Article de méthode

Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

DOI :

10.3791/53732

⸱

3 mars 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous rapportons des protocoles pour détecter les protéines centromères-kinétochores endogènes et exogènes dans les cellules humaines et quantifions ces niveaux de protéines au niveau des centromères-kinétochores par coloration immunofluorescente indirecte par l’utilisation de la fixation (fixation du paraformaldéhyde, de l’acétone ou du méthanol).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Centromères » et « kinétochores » désignent le site où les chromosomes s’associent au fuseau lors de la division cellulaire. La visualisation directe des protéines centromère-kinétochore au cours du cycle cellulaire reste un outil fondamental dans l’étude du ou des mécanismes de ces protéines. Les méthodes d’imagerie avancées en microscopie à fluorescence offrent une résolution remarquable des composants centromère-kinétochore et permettent l’observation directe de composants moléculaires spécifiques des centromères et des kinétochores. De plus, les méthodes de coloration immunofluorescente indirecte (IIF) utilisant des anticorps spécifiques sont cruciales pour ces observations. Cependant, malgré de nombreux rapports sur les protocoles IIF, peu ont discuté en détail des problèmes de protéines centromères-kinétochores spécifiques. 1-4 Ici, nous rapportons des protocoles optimisés pour colorer les protéines centromères-kinétochores endogènes dans les cellules humaines en utilisant la fixation du paraformaldéhyde et la coloration IIF. De plus, nous rapportons des protocoles pour détecter les protéines CENP-A exogènes marquées Flag-Tag-Tag dans les cellules humaines soumises à une fixation à l’acétone ou au méthanol. Ces méthodes sont utiles pour détecter et quantifier les protéines centromères-kinétochores endogènes et les protéines CENP-A marquées par Flag, y compris celles présentes dans les cellules humaines.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"centromères" ont été classiquement définis comme régions de recombinaison méiotique supprimée en génétique et plus tard reconnu comme la constriction primaire des chromosomes mitotiques, qui joue un rôle essentiel dans la ségrégation des chromosomes lors de la mitose précise. "cinétochores" ont été décrits comme des structures à couches multiples qui se lient aux microtubules à la surface de centromères, telle qu'elle est révélée par microscopie électronique; "cinétochores" ont ensuite été définis comme étant le complexe macromoléculaire qui se localise au niveau du centromère des chromosomes mitotiques. En dépit d'une divergence considérable de séquences d'ADN centromériques parmi les vertébrés, la structure et la composition kinétochore sont hautement conservées. Une interaction dynamique entre microtubules du fuseau et kinétochore est nécessaire pour la ségrégation fidèle des chromosomes lors de la mitose, et les défauts de centromère-kinétochore fonction conduisent à une aneuploïdie et ainsi le cancer.

Centromère dans la plupart des eucaryotesa pas de séquence d'ADN définie, mais est composé de grands réseaux (0,3-5 Mo) d'ADN alphoïde répétitif constitué d'ADN α-satellite de 171 pb. Sauf dans la levure bourgeonnante, l' identité de centromère est obtenue non pas par la séquence d'ADN , mais par la présence d'un nucléosome spécial qui contient le variant de l' histone H3 CENH3 (centromère protéine A [CENP-A] chez l' homme). 5 nucléosomes CENP-A localisent au plaque intérieure de kinétochores mammifères 7 et se lient à l'ADN α-satellite de 171 pb. centromères actifs exigent CENP contenant A-nucléosomes pour diriger le recrutement d'un réseau constitutif centromère-associé (CCAN) et les protéines kinétochoriens, qui régulent ainsi l'attachement des chromosomes au fuseau mitotique et la progression du cycle suivant à travers le point de contrôle de la broche.

À la lumière de la preuve ci - dessus, CENP-A a été proposé d'être la marque épigénétique du centromère 8; toutefois, le processus par lequel CENP-A est incorporé into ADN centromérique et les facteurs responsables de cette incorporation ont pas encore été bien caractérisée. Un domaine de centromère ciblage courte (DTAC) réside dans le histone fold région CENP-A, et le remplacement de la région correspondante de H3 avec le CATD est suffisante pour H3 directe du centromère. 9 Plusieurs études ont suggéré des rôles fonctionnels pour post-traductionnelle modification (PTM) de CENP-A 12-16; Cependant, les mécanismes moléculaires de ces PTM de CENP-A dans le recrutement à centromères n'a pas encore été élucidé. Nous avons déjà indiqué que l' activité de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 est nécessaire pour CENP-A K124 ubiquitylation et la localisation de CENP-A à centromères 17.

La découverte et la caractérisation des protéines kinétochoriens ont conduit à de nouvelles connaissances en ce qui concerne la ségrégation des chromosomes. 18 Plus de 100 éléments kinétochoriens ont été identifiées dans les cellules de vertébrés par diverses approches. Une sous 19,20méthodes permanentes de la façon dont cinétochores assemblent et la fonction vient également de la caractérisation des fonctions cellulaires de chaque réseau centromère-kinétochore protéines et protéine-protéine dans les cellules. 19 visualisation directe et d' imagerie de pointe en microscopie de fluorescence fournissent remarquable résolution de composants centromère-kinétochore et permettent l'observation directe des composants moléculaires spécifiques des centromères et kinétochores. En outre, les méthodes d'immunofluorescence indirecte (IIF) coloration en utilisant des anticorps spécifiques sont cruciaux pour ces observations. Cependant, en dépit de nombreux rapports sur les protocoles IIF, peu abordés dans les problèmes de détail de protéines centromériques-kinétochore spécifiques. 1-4 Ainsi, le développement et les méthodes de déclaration de IIF coloration et un dosage quantitatif IIF pour analyser spécifiquement chaque protéine centromère-kinétochore est extrêmement important. Dans IIF coloration, il faut procéder avec le protocole de coloration pour éviter la perte de la protéine d'intérêt oule reste de la cellule. Cependant, la fixation détruit les sites antigéniques de temps en temps, et des combinaisons anticorps-antigène fonctionne mal avec un fixatif, mais très bien avec les autres, 21 et le choix de fixatif dépend en grande partie de la protéine (s) d'intérêt. Par conséquent, les différentes méthodes de fixateur sont cruciales dans IIF coloration des protéines centromériques-kinétochore.

