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Article de méthode

Traiter Souris SCA1 avec hydrosolubles composés à non-Spécifiquement Boost Fonction mitochondriale

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DOI :

10.3791/53758

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22 janvier 2017

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1Neuroscience Program, Skidmore College, 2Chemistry Department, Skidmore College, 3Health and Exercise Science Department, Skidmore College

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole biochimique et comportemental pour évaluer l’efficacité de composés hydrosolubles ciblant les mitochondries pour le traitement de l’ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et d’autres maladies neurodégénératives cérébelleuses.

Résumé

Le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle important dans le processus de vieillissement et dans les maladies neurodégénératives, y compris plusieurs ataxie spinocérébelleuse héréditaires et d'autres troubles du mouvement marqué par une dégénérescence progressive du cervelet. L'objectif de ce protocole est d'évaluer la dysfonction mitochondriale dans ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et évaluer l'efficacité du ciblage pharmacologique de la respiration métabolique via le composé acide succinique soluble dans l'eau pour ralentir la progression de la maladie. Cette méthode est applicable à d'autres maladies cérébelleux et peut être adaptée à un grand nombre de thérapies solubles dans l'eau.

Une analyse ex vivo de la respiration mitochondriale est utilisée pour détecter et quantifier les changements liés à la maladie de la fonction mitochondriale. Avec des preuves génétiques (données non publiées) et des preuves protéomique de la dysfonction mitochondriale dans le modèle SCA1 de la souris, nous évaluons l'efficacité du traitement avec le rappel métabolique s soluble dans l'eaul'acide uccinic en dissolvant ce composé directement dans l'eau potable à la maison de la cage. La capacité du médicament à traverser la barrière sang-cerveau peut être déduit en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). L'efficacité de ces composés peut ensuite être testé à l'aide de multiples paradigmes comportementaux, y compris le Rotarod accélération, test de poutre d'équilibre et de l'analyse de l'empreinte. l'intégrité cytoarchitecturales du cervelet peut être évaluée en utilisant des tests d'immunofluorescence qui détectent Purkinje noyaux cellulaires et les dendrites des cellules de Purkinje et soma. Ces méthodes sont des techniques fiables pour la détermination de la dysfonction mitochondriale et l'efficacité du traitement avec des composés solubles dans l'eau dans les maladies neurodégénératives cérébelleuse.

Introduction

Les mitochondries sont les principaux producteurs de l'adénosine triphosphate (ATP), un coenzyme essentiel pour l'énergie cellulaire, avec la majorité de l'ATP mitochondrial produit par phosphorylation oxydative (OXPHOS) en utilisant la chaîne de transport d'électrons. Le cerveau, compte tenu de ses besoins métaboliques élevés et de sa dépendance à l'égard de la phosphorylation oxydative pour alimenter l'activité neuronale, est très sensible à un dysfonctionnement mitochondrial. Par conséquent, un dysfonctionnement mitochondrial est déclenchée au cours du processus de vieillissement, 1 et est impliquée dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives , 2, 3, 4. Par conséquent, il en résulte que les mitochondries sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour la neurodégénérescence.

Dans ce protocole, nous avons adopté l'utilisation de ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) comme une maladie neurodégénérative modèle pour l'étude des mitochondriesl dysfonctionnement et le développement de thérapies ciblées mitochondriales. SCA1 est causée par une mutation polyglutamine (polyQ) d'extension de répétition dans le produit du gène ataxine-1 qui provoque une dégénérescence progressive des neurones de Purkinje du cervelet et les neurones d'autres régions du cerveau. La lignée de souris transgénique utilisé ici (désignée comme la souris SCA1), qui exprime un polyQ mutant ataxine-1 transgène sous le contrôle d'un promoteur spécifique de Purkinje cellules, permet l'analyse ciblée de l'élément de Purkinje cellules de SCA1 5. Les souris subissent SCA1 progressive dégénérescence des cellules de Purkinje et développent une démarche ataxique 6.

