Article de méthode

Transcriptome profilage des In-Vivo embryons de bovins pré-implantation à l'aide de deux couleurs Microarray Plate-forme

DOI :

10.3791/53754

⸱

30 janvier 2017

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1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technologie des microréseaux permet une mesure quantitative et un profilage de l’expression génique des transcrits à l’échelle du génome. Par conséquent, ce protocole fournit une procédure technique optimisée dans un réseau bovin bicolore fabriqué sur mesure à partir d’embryons de bovins du jour 7 pour démontrer la faisabilité de l’utilisation d’une faible quantité d’ARN total.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La perte embryonnaire précoce est un facteur important d’infertilité chez les bovins. De plus, le bovin devient un modèle intéressant pour étudier le développement de l’embryon préimplantatoire humain en raison de leur processus de développement similaire. Bien que l’on sache que les facteurs génétiques affectent le développement embryonnaire précoce, la découverte de ces facteurs a été un sérieux défi. La technologie des microréseaux permet de mesurer quantitativement et d’établir le profil de l’expression génique des niveaux de transcrits à l’échelle du génome. L’une des principales décisions à prendre lors de la planification d’une expérience de microréseau est d’utiliser une approche unicolore ou bicolore. La conception bicolore augmente la réplication technique, minimise la variabilité, améliore la sensibilité et la précision et permet d’avoir des conceptions en boucle, définissant les échantillons de référence communs. Bien que les puces à ADN soient un outil biologique puissant, il existe des pièges potentiels qui peuvent atténuer sa puissance. Par conséquent, dans cet article technique, nous démontrons un protocole optimisé pour l’extraction, l’amplification, le marquage, l’hybridation de l’ARN amplifié marqué à la puce, le balayage de la matrice et l’analyse des données en utilisant la stratégie d’analyse bicolore.

Introduction

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Perte embryonnaire précoce chez les vaches laitières à forte production est l' un des principaux défis dans l'industrie laitière 1, 2. Bovine est devenu un modèle intéressant pour étudier le développement préimplantatoire d'embryons humains en raison de leur processus similaire de développement 3, 4. Cependant, plus de recherche est nécessaire pour avoir une meilleure compréhension des gènes impliqués dans le développement embryonnaire précoce bovine.

Après vingt ans depuis la première technologie de microréseau développé en 1995 5, le développement des plus sophistiqués technologie sonde de fabrication réduit les erreurs d'impression et de la variabilité des puces de réseau au sein et entre les différentes plates - formes de biopuces 6. La technologie des microréseaux améliorée a donné lieu à une large application de cette technologie dans la recherche clinique 7 et , plus récemment, au début de l' embryon qévaluation de la ualité 8.

La grande quantité de matériel nécessaire à la technologie des microréseaux est la principale raison pour laquelle la technologie des microréseaux d'abord échoué à entrer dans un certain nombre de domaines de recherche tels que le développement embryonnaire précoce. Plus récemment, des procédés d'amplification de l' ARN ont été améliorés pour amplifier de façon linéaire jusqu'à l' ARN microgrammes niveau de la sous-nanogramme matériau de départ d'ARN 9. Il existe plusieurs trousses d'amplification d'ARN disponibles dans le commerce sur le marché; cependant, les kits les plus populaires bien développés sont liés à Ribo-Single Primer Isotherme Amplification 10 et promoteur T7 entraînés 11 méthodes. L'amplification de l' ARN anti - sens le plus populaire utilise la transcription in vitro avec une amorce oligo dT liant à un promoteur T7 à l' extrémité 5 '12. Cette technologie permet le maintien de la plupart des transcriptions anti-sens représentatifs après amplification linéaire fou des réseaux d' hybridation 13. Cette méthode a été adaptée pour amplifier le niveau picogramme de l' ARN total extrait de bovin embryon 8.