Méthodes ici optimisées immunofluorescence indirecte (IIF), la coloration et un essai pour résoudre la localisation des protéines centromère kinétochore endogènes, y compris CENP-A et les protéines CENP-A exogènes étiquetée FLAG, et la quantification de ces protéines dans des cellules humaines ont été développées. Ces procédés peuvent être appliqués à l'analyse des protéines centromériques-kinétochore dans d'autres espèces.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Culture cellulaire et transfection

  1. Mettez un couvercle en verre (22 mm x 22 mm) dans une plaque de polystyrène à 6 puits. manteau En option, un couvercle en verre avec Poly-L-lysine, 0,1% p / v, dans l'eau (voir la liste des matériaux / équipement) pour maintenir les cellules en mitose sur le couvercle en verre en suivant les étapes ci-dessous:
    Remarque: Les conditions optimales doivent être déterminées pour chaque lignée cellulaire et de l'application.
    1. Aseptique surface de culture de manteau avec Poly-L-lysine, 0,1% p / v, dans l'eau (0,4 ml / puits d'une plaque à 6 puits en polystyrène). Roche doucement pour assurer une couche de la surface de culture.
    2. Après 5 min, éliminer la solution par aspiration et bien rincer la surface avec de l'eau de qualité culture de tissu stérile.
    3. Sec au moins 2 heures avant l'introduction de cellules et le milieu.
  2. Seed cellules HeLa 17 ou cellules Tet-Off HeLa 17,22 sur un verre de couverture (22 mm x 22 mm) mettre dans une plaque de polystyrène à 6 puits. Vérifiez que la densité cellulaire est de 5,4 x 10 5 par puits. les cellules de la culturedans DMEM riche en glucose avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine.
    Remarque: Pour des résultats optimaux, déterminer empiriquement la densité cellulaire à utiliser dans l'ensemencement.
  3. Incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO2 pendant 18 heures.
    Note: Dans le cas des cellules HeLa Tet-Off, la transcription du gène exogène est active en l'absence de l'inducteur ( par exemple, la tetracycline / doxycycline) , par conséquent des cellules de culture sans tetracycline / doxycycline et transfecter de manière transitoire avec le vecteur de surexpression pTRM4 (tableau 2 ), dont la transcription est régulée par le promoteur TRE (voir ci-dessous).
  4. Dix-huit heures après l'ensemencement des cellules, transfecter comme suit:
    1. Faire la solution A en mélangeant 1,5 ul siRNA oligo (20 uM d'actions recuite; Tableau 1) et / ou 2,0 pg de plasmide (Tableau 2) en pl de milieu de sérum réduit 50 (voir la liste des matériaux / équipement), et incuber à température ambiante pendant 5 min .
      Remarque: Dans cette analyse,CA-UTR siRNA (un mélange de 5 'et 3' UTR siRNA; tableau 1) ont été co-transfectées pour une utilisation dans les protocoles 3 et 4 (voir Discussion).
    2. Faire la solution B en mélangeant 0,75 réactif de transfection ul I (voir Liste des Matériaux / Équipement) dans 50 pi réduits milieu sérique, et incuber à température ambiante pendant 5 min.
      Remarque: Une étape facultative est l'addition de 1,0 ul réactif de transfection II (voir la liste des matériaux / équipement).
    3. Mélanger les solutions A et B ensemble, et laisser incuber à température ambiante pendant 15 min.
    4. Laver les cellules cultivées une fois avec du PBS, puis ajouter 500 ul réduits milieu sérique à chaque puits de la plaque de polystyrène à 6 puits. Ajouter le mélange des solutions A et B ( par exemple, l' ARN et / ou d'un complexe ADN-lipide) , directement à chacun des puits individuels.
      Note: La concentration finale est de 3,3 pg / ml (plasmide); 50 nM (siARN).
    5. Incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 pendant 4,5 heures. Changer le support à haute teneur en glucose DMEM with 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine.
    6. Incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO2 pendant 48 à 72 heures après la transfection.
      Remarque: Pour des résultats optimaux, la période d'incubation pour la croissance cellulaire avant la fixation doit être déterminée de manière empirique, et de protéines d'épuisement et / ou l'expression doit être confirmée par l'analyse Western blot (voir protocole n ° 6).
    7. Si l'analyse cellulaire mitotique est d'intérêt, ajouter le paclitaxel (10 nM) à des cellules en culture 24 heures avant la fixation, ou ajouter TN16 (0,5 uM) pour les cellules cultivées 2,5 heures avant la fixation.

2. Cellule de fixation et immunofluorescence pour détecter les protéines Endogène Centromere-kinétochoriens (paraformaldéhyde Fixation)