dysfonction mitochondriale et complexe mitochondrial ciblé l'efficacité du traitement peuvent être évalués avec une batterie de tests moléculaires et comportementales. Dysfonction mitochondriale complexe est mesurée ex vivo par des tests de respiration qui détectent la consommation altérée d'oxygène dans les tissus cérébelleusela présence de substrats et inhibiteurs 7 de la chaîne de transport d'électrons. Des dosages de respiration ont déjà été utilisés avec des tissus perméabilisées, les isolats mitochondriaux et les tissus ensemble 7, 8, 9. Ils permettent une évaluation directe de la fonction mitochondriale contrairement aux méthodes de collecte de données morphologiques telles que la microscopie électronique à transmission ou immunofluorescence. L'utilisation de tissu entier plutôt que des mitochondries isolées empêche une sélection biaisée des mitochondries saines qui peuvent survenir au cours du processus d'isolement 7. Lorsque adaptée au protocole comme indiqué, le dosage de la respiration est une méthode utile pour détecter un dysfonctionnement mitochondrial dans les états pathologiques neurodégénératifs cérébelleux.

Des activateurs non spécifiques du métabolisme peuvent être utilisées pour déduire la dysfonction mitochondriale dans les modèles de souris transgéniques de diseas neurodégénérativese et de l'aide à la mise au point de nouvelles thérapies. La quercétine, et de la créatine Coenzyme Q10 ont tous été montré pour améliorer la pathologie de la maladie neuro - dégénérative chez les patients et dans des modèles animaux de maladies neuro - dégénératives 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Nous présentons ici un activateur métabolique roman, l'acide succinique, pour stimuler le métabolisme et stimuler la fonction mitochondriale dans les maladies neurodégénératives. Faire en sorte que l'activateur est de traverser la barrière hémato - encéphalique, la HPLC a été utilisée pour détecter la délivrance d' un tissu neural chez les souris traitées 17.

Pour évaluer les effets thérapeutiques des composés solubles dans l'eau métaboliquement ciblés tels que l'acide succinique, une batterie de paradigmes comportementaux et des études immuno-pathologiques peuvent être utilisés. due aux déficits de la coordination motrice trouvées dans les maladies neuro - dégénératives cérébelleuse, le dosage de la piste de l' empreinte, un dosage de faisceau et l' accélération de dosage de tige de rotation sont utilisés pour détecter le comportement de secours de la pathologie 6, 18, 19. Ces mesures sont complétées par une évaluation de immunopathologique cytoarchitecture cérébelleuse , en évaluant l' épaisseur de la couche moléculaire (définie comme étant la cellule de Purkinje dendritique longueur de l' arbre) et les comptages de Purkinje soma des cellules dans un tissu de lobule défini cérébelleuse 6, 20, 21. Nous présentons ici des méthodes neuropathologiques et comportementales multiples pour la détection et le traitement de la dysfonction mitochondriale avec des composés solubles dans l'eau métaboliquement ciblée.

Nous utilisons une analyse ex vivo de la respiration mitochondriale pour analyser un dysfonctionnement mitochondrial dans la tran SCA1souris sgenic. En outre, nous montrons que les symptômes de la maladie et de la pathologie sont améliorées par l'acide mitochondriale rappel succinique soluble dans l'eau, ce qui implique en outre la dysfonction mitochondriale dans progression de la maladie SCA1.

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Protocole

Ce protocole suit les directives du IACUC au Skidmore College pour travailler avec des souris.