Système d' attelage universel (ULS) est la méthode de marquage qui intègre directement l'ADN ou de l' ARN amplifié par un colorant fluorescent platine lié soit Cyanine 547 ou Cyanine 647, en formant une liaison de coordination sur la position N7 de la guanine 14. Cette méthode a été adaptée dans la recherche sur les embryons pour générer plus stable amplifié ARNa sans modification par rapport à la aminoallyl modifié ARNa généré par la méthode enzymatique 15. méthodes Les deux colorants unique et d'étiquetage des deux colorants ont été adaptés à l'aide système d'attelage universel dans microarray. Une vaste étude de comparaisons de puces à ADN était qu'il existe une bonne corrélation entre la qualité des données entre les plates - formes de réseau d' une ou deux couleurs 6.

Récemment, à la fois promoteur T7 entraînementméthodes n ARN antisens d'amplification et de marquage ULS ont été développés pour fournir un protocole plus fiable pour générer une quantité suffisante de haute qualité marqué matériaux Arna pour microarray hybridation 8, 16. Par conséquent, cette étude fournit un protocole pour démontrer certaines des étapes importantes de l'extraction de l'ARN à l'analyse des données impliquées dans deux couleurs microréseaux utilisant Jour 7 embryons de bovins, par exemple.

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Protocole

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La partie animale de cette étude a été réalisée à l'Unité de recherche métabolique de l'Université de l'Alberta, Edmonton, Canada, avec tous les animaux des procédures expérimentales approuvé (Protocole # AUP00000131) de l'Université de l'Alberta Animal Care et utilisation Comité, et les animaux pris en charge selon au Conseil canadien des directives de protection des animaux (1993).

1. Embryon Production, purification d'ARN total et traitement DNase

  1. Pour animaux protocoles expérimentaux et collecte d'embryons se référer dans nos publications antérieures 17, 18.
  2. Piscine et enclenchez congeler des embryons de stade similaire de chaque vache dans de l'azote liquide, puis conserver à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ARN.
  3. Extraire l' ARN total via un ARN kit d'extraction sur la base de la colonne, qui permet d'extraire l' ARN à partir d' échantillons pico-échelle (information kit est disponible dans la liste Matériel).
    NOTE: Recommandé kit contient: Conditionnement tampon, Extraction Buffer, 70% d'éthanol, Wash Buffer 1, Wash Buffer 2, Elution Buffer, des colonnes de purification d'ARN avec des tubes collecteurs et des tubes de microcentrifugation.
  4. Ajouter 10 ul Extraction Buffer à tubes contenant des embryons et incuber pendant 30 min à 42 ° C. Tube à centrifuger à 800 g pendant 2 min pour recueillir un extrait de cellules dans le tube à centrifuger.
  5. Introduire à la pipette 250 ul de tampon de conditionnement sur la membrane filtrante de la colonne de purification. Incuber la colonne de purification de l'ARN avec du tampon de conditionnement pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger la colonne de purification dans le tube de prélèvement à 16 000 x g pendant 1 min.
  6. Pipette 10 ul de 70% d'éthanol dans le mélange d'ARN Extraction Buffer et embryons. Bien mélanger par pipetage de haut en bas. mélange Pipette dans la colonne de purification préconditionnés.
  7. Pour lier l'ARN, centrifuger la colonne de purification pendant 2 min à 100 xg et suivre immédiatement par une centrifugation à 16.000 xg pendant 30 s pour éliminer l'écoulement à travers.
  8. pipette 10081, L 1 de tampon de lavage dans la colonne d'épuration et centrifuger pendant 1 min à 8000 x g.
    NOTE: DNase traitement est recommandé si effectuer la transcription inverse ou d'amplification après l'isolement de l'ARN.
  9. Digest ADN génomique juste après l'étape 1.8.
    NOTE: Recommandé kit DNase est disponible dans la liste Matériel. kit recommandé contient: DNase I solution mère et le tampon.
  10. Préparer le mélange d'incubation de DNase en mélangeant 5 pi DNase I solution mère avec 35 pi de tampon. Mélanger en retournant doucement.
  11. Pipeter le mélange d'incubation 40 ul de DNase directement dans la membrane de la colonne d'épuration. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
  12. Pipette 40 pi de tampon de lavage 1 dans la membrane de la colonne de purification, puis centrifuger à 8000 xg pendant 15 s.
  13. Introduire à la pipette 100 ul de tampon de lavage 2 dans la colonne de purification et centrifuger pendant 1 min à 8000 x g.
  14. Pipeter une autre 100 ul de tampon de lavage 2 dans la colonne de purification et centrifugerpendant 2 minutes à 16 000 x g.
  15. Transférer la colonne de purification à un nouveau tube de 0,5 ml de microcentrifugation. Introduire à la pipette 11 ul de tampon d'élution directement sur la membrane de la colonne d'épuration. Pour assurer une absorption maximale du tampon d'élution dans la membrane, toucher doucement la pointe de la pipette à la surface de la membrane tout en distribuant le tampon d'élution.
  16. Incuber la colonne pendant 1 min à température ambiante. Centrifuger la colonne pendant 1 min à 1000 x g pour distribuer tampon d'élution dans la colonne, puis tourner pendant 1 min à 16 000 xg pour éluer l'ARN.
  17. Utilisez instrument Bioanalyseur selon les instructions du fabricant pour évaluer la qualité de l' ARN et la quantité 19.
  18. Stocker l'échantillon d'ARN à -80 ° C jusqu'à utilisation.