  1. Préparation de fixateurs, des tampons et des réactifs.
    1. Fraîchement préparer 50 ml d'une solution de paraformaldehyde à 4% dans du PBS, pH 7,4.
      1. Ajouter 40 ml de 1 x PBS dans un bécher de verre sur une plaque d'agitation dans une hotte ventilée. Chaleur tandis Stirring à environ 60 ° C. Ajouter 2 g de poudre de paraformaldéhyde à la PBS chauffée.
      2. Soulevez lentement le pH en ajoutant 1 ml de NaOH 1 N au total, parce que la poudre ne se dissout pas immédiatement.
        Remarque: La solution efface après l'addition de NaOH.
      3. Une fois que le paraformaldéhyde est dissous, refroidir et filtrer la solution.
      4. Ajuster le pH avec HCl 1 N à pH 7,4 et le volume de la solution avec 1 x PBS à 50 ml.
        Remarque: Des aliquotes de la solution peuvent être congelés ou conservés à 2-8 ° C pendant aussi longtemps que 1 semaine. La solution doit être refroidi à la glace ou stocké à 4 ° C jusqu'à ce qu'il doit être utilisé.
    2. Préparer 50 ml de tampon KB1, qui se compose de 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 150 mM; BSA à 0,5%; et 0,5% de Triton X-100.
      Remarque: BSA doit être fraîchement ajouté.
      Note: La série KB de mémoire tampon sont basées sur KB tampon décrite dans les rapports précédents 1,2,4.
    3. Préparer 50 ml de tampon KB2, qui se compose de 10 mM de Tris-HCl,pH 7,5; NaCl 150 mM; et 0,5% de BSA.
      Remarque: BSA doit être fraîchement ajouté.
    4. Préparer 1 ml de tampon contenant KB3 DAPI (50 ng / ml).
    5. Préparer 100 ml de milieu de montage, qui se compose de 1 mg / ml de p-phénylènediamine; 10% de PBS et 90% de glycérol.
      1. Ajuster le pH de 1 x PBS à 9,8 avec NaOH 1 N, on dissout le p-phénylènediamine dans la solution, puis ajouter du glycérol.
      2. Magasin aliquots de 1 ml à -80 ° C. Protéger de la lumière.
  2. Retirez le milieu de culture par aspiration à 48-72 heures après transfection (voir Protocole 1) pour la fixation des cellules. Rincer les cellules une fois avec du PBS. Appliquer du PBS à côté des puits de culture afin d'éviter de perturber la surface des cellules.
    Remarque: Le point de temps optimal pour la fixation de la cellule doit être déterminée empiriquement.
  3. Fixer les cellules dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 30 min à 4 ° C. Rincer les cellules deux fois avec KB2 de tampon pour éliminer suffisamment résiduelle paraformaldéhyde 4%.
  4. PermeabiLize les échantillons dans KB1 tampon pendant 30 min à température ambiante. Rincer les cellules une fois avec KB2 tampon, et ajouter KB2 tampon pendant 5 min à température ambiante pour bloquer les sites additionnels de liaison non spécifique.
    Remarque: Buffer KB1 contribue également de manière significative à blocage.
  5. Retirer un couvercle en verre (22 mm x 22 mm) à partir d'une plaque de polystyrène à 6 puits en utilisant une pince. L'utilisation d'un stylo barrière hydrophobe (voir la liste des matériaux / équipement), dessiner un carré ou un cercle vert pâle pour former une barrière hydrophobe autour de chaque échantillon de verre de couverture. Ne pas toucher ni trop près des cellules avec le stylo barrière hydrophobe. Mettez le couvercle en verre dans une nouvelle plaque de polystyrène à 6 puits.
  6. Diluer un anticorps primaire à centromère ou protéine kinétochore (rapport de dilution de 1: 100 à 1: 200; voir aussi la liste des matériaux / équipement) et soit un anticorps anti-CENP-B (rapport de dilution de 1: 400) ou un anti anticorps centromere (ACA) (rapport de dilution de 1: 2000) comme marqueur de localisation de centromère dans KB2 tampon.
    Remarque: Pour des résultats optimaux, la concentra finaletion de l'anticorps primaire dans cette solution doit être déterminée de manière empirique.
  7. Appliquer un volume suffisant (environ 30 pi) de l'anticorps primaire dilué pour immerger l'échantillon cellulaire. Incuber l'échantillon de cellules pendant 1 heure à 37 ° C. Rincer les cellules 3 fois avec KB2 tampon.
  8. À l'aide KB2 tampon, diluer un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (rapport de dilution de 1: 100 à 1: 200) dirigés l'un contre l'anticorps primaire.
    Remarque: Pour des résultats optimaux, la concentration finale de l'anticorps secondaire dans cette solution doit être déterminée de manière empirique.
  9. Appliquer un volume suffisant (une goutte d'environ 30 ul sur la vitre de recouvrement) de l'anticorps secondaire dilué pour immerger l'échantillon cellulaire. Incuber l'échantillon de cellules pendant 1 heure à 37 ° C. Rincer les cellules 5 fois avec KB2 tampon pendant une période de 30 min (cinq lavages 6 min).
    Remarque: Pour des résultats optimaux (ie, pour une perte minimale de cellules), la condition de lavage optimale doit être déterminée empirically.
  10. Appliquer un volume suffisant de KB3 tampon contenant du DAPI (50 ng / ml) pour immerger l'échantillon cellulaire. Incuber l'échantillon de cellules pendant 5 min à température ambiante. Rincer les cellules 1-2 fois avec KB2 tampon.
  11. Monter le couvercle en verre qui contient l'échantillon de cellules sur la lame micro.
    1. Placer une goutte de milieu de montage au centre de la lame micro.
    2. Retirer le liquide de l'échantillon de cellules et, à l'aide des mains ou des pinces, placer l'échantillon dans le centre de la diapositive micro. Évitez les bulles d'air.
    3. Retirer le milieu de montage en excès avec une serviette en papier.