1. Traitement par des composés solubles dans l'eau

  1. Dissoudre l'acide succinique à une concentration de 0,75 mg / mL dans de l'eau potable cage. Notez que tout composé d'intérêt à la concentration souhaitée soluble dans l'eau pourrait être substitué à ce stade. Incorporer la solution pour vous assurer que le composé est complètement dissous.
  2. Après que les souris ont atteint l'âge désiré de traitement, à remplacer l'eau de boisson chez des cages du groupe de conditions de traitement avec la solution à l'étape 1.1.
  3. Mesurer le poids des deux bouteilles d'eau de groupe de traitement et de contrôle quotidien pour assurer que les deux traités et les souris témoins boivent la même quantité d'eau. Utilisez ces mesures pour calculer la dose totale de médicament par cage. Continuer le traitement tout au long du poids de la bouteille expérience et le moniteur.

2. analyse de l'empreinte

  1. Placez la piste sur le sol ouune table dans une salle confinée. Réglez la piste à un léger angle vers le haut vers la zone de la maison bordée de literie et récompense alimentaire (par exemple céréales sucrées). Aligner la longueur de la piste avec une feuille de papier blanc. Laisser le sujet à acclimater dans la zone de la maison pendant 5 min.
  2. Retirer le sujet de la zone de la maison et de la peinture pattes arrière gauche et droite, respectivement, avec de la peinture à base d'eau non-toxique bleu et rouge. Les impressions de peinture seront utilisés pour calculer les mesures comportementales de sortie multiple.
  3. Placez le sujet au début de la piste et permettre au sujet de marcher à la boîte de la maison. Une fois que le sujet a atteint la zone de la maison, fermer la trappe, et permettre au sujet de rester dans la zone de la maison pendant une minute avant de revenir à la cage respective. Nettoyer la zone de la piste et la maison avec 30% d'éthanol et remplacer la literie, récompenser la nourriture, et le papier de la piste pour le sujet suivant.
  4. Quantifier nombre de foulées, la largeur de la porte, l'angle de l'étape, et le nombre de tours prisespar sujet selon les méthodes analytiques décrites précédemment 6. Un essai de l'empreinte de succès est défini comme un minimum de 5 empreintes successives dans lesquelles le sujet est la marche vers la zone de but sans se retourner ou d'arrêter.

3. Analyse de faisceau

  1. Mettre en place un appareil de faisceau selon les spécifications barre transversales décrites précédemment 6 avec les 6 faisceaux suivants: poutre 1 = rectangulaire, largeur 28 mm; faisceau 2 = rond, diamètre 28 mm; poutre 3 = rectangulaire, largeur 12 mm; poutre 4 = rond, diamètre 12 mm; poutre 5 = rectangulaire, largeur 6 mm; poutre 6 = rond, 6 mm de diamètre. À une extrémité de la poutre, mettre en place une boîte à la maison sombre avec de la nourriture de récompense.
  2. Pour former des sujets sur la poutre, assembler l'appareil avec un faisceau 3. Placez délicatement le sujet sur l'extrémité de la poutre opposée à la boîte de la maison, et permettre au sujet de marcher à travers. Permettre à chaque sujet jusqu'à trois essais à 2 min pour obtenir une exécution réussie, Défini comme traversant la poutre et entrer dans la zone de la maison à moins de 2 min. Entre les essais, que le sujet reste dans la zone de la maison pendant 2 min. Entre sujets, nettoyer la zone du faisceau et la maison avec 30% d'éthanol et remplacer la nourriture de récompense en préparation pour le prochain sujet.
  3. Répétez l'étape 3.2 fois par jour pendant les deux prochains jours résultant en un total de 3 jours de formation séquentielles. Le jour de l'essai, le jour 4, devrait suivre successivement les jours de formation.
  4. Pour tester les sujets le jour 4, assembler d'abord l'appareil avec un faisceau 1 et mettre en place la boîte de la maison, comme décrit dans l'étape 3.1. Placez une caméra vidéo à l'avant de l'appareil et vérifier que l'appareil à faisceau complet peut être clairement capturé sur vidéo. Commencez l'enregistrement et placez le premier sujet sur la poutre opposée à la boîte de la maison, ce qui permet jusqu'à 3 tentatives de 2 min pour mener à bien un essai. Entre les essais, laisser l'objet reposer pendant 2 min dans la zone de la maison.
  5. Continuer à tester soumis sur chacun des six faisceaux en ordre numérique,permettant ainsi au sujet de se reposer pendant 2 minutes dans la boîte de la maison avant de commencer le faisceau suivant. Entre sujets, nettoyer chaque faisceau et la boîte à la maison avec 30% d'éthanol et remplacer la nourriture de récompense en préparation pour chaque sujet.
    1. Videotape chaque essai et d'enregistrer le nombre d'essais réussis par sujet par faisceau comme suit: «1» indique le sujet a été un succès sur le premier essai, «2» indique le sujet a été un succès sur le second procès, «3» indique le sujet était avec succès le troisième et dernier procès, et «4» indique le sujet n'a pas été retenue sur l'un des trois essais.
  6. Utilisez des enregistrements vidéo des essais mesure par faux mouvements correctrices et correcteurs qui sont aveuglés aux conditions expérimentales du sujet. Définir un footslip comme l'arrière-pied qui est en vue directe de l'immersion de l'appareil photo ci-dessous une ligne médiane théorique sur toute la longueur de la poutre. footslip Scores moyens à partir de plusieurs marqueurs.
  7. Pour analyser le nombre de sessais ÉUSSI et le nombre de données, calculer le faux mouvements moyenne et l'erreur standard au sein de chaque génotype et la condition expérimentale cohorte. Effectuer une analyse ANOVA à une voie et des comparaisons multiples post-hoc afin de déterminer s'il y a un effet du traitement et du génotype sur le nombre d'essais réussis et le nombre de faux mouvements.