2. ARN Amplification et d'étiquetage pour l'analyse microarray

NOTE: Pour le premier utilisateur de temps de travail avec des procédures d'amplification d'ARN et d'étiquetage, utiliser cinq ng de pointe dans l'ARN along avec les échantillons réels Ärna pour surveiller la mesure de contrôle de la qualité de l'amplification de l'ARN et l'hybridation. La pointe en ARN mélange contient dix synthétisées, des transcriptions polyadénylés in vitro dans des rapports prédéterminés. Lorsque la procédure effectuée correctement, les transcripts marqués hybrident spécifiquement seulement à des sondes de contrôle complémentaires dans les tableaux et les données peuvent être numérisés pour suivre l'assurance de contrôle de la qualité avec soi minime ou hybridation croisée. Plus de détails Description en ce qui concerne la procédure à pointes-intensités de contrôle et de normalisation après la numérisation réseau et l' analyse des données est se référer à des publications précédentes 20, 21. La procédure suivante est donnée aux utilisateurs de puces à ADN de routine.

  1. Préparer 100 pg de haute qualité échantillon d'ARN (nombre ARN Integrity (RIN) valeur au moins> 7,0) dans un volume total de 10 - 11 pi.
  2. Amplifier les échantillons d'ARN avec un kit d'amplification pouvanttravailler avec des échantillons pico-échelle (aussi peu que 100 pg).
    NOTE: Recommandé informations de kit d'amplification est disponible dans la liste des matériaux et suit les instructions du fabricant, sans aucune modification.
  3. Utiliser une analyse quantitative à base de fluorescence pour évaluer le profil de la plage de taille de l'ARNa amplifié.
  4. Utiliser l'instrument de spectrophotomètre (sur la base de l'absorbance à 260 et 280 nm) pour mesurer la concentration de l'ARNa amplifié.
  5. Stocker le ARNa amplifié à -80 ° C jusqu'au moment de l'étiquetage.
  6. Utilisez 2 pg d'ARN amplifié pour le marquage fluorescent selon ULS ARNa kit de marquage mode d'emploi.
    NOTE: Depuis Cyanine 547 et 647 Cyanine colorant sont sensibles à la photo-dégradation et Cyanine 647 colorant est facilement dégradé par l'ozone, la procédure d'étiquetage a lieu dans une quantité minimale de lumière et sous un environnement exempt d'ozone.
  7. Allumez le boîtier d'ozone (figure 1A) jusqu'à ce que le niveau d'ozone est de 0,001 ppm.
  8. Est - ce que la configuration de la réaction à l' intérieur de la boîte d'ozone (figure 1B) en ajoutant 2 ul de Cyanine 547 ou Cyanine 647, 2 pi de tampon de marquage, puis ajuster à un volume final de 20 pi avec de l' eau sans RNase sous le inactinique. Ajouter un filtre de chambre noire à la source lumineuse.
  9. Mélanger doucement et on incube les tubes dans un thermocycleur à 85 ° C pendant 15 min. Placer les échantillons sur la glace pendant au moins 1 min. Isoler pour recueillir le contenu des tubes avant de poursuivre avec le kit d'extraction d'ARN, à l'exception des mesures liées au traitement DNase (1,9 à 1,11), pour nettoyer l'ARN amplifié Cy-marqué par un colorant.
  10. Utilisez l'instrument de spectrophotomètre pour mesurer et déterminer la concentration d'ARN amplifié marqué et maintenir le ARNa marqué à -80 ° C maximum pendant 3 jours avant utilisation.