3. Cellule de fixation et immunofluorescence de C-terminal Flag-étiqueté CENP-A Protéines (Acétone Fixation)

  1. Préparation
    1. Préparer glacée 75% d'acétone.
    2. Fraîchement préparer 50 ml de PBS (pH 7,4) contenant 0,5% de lait écrémé et 0,5% de BSA.
    3. Fraîchement préparer 50 ml de PBS (pH 7,4) contenant 0,1% de lait écrémé et 0,1% de BSA.
    4. Préparer 1 ml de PBS (pH 7,4) contenant du DAPI (50 à 100 ng / ml).
    5. Préparer 100 ml de milieu de montage tel que décrit au point 2.1.5.
  2. Retirez le milieu de culture par aspiration à 48-72 heures après transfection (voir Protocole 1) pour la fixation des cellules. Rincer les cellules une fois avec du PBS. Appliquer du PBS sur le côté du puits de culture afin d'éviter de perturber la surface des cellules.
    Remarque: Le point de temps optimal pour la fixation de la cellule doit être déterminée empiriquement.
  3. Fixer les cellules dans de la glace-froid 75% d'acétone, et incuber les cellules pendant 10 minutes à -20 ° C. cellules sèches sur le verre de couverture dans une hotte pendant 30-60 min à température ambiante.
    Remarque: Pour des résultats optimaux, la durée du temps nécessaire à la fixation cellulaire et le séchage doit être déterminée de manière empirique.
  4. En utilisant le stylo barrière hydrophobe (voir la liste des matériaux / équipement), dessiner un carré ou un cercle vert pâle pour former une barrière hydrophobe autour de chaque échantillon de verre de couverture. Ne pas toucher ni trop près des cellules avec le stylo barrière hydrophobe.
  5. Bloc nonspecific des sites de liaison sur les cellules par l'addition de PBS contenant 0,5% de lait écrémé et 0,5% de BSA pendant 5 min à température ambiante.
  6. À l'aide de PBS contenant 0,1% de lait écrémé et 0,1% de BSA, on dilue un anticorps anti-Flag (1: 1000 taux de dilution) et soit un anticorps anti-CENP-B (rapport de dilution de 1: 200) ou ACA (rapport 1: 2000 dilution ) comme marqueur de localisation de centromère.
    Remarque: Pour des résultats optimaux, la concentration finale de l'anticorps primaire dans cette solution doit être déterminée de manière empirique.
  7. Appliquer un volume suffisant (environ 30 pi) de l'anticorps primaire dilué pour immerger l'échantillon cellulaire. Incuber l'échantillon de cellules pendant 1 heure à 37 ° C. Rincer les cellules 5 fois avec le tampon de blocage pendant une période de 30 min.
    Nota: Les cellules peuvent être rincées avec du PBS. Pour des résultats optimaux ( par exemple, pour éviter la perte de cellules), les conditions de lavage optimales doivent être déterminées de manière empirique.
  8. Diluer un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (rapport de dilution de 1: 100 à 1: 200) dirigé contrele chaque anticorps primaire dans du PBS contenant 0,1% de lait écrémé et 0,1% de BSA.
    Remarque: Pour des résultats optimaux, la concentration finale de l'anticorps secondaire dans cette solution doit être déterminée de manière empirique.
  9. Appliquer un volume suffisant (environ 30 pi) de l'anticorps secondaire dilué pour immerger l'échantillon cellulaire. Incuber l'échantillon de cellules pendant 1 heure à 37 ° C. Rincer les cellules 2 fois avec du PBS contenant 0,1% de lait écrémé et 0,1% de BSA.
    Remarque: PBS seul peut également être utilisé pour laver les cellules.
  10. Appliquer une quantité suffisante de PBS contenant du DAPI (50-100 ng / ml) pour immerger l'échantillon cellulaire. Incuber l'échantillon de cellules pendant 5 min à température ambiante. Rincer les cellules 1-2 fois avec du PBS.
  11. Monter le couvercle en verre contenant l'échantillon de cellules sur la lame micro comme décrit dans 2.11.

4. Cellule de fixation et immunofluorescence de N-terminal Flag-étiqueté CENP-A Protéines (Methanol Fixation)

  1. Préparation
    1. Préparer méthanol glacé.
    2. Préparer TBS (pH 7,4) contenant du sérum de chèvre à 4%.
    3. Préparer 1 ml de TBS (pH 7,4) contenant du DAPI (50 à 100 ng / ml).
    4. Préparer 100 ml de milieu de montage tel que décrit au point 2.1.5.
  2. Retirez le milieu de culture par aspiration à 48-72 heures après transfection (voir Protocole 1) pour la fixation des cellules. Rincer les cellules une fois avec le SCT. Appliquer TBS sur le côté du puits de culture afin d'éviter de perturber la surface des cellules.
    Remarque: Le point de temps optimal pour la fixation de la cellule doit être déterminée empiriquement.
  3. Fixer les cellules dans du méthanol glacé, et incuber les cellules pendant 6 min à -20 ° C. Rincer les cellules deux fois avec TBS pour éliminer suffisamment méthanol résiduel.
  4. L'utilisation d'un stylo barrière hydrophobe (voir la liste des matériaux / équipement), dessiner un carré ou un cercle vert pâle pour créer une barrière hydrophobe autour de chaque échantillon de verre de couverture. Ne pas toucher ni trop près des cellules avec le stylo barrière hydrophobe.
  5. Bloquer les sites de liaison non spécifiques sur le cellulols par l'ajout de TBS contenant du sérum de chèvre à 4%. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
  6. Diluer un anticorps anti-Flag (1: 1000 dilution) et soit un anticorps anti-CENP-B (rapport de dilution de 1: 200) ou ACA (1: 2000 taux de dilution) en tant que marqueur d'emplacement de centromère dans du TBS contenant du sérum de chèvre à 4% .
    Remarque: Pour des résultats optimaux, la concentration finale de l'anticorps primaire dans cette solution doit être déterminée de manière empirique.
  7. Appliquer un volume suffisant (environ 30 pi) de l'anticorps primaire dilué pour immerger l'échantillon cellulaire. Incuber l'échantillon de cellules pendant 1 heure à 37 ° C. Rincer les cellules 5 fois avec le tampon de blocage pendant une période de 30 min. Pour des résultats optimaux ( à savoir la perte minimale de cellules), la condition de lavage optimale doit être déterminée empiriquement.
  8. Diluer un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (rapport de dilution de 1: 100 à 1: 200) dirigés l'un contre l'anticorps primaire dans du TBS contenant du sérum de chèvre à 4%.
    Remarque: Pour des résultats optimaux, le final Concentration de l'anticorps secondaire dans cette solution doit être déterminée de manière empirique.
  9. Appliquer un volume suffisant (environ 30 pi) de l'anticorps secondaire dilué pour immerger l'échantillon cellulaire. Incuber l'échantillon de cellules pendant 1 heure à 37 ° C. Rincer les cellules 3 fois avec le tampon de blocage.
  10. Appliquer un volume suffisant de la solution TBS contenant du DAPI (50-100 ng / ml) pour immerger l'échantillon cellulaire. Incuber l'échantillon de cellules pendant 5 min à température ambiante. Rincer les cellules 1-2 fois avec TBS.
  11. Monter le couvercle en verre qui contient l'échantillon de cellules sur la lame micro comme décrit dans 2.11.