4. Accélérer Rotarod

  1. Acclimate sujets à la salle d'essai de 10 min avant le début du procès. Au cours de cette période d'acclimatation, préparer l'appareil de Rotarod, nettoyage chaque couloir de l'appareil avec 30% d'éthanol.
  2. Ouvrez le logiciel Rotarod et définir les paramètres commencer à 4 tours par minute, les paramètres d'accélération à 5 réglages min et vitesse finale à 40 tours par minute. Ces paramètres donnent une accélération constante 4-40 tours par minute sur une période de 5 min. Les souris peuvent rester sur le Rotarod à 40 tours par minute pendant 5 minutes supplémentaires au-delà de la période d'accélération pour une longueur de course maximale de 10 min.
  3. Post-acclimation, place des sujets onto le Rotarod dans leurs couloirs respectifs tandis que la tige tourne à 4 tours par minute. Une fois que tous les sujets sont dans leurs voies respectives, commencer le premier procès. Notez la latence de tomber à l'aide du logiciel de l'instrument; une minuterie secondaire peut être utilisé en tant que sauvegarde.
  4. Après fin de l'essai, permettre à chaque sujet de se reposer dans leurs réservoirs de voies respectives pendant dix minutes avant le prochain essai pour éviter la fatigue.
  5. Répétez les étapes 4.3 et 4.4 pour un total de quatre essais.
  6. Répétez les étapes 4.3 à 4.5 pour un total de quatre jours consécutifs, le traitement tout au long de la période d'essai continue. À la fin, de quantifier la latence à tomber la tige tournante pour chaque essai par sujet 6.

