après ~ 4 - 5 jours, vérifiez les flacons pour voir si les femelles sont prêtes pour des expériences de ponte. Ils sont prêts lorsque la surface du milieu alimentaire est humide à partir de larves fouisseuses activement à la nourriture (voir la figure 1E - F).
Remarque: Les femelles retiennent généralement pondre une fois que la surface de l'aliment devient humide et grouillante de larves. Cette étape garantit que les femmes seraient prêtes à pondre d'œufs quand ils rencontrent des substrats avec la texture désirée (par exemple., ~ 1% d' agarose).
2. Chambre de la Construction, Assemblée, Assay Setup
- Avoir un atelier d'usinage de construire des chambres de ponte acryliques (Figurer 1A - D). Le dessin technique de différentes pièces ont été montrés à la figure supplémentaire 1 -. 3 images haute résolution peuvent également être trouvés ici (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Insérez des feuilles de plastique dans le chargement ( en haut) morceau de la chambre comme le montre la figure 1C. Cela sert de surface de fond pendant le chargement vole dans les arènes de ponte individuels.
- Anesthetize femelles sur un bloc de CO 2 et de les charger individuellement dans chaque arène de ponte. Autoriser ~ 30 min pour les mouches pour récupérer du CO 2 et de s'acclimater à ce nouvel environnement.
- Préparer les substrats d'agarose.
- Pour plus de commodité, garder une bouteille de premade fondu 1% d'agarose dans un bain d'eau C 55 °.
- Ajouter la quantité désirée de solution mère de saccharose (2 M) dans un tube conique de 50 ml et en le mélangeant avec une quantité appropriée d'agarose. Par exemple, pour préparer le substrat mM, saccharose 150, plaCE 750 pi de solution 2 M de saccharose dans le tube, puis remplir le tube avec de l'agarose à la marque 10 ml.
- Préparer le substrat brut de la même manière mais en ajoutant de l'eau distillée au lieu de la solution de saccharose.
Remarque: La concentration finale d'agarose dans ce protocole est légèrement inférieur à 1%. Dans notre expérience, la concentration exacte de l'agarose n'a pas d'importance tant qu'il est commandée pour être à l'intérieur de ~ 0,9 à 1,1% et que les deux substrats sont de la même concentration d'agarose.
- Prendre la pièce de la chambre et la pipette de 1000 ul de substrat d' agarose substrat ( en bas) dans chaque creux comme on le voit sur la figure 1D.
- Laisser agarose se solidifier pendant ~ 30 min.
- Une fois que les substrats d'agarose et les mouches sont prêts, assembler les trois morceaux de la chambre de ponte et ensuite prendre les feuilles de plastique.
- Placer les chambres dans les incubateurs de mouches.
Note: Longueur des expériences de ponte peut varier selon expebesoins rimentales. Nous courons généralement l'expérience O / N (14 - 16 h). En outre, on a observé aucun impact significatif de la synchronisation circadienne sur les préférences de ponte. - Anesthetize femelles par injection de CO 2 dans la chambre. Démonter la chambre, jeter les mouches anesthésiés dans la mouche morgue (ie., Un café vide peut rempli avec de l' huile de maïs). Prenez des photos des résultats pour la tenue des dossiers (voir la figure 2).
- Comptez le nombre d'oeufs manuellement et calculer les indices de préférence pour l'analyse. Calculer l' indice de préférence en tant que (N a - N b) / (N a + N b) , où N et N a b représentent le nombre d'oeufs sur le site d' un site par rapport à b, respectivement.
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Résultats
Les chambres de ponte sont composés de plusieurs pièces: un morceau substrat ( en bas), un diviseur (milieu) pièce, une charge ( en haut) pièce, et 2 portes coulissantes (Figure 1A - D). Ces pièces sont utilisées pour indépendamment les mouches de configuration et des substrats avant des expériences de ponte. Figure 1F montre comment les flacons devraient regarder quand mouches femelles sont prêtes pour la ponte. Quand les mouches ont le choix entre un s...
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Discussion
Les chambres et les protocoles décrits ici ont plusieurs améliorations par rapport à des essais de ponte précédents. Tout d'abord, ils augmentent le débit de dosage préférences des animaux isolés de manière significative. Chaque chambre peut doser 30 femmes célibataires et il faut moins d'une heure à mettre en place. D'autre part, ils augmentent la cohérence des préférences de ponte par rapport aux méthodes antérieures. La normalisation des dimensions de l'arène, la taille des substrats de ponte, et la d...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le Duke Physics Shop, en particulier Phil Lewis, de nous avoir aidés à construire l’appareil comportemental et les attachements et à créer le dessin. Ce travail est financé par les National Institutes of Health sous le numéro de bourse R01GM100027.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agarose ultrapure ; | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Bain-marie ; | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| LED rouges | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Chambres de ponte Supports | sur | ||
| Supports de LED | sur mesure | ||
| (étroits) | Genesee | 32-116 av. J.-C |
Références
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- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
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Réimpressions et autorisations