5. Immunofluorescence Observation d'image, Acquisition, Quantification et analyse

  1. Observer l'échantillon cellulaire à travers un microscope à fluorescence motorisé équipé d'un objectif 63X et 100X à immersion d'huile, une source extérieure de lumière compacte et une caméra CCD numérique.
  2. Effectuer l'acquisition d'images et de traitement, y compris déconvolution, par l'utilisation du logicielA, ou Softwares B1 et B2 (voir la liste des matériaux / équipement). S'il vous plaît voir Supplemental Files (5.2.1) Code pour toutes les commandes utilisées dans le logiciel A. Pour toutes les commandes utilisées dans Softwares B1 et B2, s'il vous plaît voir (5.2.2) dans les fichiers de code supplémentaire.
  3. Utilisez une méthode 23-25 ​​décrit précédemment pour quantifier les signaux de protéines centromériques-kinétochore (par exemple, les signaux de CENP-A au centromère restant) avec les modifications mineures suivantes:
    1. Sélectionner la zone des protéines centromère kinétochore et celle de l'arrière-plan comme suit:
      1. cellulaire mitotique: (région centromère-kinétochore) Sélectionnez la zone de chevauchement avec des chromosomes colorés avec DAPI; (région d'arrière - plan) et zone à l' extérieur mais à l' intérieur des chromosomes de la cellule unique identiques (région -à- dire, cytosolique).
      2. cellulaire interphase: (région centromère-kinétochore) Sélectionnez la zone de chevauchement avec la chromatine colorées avec DAPI; (Région d'arrière-plan) et zone à l'extérieur de la chromatine, mais l'intérieur de la cellule unique identique ( ie, région cytosolique).
        Note: Voir aussi Supplemental Files (5.2.1.4.3) ou (5.2.2.6.4) Code pour la sélection de la zone avec le logiciel A ou logiciel B2, respectivement.
    2. Quantifier le pourcentage des autres signaux aux centromères en utilisant Software A ou B. Pour cette tâche, utilisez la formule suivante:
      Restant signaux de protéines centromère-kinétochore au niveau du centromère-kinétochore
      figure-protocol-1
      où s est la luminosité du signal de la zone sélectionnée, ce qui est confirmé par l' ACA ou CENP-B coloration; b est la luminosité de signal de fond; échantillon de r est les signaux d'ACA de référence ou CENP-B pour les siRNA (s) des cellules traités par ; et r ctrl est l'ACA de référence ou des signaux CENP-B pour les cellules Luc siRNA-transfectées.
      Remarque: Dans cette analyse, les signaux CENP-B ont été utilisés comme signaux de référence pour CUL4A et RBX1 comme décrit dans les rapports précédents.
    3. Utilisez un fichier Excel pour ce calcul après copier et coller les données brutes à partir du logiciel signal de quantification décrit ci-dessus. Voir aussi Fichiers de code supplémentaire: (5.2.1.4) et (5.2.2.6) pour plus de détails. Un exemple de calcul est indiquée dans le tableau 3.
  4. Analyser au moins 20 cellules pour éliminer la variation de coloration et d'acquisition d'image pour chaque niveau de mesure. Vous pouvez éventuellement utiliser "valeur moyenne" des signaux centromériques-kinétochore restant pour chaque cellule analysée pour comparer ces valeurs entre les différentes protéines centromériques-kinétochore.