3. Microarray Hybridation et laver

REMARQUE: Les étapes importantes suivantes sont adaptées selon le protocole d'analyse à deux couleurs à base de microréseaux Gene Expression (version6.5, mai 2010).

  1. Ajouter la même quantité de 825 ng de chaque Cyanine 547- et Cyanine 647 marqué ARNa et mélanger avec 25x et 10x fragmentation des tampons de blocage.
  2. Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 15 minutes et laisser refroidir sur la glace pendant 1 min.
  3. Ajouter la même quantité de tampon d'hybridation 2x et bien mélanger.
  4. Centrifuger à 13 000 tpm, puis le mélange est prêt pour l'hybridation.
  5. Charger 100 ul du mélange sur la lame de matrice et sceller le coulisseau intérieur de la chambre d'hybridation.
  6. Charger la chambre assemblé dans le four d'hybridation pendant 17 heures à 65 ° C tournant à 10 tours par minute dans le four.
  7. Laver les tableaux selon le protocole avec le traitement de la protection de l'ozone par immersion dans la stabilisation et la solution de séchage pendant 30 s.
  8. Retirez les tableaux de la solution et assurez-vous que la surface du tableau est sec, sans particules de poussière

4. Numérisation Microarray Glisser

  1. Gardez les tableaux dans un endroit sombre et tourner sur scanner jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi (15 min temps d'attente).
  2. Chargez le code à barres de tableau sur la gauche, dans le scanner et lancer la numérisation. Faites l'analyse de la place selon le mode d'emploi du logiciel et enregistrer les données que (GPR) format de fichier.

5. Analyse statistique

  1. Télécharger le logiciel FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Cliquez sur "données brutes import" et charger les fichiers GPR dans FlexArray.
  2. Effectuer la normalisation et l'analyse statistique, si nécessaire en suivant les instructions. Remarque: Calculer le seuil de sélection spot positif dans cette étude comme il a été décrit précédemment 22.
  3. Sélectionnez le menu déroulant manuel de l'observateur de traçage du FlexArray pour afficher toutes les taches hybridées et les signaux de fond. Remarque: Une image similaire de dopés dans les contrôles après hybridation à la puce peut être vu dans l' étude précédente 8.
  4. Sélectionner unnormalisation Loess au sein tableau suivant par un quantile entre le processus de normalisation des tableaux de la FlexArray déroulant manuel en conséquence.
  5. Exporter toutes les données normalisées de FlexArray dans un fichier Excel pour une utilisation ultérieure.