6. Western Blot L'analyse des protéines totales

  1. Remettre en suspension les cellules dans dénaturant tampon A (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 50 mM, 0,5% de Nonidet P-40, 0,5% de désoxycholate, 0,5% de SDS, 1 mM d'EDTA et complète inhibiteur de protéase cocktail d'EDTA), 26 , sous réserve de la suspension à une sonication et le processus de congélation-décongélation, et mesureLes concentrations de protéines comme suit:
    1. Pour le processus de sonication, ajouter 50 pi de tampon A aux cellules recueillies à partir de deux puits d'une plaque de polystyrène à 6 puits à 48-72 heures après transfection (voir Protocole 1). Faire fonctionner un sonicateur équipé corne disrupteur et micropointe (voir la liste des matériaux / équipement) pour une durée totale de 15 sec intermittente impulsion (cycle de service de 50%) par un échantillon.
    2. Pour le procédé de congélation-décongélation, de geler les cellules avec de l'azote liquide et décongeler les cellules à la température ambiante.
    3. Mesurer la concentration de protéines en utilisant un dosage de protéine commerciale réactif I ou II (voir la liste des matériaux / équipement).
      Nota: Les lysats sont dilués avec rapport de 1:10 dans la mesure des concentrations de protéine soit avec le réactif I ou II. À cette dilution, le SDS présent dans le tampon A montre peu ou pas d'interférence dans cette mesure.
  2. Mélanger le lysat contenant 20-30 ug de protéine totale avec le tampon de chargement 2 × ou 4 × SDS-PAGE. 27 Faire bouillir les échantillons pour5 min, puis les charger sur un 12.0% -15.0% dénaturant SDS-polyacrylamide gel d'électrophorèse.
  3. Transférer les protéines séparées par SDS-PAGE sur une membrane de PVDF en utilisant un procédé Western Blot décrit précédemment. 17,24,27-31
    1. Bloquer les sites de liaison non spécifiques sur la membrane avec 5% de lait non gras dans 1 x PBS, puis incuber la membrane avec des solutions d'anticorps primaires dilués pendant 1 heure à température ambiante. Voir la liste des matériaux / équipement pour des informations détaillées (par exemple, le taux de dilution) de chaque anticorps primaire.
    2. Après lavage des membranes 3-4 fois (chaque incubation de 3 à 5 min avec agitation) avec du tampon PBS-T (1 x PBS et 0,1% de Tween-20), incuber la membrane dans un mélange proche de l'infrarouge (IR) anticorps secondaires colorant fluorescent conjugué (rapport de dilution de 1: 20 000), des anticorps secondaires DyLight conjugués (rapport de dilution de 1: 20 000) et / ou la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à des anticorps secondaires (dilué dans du PBS-T, dilutile rapport de 1: 10000) pendant 1 heure à température ambiante. Voir la liste des matériaux / équipement pour des informations détaillées (par exemple, le taux de dilution) de chaque anticorps secondaire.
  4. Laver la membrane 3 fois, puis balayer la membrane pour analyser les protéines avec le système d'imagerie infrarouge et / ou l'imageur de chimioluminescence pour la détection de immunoblot (voir la liste des matériaux / équipement).
    1. Pour utiliser le système d'imagerie infrarouge, voir (6.4.1) dans les fichiers de code supplémentaire.
    2. Pour utiliser l'imageur de chimioluminescence, voir (6.4.2) dans les fichiers de code supplémentaire. Utiliser un substrat ultra-sensible chimioluminescent renforcé (ECL) (voir la liste des matériaux / équipement) pour ce système.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L' analyse par immunofluorescence de CENP-A endogène soutient l'hypothèse que CUL4A-ligase E3 est nécessaire pour la localisation de CENP-A centromères
Nos études récentes ont montré que l' activité de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 est nécessaire pour ubiquitylation de la lysine 124 (K124) sur CENP-A et la localisation de CENP-A à centromères. 17 Initialement, le complexe interphase-centromère (ICEN) a été isolé par anti-CENP-a: immunoprécip...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours des dernières années , de nombreuses études ont développé différents tests de microscopie quantitative pour les cellules fixes. 42 Progrès dans centromère-kinétochore biologie nécessite souvent une compréhension de la fonction centromère spécifique ou spécifique à kinétochore de protéines de laquelle la régulation spatio-temporelle subcellulaire reflète l'évolution des fonctions de ces protéines au cours du cycle cellulaire. Par conséquent, nous avons développé ici des procédés de coloration IIF ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le NIH subvention GM68418.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668réactif de transfection I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778réactif de transfection II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Milieu sérique réduit, chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
DMEM à haute teneur en glucose (Dulbecco' Eagle modifié' s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM à haute teneur en glucose, chaud à 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Sérum de veau fœtal, certifié, inactivé par la chaleur, origine américaineLife Technologies/Gibco10082FBS (sérum de veau fœtal)
Poly-L-Lysine SOLUTIONSIGMA-SLDRICHP 8920Poly-L-Lysine, 0,1 % p/v, dans l’eau
UltraPure Distilled WaterLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Eau stérile de qualité culture tissulaire  ;
Verre Micro Cover (22 mm x 22 mm)Surgipath105(22 mm x 22 mm)
Grappe de culture cellulaire à 6 puitsFisher/Corning Incorporated07-200-83Plaque de polystyrène à 6 puits  ;
Pénicilline, Streptomycine ; LiquideFisher/Gibco15-140Pénicilline-streptomycine
PAP PEN  ;Site de liaisonAD100.1Stylo barrière hydrophobe (pour une barrière hydrofuge dans la coloration immunofluorescente)
Paclitaxel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol pour l’analyse des cellules mitotiques
TN-16, inhibiteur des microtubules (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 pour l’analyse des cellules mitotiques
BSA (albumine sérique bovine)SIGMA-SLDRICHA7906Réactif bloquant
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Détergent pour perméabilisation
ParaformaldéhydeSIGMA-SLDRICHP6148Fixation reagant
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Pour la coloration nucléaire
p-phénylènediamineSIGMA-SLDRICHP6001Pour le montage de
micro-lames VWR moyennes, dépoliVWR International48312-013Micro-diapositives  ;
Anticorps anti-CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Anticorps monoclonal de souris ; rapport de dilution de 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticorps anti-CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PAnticorps monoclonal de souris ; rapport de dilution de 1:200 (IIF, fixation du méthanol/acétone)-1:400 (IIF, fixation du paraformaldéhyde)
Anticorps anti-CENP-B  ;abcamab25734Anticorps polyclonal de lapin ; rapport de dilution de 1:200 (IIF, fixation du méthanol/acétone)-1:400 (IIF, fixation du paraformaldéhyde)
Anticorps anti-centromère (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Antisérum du centromère humain ; taux de dilution de 1:2000 (IIF)
Anticorps anti-CENP-HBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:200 (IIF)
Anticorps anti-CENP-HBD612142Anticorps monoclonal de souris ; taux de dilution de 1:200 (IIF)
Anticorps anti-CENP-IN/A, Dr. Katusmi KitagawaN/A, Dr. Katusmi KitagawaAnticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:1000 (IIF) ; Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anticorps anti-KNL1Novus BiologicalsNBP1-89223Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:100 (IIF)
Anticorps anti-Hec1Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Anticorps monoclonal de souris ; taux de dilution de 1:100 (IIF)
Anticorps anti-Hec1GeneTexGTX110735Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:100 (IIF)
Anticorps anti-Ska1abcamab46826Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:100 (IIF)
Anticorps anti-drapeauSIGMA-ALDRICHF3165Anticorps monoclonal de souris ; rapport de dilution de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticorps anti-drapeauSIGMA-ALDRICHF7425Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A anticorpsN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriAnticorps polyclonal de lapin ; rapport de dilution de 1:3000 (WB) ; Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anticorps anti-RBX1Signalisation cellulaire4397Anticorps polyclonal de lapin ; taux de dilution de 1:2000 (WB)
Anticorps anti-GAPDHChemiconMAB374Anticorps monoclonal de souris ; taux de dilution de 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11001anticorps secondaire conjugué au fluorophore (anticorps secondaire purifié par affinité)
Alexa Fluor 594 AnticorpsInvitrogenA11005(anticorps secondaire purifié par affinité)
Alexa Fluor 488 Chèvre IgGLife Technologies/InvitrogenA11008Anticorps secondaire conjugué au fluorophore (anticorps secondaire purifié par affinité)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11012Anticorps secondaire conjugué au fluorophore (anticorps secondaire purifié par affinité)
Lait écrémé en poudre (substitution approuvée du lait en poudre d’œillet)Fisher ScientificNC9255871 (Réapprovisionnement n° 190915 ; Lot# 90629)Lait écrémé
Leica DM IRE2 microscope à fluorescence motoriséLeica  ;
HCX PL APO 63x objectif à immersion dans l’huileLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X objectif à immersion dans l’huile
HCX PL APO 100x objectif à immersion dans l’huileLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X objectif à immersion dans l’huile
Leica EL6000 source lumineuse compacteLeicaSource lumineuse externe compacte pour l’excitation fluorescente
Caméra numérique CCD ORCA-R2  ;Caméra CCD numériqueHamamatsu C10600-10B
Logiciel d’imagerie scientifique Openlab version 5.5.2Perkin Elmer/ImprovisionPour l’observation, l’acquisition, la quantification et l’analyse d’images
Velocity version 6.1.1 Logiciel d’analyse d’images 3D  ;Perkin Elmer/ImprovisionPour l’observation, l’acquisition, la quantification et l’analyse d’images Cocktail
complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTARoche11873580001/11836170001Comprimés cocktail d’inhibiteurs de protéase
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Réactif de dosage des protéines commercial I pour la mesure de la concentration en protéines (compatible avec 2 % SDS)
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Réactif de dosage des protéines commercial II pour la mesure de la concentration en protéines (compatible avec 0,1 % SDS)
Immobilon-FLEMD MilliporeIPFL00010membrane PVDF pour le transfert
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR Biosciences926-32210Anticorps secondaire conjugué au colorant fluorescent IR (anticorps secondaire purifié par affinité) ; taux de dilution de 1:20000 (IIF)
IRDye 680 IgG anti-lapin de chèvreLi-COR Biosciences926-32221Anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (anticorps secondaire purifié par affinité) ; taux de dilution de 1:20000 (IIF)
IgG anti-souris de chèvre DyLight 549Fisher ScientificPI35507Anticorps secondaire conjugué à DyLightAnticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (anticorps secondaire purifié par affinité) ; taux de dilution de 1:20000 (IIF)
Anti-lapin DyLight 649Fisher ScientificPI35565Anticorps secondaire conjugué à DyLightAnticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (Anticorps secondaire purifié par affinité) ; rapport de dilution de 1:20000 (IIF)
la souris IgG-HRPSanta CruzSC-2005Anticorps secondaire conjugué à HRP DyLightAnticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (Secondaire purifié par affinité anticorps) ; taux de dilution de 1:10000 (IIF)
IgG-HRP anti-lapinde chèvre Santa CruzSC-2004Anticorps secondaire conjugué à la HRPDanticorps secondaire conjugué à DyLightAnticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent IR (anticorps secondaire purifié par affinité) ; taux de dilution de 1:10000 (IIF)
Openlab version 5.5.2. Logiciel d’imagerie scientifique  ;Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity version 6.3 Logiciel d’analyse d’images 3D (Volocity Acquisition)PerkinElmerSoftware B1
Volocity version 6.3 Logiciel d’analyse d’images 3D (quantification de la volocité)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450
Sonicator Branson Sonicator à ultrasons Microtip Step, Solide, Fileté 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.  ; 33995-325Disrupteur pavillon pour sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mmVWR Scientific Products Inc.  ; 33996-185Micropointe pour sonication
Odyssey CLx Système d’imagerie infrarougeLI-COR BiosciencesSystème d’imagerie infrarouge pour la détection d’immunoblot
Logiciel d’analyse Image Studio Ver 4.0  ;LI-COR BiosciencesSoftware C
Imageur moléculaire Versadoc MP4000 System  ;Bio-Radpour la détection d’immunoblot
Quantité Un logiciel d’analyse 1D  ;Bio-RadSoftware D
SuperSignal West Substrat à sensibilité maximaleThermo34095Substrat chimiluminescent amélioré (ECL) ultra-sensible
Verre de protection secondaire conjugué au fluorophore .Microscope à fluorescence motorisé Anticorps secondaire conjugué à Imageur de chimiluminescence