6. Bioinformatique Analyse

L'annotation originale des séquences de sondes de Transcriptions spécifiques Embryon bovine (BESTv1) microarray a été décrit précédemment 8. Dans cette étude, 20,403 Symboles de gènes uniques (GS) ont été obtenus ( Supplément File1 ) par l'intermédiaire du Laboratory Information Management System EmbryoGENE (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Une liste de 6.765 gènes uniques ( Supplément File2 ) a été sélectionné et correspond aux signaux tous positifs après processus microarray de normalisation (étape 5.5) De bovins Jour 7 gène embryons profil d'expression. Seuil de signal positif a été calculé sur la base de la publication 16 de la perméable intensité du signal d'une valeur de A.

  1. Pour effectuer l' analyse fonctionnelle avec PANTHER (Protein analyse via évolutionnaires Relations) Système de classification 23, 24, ouvrir le lien suivant (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
  2. Ajouter une liste de 6.765 GS spécifiques pour identifier les embryons processus biologique spécifique pendant le développement embryonnaire en utilisant le test de surreprésentation statistique et utiliser le paramètre par défaut de Bos taurus (tous les gènes dans la base de données) comme liste de référence 25.
    NOTE: Ceci permet l'identification des processus de développement liés à des termes GO qui sont statistiquement sur- ou sous-exprimées à l'aide d'un test binomial.
  3. Régler le seuil P-valeur à <0,05 en tant que logiciel par défaut. Les données peuvent être téléchargées et exported dans un fichier Excel pour une sélection 16.

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Résultats

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Un résultat représentatif de l' ARN total et amplifiés à partir ARNa Jour 7 embryons de bovins est représenté sur la figure 3 et résumés dans le tableau 1.

l'intégrité de l'ARN et le profil peuvent être évalués après l'extraction de l'ARN. Évaluation de la qualité de l' ARN pourrait être fait par instrument Bioanalyseur (Figure 3A) et seuls les échantillons ayant une valeur su...

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Discussion

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Le premier problème à effectuer l'analyse des microréseaux utilisant Jour 7 embryons de bovins est de ne pas obtenir des quantités suffisantes d'ARN de haute qualité pour l'étude de l'expression des gènes. extraction de l'ARN phénol traditionnel / chloroforme et la méthode de précipitation à l'éthanol ne sont pas recommandés pour Jour 7 embryons, ce qui entraîne un faible rendement et possible phénol restes inhiber la réaction d'amplification d'ARN. Au lieu de cela, une méthode basée sur ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Recherche financée par l’Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk et Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit d’isolement d’ARN PicoPureApplied BiosystemsKIT0204
Kit DNase sans RNase (50)Qiagen79254
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS KitApplied BiosystemsKIT0505
2100 Bioanalyzer InstrumentsAgilent TechnologiesG2940CA
Bande d’écran d’ARNAgilent Technologies5067-5576
Kit d’étiquetage fluorescent ULSKreatech DiagnosticsEA-021
Microréseaux d’expression génique personnalisésAgilent TechnologiesG2514F
Agilent Gene Expression tampon de lavage 1Agilent TechnologiesPart #5188-5325
Tampon de lavage Agilent Gene Expression 2Agilent TechnologiesPart #5188-5326
2x tampon d’hybridation Hi-RPMAgilent Technologies  ; Pièce #5190-0403
25x Tampon de fragmentsAgilent Technologies Pièce#5185-5974
10x Agent de blocage GEAgilent Technologies Pièce#5188-5281
Solution de stabilisation et de séchageAgilent Technologies  ; Pièce #5185-5979
Lames d’étanchéité activées par la technologie Agilent SureHybAgilent TechnologiesG2524-60012Paquet de 20 lames d’étanchéité, 4 microréseaux/lame
Kit de pointe d’ARN bicoloreAgilent Technologies  ; Cat# 5188-5279
GenePix 4000B Scanner de réseauDispositifs moléculairesGENEPIX 4000B-U
Boîte sans ozoneBioTrayOFB_100x200
Fichier GALAgilent Technologies-

Références

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Mots-clés

Embryons bovinsextraction d ARNprofil d expression g niquekit d amplificationmarquage fluorescenthybridation sur pucenormalisation des donn esanalyse statistiqueperte embryonnaire

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