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold. J Cell Biol. 98, 352-357 (1984).
  3. Hoffman, D. B., Pearson, C. G., Yen, T. J., Howell, B. J., Salmon, E. D. Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins at PtK1 kinetochores. Molecular biology of the cell. 12, 1995-2009 (2001).
  4. Regnier, V., et al. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubR1. Mol Cell Biol. 25, 3967-3981 (2005).
  5. Bernad, R., Sanchez, P., Losada, A. Epigenetic specification of centromeres by CENP-A. Exp Cell Res. 315, 3233-3241 (2009).
  6. Black, B. E., Cleveland, D. W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes. Cell. 144, 471-479 (2011).
  7. Warburton, P. E., et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 7, 901-904 (1997).
  8. Karpen, G. H., Allshire, R. C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function. Trends Genet. 13, 489-496 (1997).
  9. Black, B. E., et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature. 430, 578-582 (2004).
  10. Black, B. E., et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-A targeting domain. Mol Cell. 25, 309-322 (2007).
  11. Fachinetti, D., et al. A two-step mechanism for epigenetic specification of centromere identity and function. Nat Cell Biol. 15, 1056-1066 (2013).
  12. Zeitlin, S. G., Shelby, R. D., Sullivan, K. F. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. The Journal of cell biology. 155, 1147-1157 (2001).
  13. Zhang, X., Li, X., Marshall, J. B., Zhong, C. X., Dawe, R. K. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. The Plant cell. 17, 572-583 (2005).
  14. Goutte-Gattat, D., et al. Phosphorylation of the CENP-A amino-terminus in mitotic centromeric chromatin is required for kinetochore function. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8579-8584 (2013).
  15. Bailey, A. O., et al. Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation of centromeric chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 11827-11832 (2013).
  16. Samel, A., Cuomo, A., Bonaldi, T., Ehrenhofer-Murray, A. E. Methylation of CenH3 arginine 37 regulates kinetochore integrity and chromosome segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9029-9034 (2012).
  17. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Dev Cell. , (2015).
  18. Chan, G. K., Liu, S. T., Yen, T. J. Kinetochore structure and function. Trends in cell biology. 15, 589-598 (2005).
  19. Hori, T., Okada, M., Maenaka, K., Fukagawa, T. CENP-O class proteins form a stable complex and are required for proper kinetochore function. Molecular biology of the cell. 19, 843-854 (2008).
  20. Fukagawa, T., Earnshaw, W. C. The centromere: chromatin foundation for the kinetochore machinery. Developmental cell. 30, 496-508 (2014).
  21. Kedersha, N. The Proteintech Blog.Proteintech. Grainger, D. , Proteintech Group. (2012).
  22. Clontech Laboratories, Inc. HeLa Tet-Off Advanced Cell Line. , Available from: http://www.clontech.com/CR/Products/Inducible_Systems/Tetracycline-Inducible_Expression/ibcGetAttachment.jsp?cItemId=26908&fileId=6712191&sitex=10020:22372:US (2012).
  23. Meraldi, P., Sorger, P. K. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. EMBO J. 24, 1621-1633 (2005).
  24. Niikura, Y., et al. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, causes kinetochore defects: a novel mechanism by which 17-AAG inhibits cell proliferation. Oncogene. 25, 4133-4146 (2006).
  25. Yang, Z., et al. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, 4062-4074 (2005).
  26. Wang, H., et al. Histone H3 and H4 ubiquitylation by the CUL4-DDB-ROC1 ubiquitin ligase facilitates cellular response to DNA damage. Mol Cell. 22, 383-394 (2006).
  27. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR? Trends Biochem Sci. 20, 257-259 (1995).
  28. Kitagawa, K., Skowyra, D., Elledge, S. J., Harper, J. W., Hieter, P. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex. Mol Cell. 4, 21-33 (1999).
  29. Niikura, Y., Dixit, A., Scott, R., Perkins, G., Kitagawa, K. BUB1 mediation of caspase-independent mitotic death determines cell fate. J Cell Biol. 178, 283-296 (2007).
  30. Niikura, Y., Kitagawa, K. Identification of a novel splice variant: human SGT1B (SUGT1B). DNA Seq. 14, 436-441 (2003).
  31. Niikura, Y., Ogi, H., Kikuchi, K., Kitagawa, K. BUB3 that dissociates from BUB1 activates caspase-independent mitotic death (CIMD). Cell Death Differ. 17, 1011-1024 (2010).
  32. Ando, S., Yang, H., Nozaki, N., Okazaki, T., Yoda, K. CENP-A, -B, and -C chromatin complex that contains the I-type alpha-satellite array constitutes the prekinetochore in HeLa cells. Mol Cell Biol. 22, 2229-2241 (2002).
  33. Izuta, H., et al. Comprehensive analysis of the ICEN (Interphase Centromere Complex) components enriched in the CENP-A chromatin of human cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 11, 673-684 (2006).
  34. Obuse, C., et al. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes Cells. 9, 105-120 (2004).
  35. Merlet, J., Burger, J., Gomes, J. E., Pintard, L. Regulation of cullin-RING E3 ubiquitin-ligases by neddylation and dimerization. Cell Mol Life Sci. 66, 1924-1938 (2009).
  36. Bennett, E. J., Rush, J., Gygi, S. P., Harper, J. W. Dynamics of cullin-RING ubiquitin ligase network revealed by systematic quantitative proteomics. Cell. 143, 951-965 (2010).
  37. Antonelli, A., et al. Efficient inhibition of macrophage TNF-alpha production upon targeted delivery of K48R ubiquitin. Br J Haematol. 104, 475-481 (1999).
  38. Codomo, C. A., Furuyama, T., Henikoff, S. CENP-A octamers do not confer a reduction in nucleosome height by AFM. Nat Struct Mol Biol. 21, 4-5 (2014).
  39. Thrower, J. S., Hoffman, L., Rechsteiner, M., Pickart, C. M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. The EMBO journal. 19, 94-102 (2000).
  40. Yoda, K., et al. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 7266-7271 (2000).
  41. Shelby, R. D., Vafa, O., Sullivan, K. F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires a cooperative array of nucleosomal DNA contact sites. J Cell Biol. 136, 501-513 (1997).
  42. Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes. J Vis Exp. , (2014).
  43. Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N., Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109, 1963-1973 (1989).
  44. Yoda, K., Kitagawa, K., Masumoto, H., Muro, Y., Okazaki, T. A human centromere protein, CENP-B, has a DNA binding domain containing four potential alpha helices at the NH2 terminus, which is separable from dimerizing activity. J Cell Biol. 119, 1413-1427 (1992).
  45. Sugata, N., et al. Human CENP-H multimers colocalize with CENP-A and CENP-C at active centromere--kinetochore complexes. Hum Mol Genet. 9, 2919-2926 (2000).
  46. Earnshaw, W. C., Ratrie, H. 3rd, Stetten, G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98, 1-12 (1989).
  47. Goshima, G., Kiyomitsu, T., Yoda, K., Yanagida, M. Human centromere chromatin protein hMis12, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J Cell Biol. 160, 25-39 (2003).
  48. Liu, S. T., Rattner, J. B., Jablonski, S. A., Yen, T. J. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol. 175, 41-53 (2006).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. T time for point centromeres. Nat Cell Biol. 14, 559-561 (2012).
  50. Gascoigne, K. E., et al. Induced ectopic kinetochore assembly bypasses the requirement for CENP-A nucleosomes. Cell. 145, 410-422 (2011).
  51. Nishino, T., et al. CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly. EMBO J. 32, 424-436 (2013).
  52. Malvezzi, F., et al. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J. 32, 409-423 (2013).
  53. Schleiffer, A., et al. CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex. Nat Cell Biol. 14, 604-613 (2012).
  54. Rago, F., Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Distinct organization and regulation of the outer kinetochore KMN network downstream of CENP-C and CENP-T. Curr Biol. 25, 671-677 (2015).
  55. Nishino, T., et al. CENP-T-W-S-X forms a unique centromeric chromatin structure with a histone-like fold. Cell. 148, 487-501 (2012).
  56. Bodor, D. L., et al. The quantitative architecture of centromeric chromatin. Elife. 3, e02137(2014).
  57. Oliver, C. Ch 58. Molecular Biomethods Handbook. Rapely, R., Walker, J. M. , Humana Press. 1063-1079 (2008).
  58. Terasima, T., Tolmach, L. J. Changes in x-ray sensitivity of HeLa cells during the division cycle. Nature. 190, 1210-1211 (1961).
  59. Levenson, G. B. R. Ch 8. Biomedical Photonics Handbook. Vo-Dinh, T. uan , CRC Press LLC. 8-19 (2003).
  60. Sanderson, J. Fluorescence bleed-though. , Available from: http://www.gum2012.fionastoreydesign.co.uk/Downloads/Bleed through text.pdf (2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Immunofluorescence AnalysisCentromere Kinetochore ProteinsEndogenous Exogenous ProteinsParaformaldehyde FixationFlag tagged CENP AHuman Cell CultureIndirect Immunofluorescence StainingFluorescence MicroscopyProtein Localization QuantificationCell Fixation Protocol

Articles connexes