5. cérébelleuse Extraction et fixation

  1. Euthanasier souris via le dioxyde de carbone asphyxie selon les directives institutionnelles IACUC. Placer l'objet dans la chambre de dioxyde de carbone, et de libérer du dioxyde de carbone dans la chambre. Regarderl'animal en tout temps lors de l'étape euthanasier et ne pas laisser l'animal sans surveillance.
  2. Une fois que la respiration a cessé et les sujets ne montrent aucune perception de la douleur reste par la pression de la patte arrière, retirer l'objet de la chambre et faire une incision médiane supérieure à travers le tissu épithélial à partir du milieu du crâne caudale à la base du crâne à travers le tissu épithélial.
  3. Avec des ciseaux de dissection, couper le crâne de la base à la moelle épinière par la suture sagittale au bregma. Couper latéralement à travers chaque suture coronale avant de tirer au large des frontal, pariétal et interpariétales os en utilisant des pinces émoussées.
  4. Utilisez une pince contondants rompre latérale osseuse au cervelet. Utiliser une pince pour séparer le cervelet et le tronc cérébral colliculi et extruder du reste du tissu. Séparer le cervelet en gauche et droite hémisphères avec une pince.
  5. Placer immédiatement cerebelli à droite dans l' azote liquide à épargner pour HPLC analyse et cervelet gauche en pré-réfrigérés paraformaldéhyde 4% (PFA) pour la fixation des tissus. Récolter tout autre tissu d'intérêt avant la rupture de l'aorte et à rejeter la carcasse selon les règles institutionnelles IACUC.
    ATTENTION: PFA est un très toxique, inflammable et corrosif.
  6. Vingt-quatre heures après l'extraction, laver les tissus fixés au PFA (4% dans du PBS) dans du tampon phosphate salin (PBS) (trois fois, 5 minutes / lavage) avant de placer le tissu dans 30% de sucrose à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines.

6. immunopathologie Assay

  1. Fixez le tube d'un microtome en traîneau à un robinet d'évier et une boîte de contrôle de la température. Utilisez la boîte de contrôle de la température pour refroidir le stade microtome à -25 ° C. Réglez la molette épaisseur de coupe à 50 um.
    NOTE: Si le cadran sur le microtome de traîneau ne parvient pas à 50 um, réglez la molette sur un réglage plus fin et multiplier l'épaisseur en déplaçant le réglage en conséquence (par exemple régler la dial à 10 um et de passer cinq fois avant de sectionner pour une épaisseur totale de 50 pm).
  2. Tamponnez une partie dime-taille optimale Température de coupe (OTC) solution sur la scène. Avant gèle l'OTC, utilisez une pince pour positionner l'hémisphère de telle sorte que la surface de coupe sagittal médian est face vers le bas sur la couche de gré à gré. En travaillant rapidement, orienter doucement le tissu avec une pince de telle sorte que la pointe latérale de l'hémisphère est pointé vers la lame, supérieure à la scène. Laisser l'OTC de geler complètement.
    1. Travailler en couches, ajouter d'autres OTC autour du tissu permettant à l'OTC de geler complètement avant d'ajouter la couche suivante. Ajouter une couche mince de gré à gré sur le dessus du tissu et le gel.
  3. Section du tissu, la distribution de poids corporel égal sur la lame de coupe en coupe. Collecter sections à l'aide d'un pinceau d'artiste bien lieu et dans un puits de plaque marquée de manière appropriée contenant PBS 1x. Entre sections, re-définir l'épaisseur de coupe sur laluge cadran microtome, si nécessaire, à 50 um.
  4. Remplacer le PBS dans chaque puits du bien-plaque avec une solution d'urée [0,01 M d'urée dans du PBS] et placer la plaque sur la glace. Une fois prêt, retirer la plaque de sections de glace et faire bouillir dans une solution d'urée à trois reprises pendant 15 s à chaque fois pour démasquer des épitopes pour immunomarquage. Cette étape peut être facilement accompli en plaçant la plaque sur un bloc chauffant réglé à la température d'ébullition. Entre chaque étape d'ébullition, refroidir la plaque contenant les sections de tissu sur la glace.
    NOTE: Si vous effectuez l'urée, le blocage, l'anticorps primaire, un anticorps secondaire et les étapes de DAPI dans une plaque à 96 puits, utiliser 100 volumes uL tout au long. Si un puits de taille différente est utilisée, ajuster les volumes de réactifs en conséquence. Au lieu d'un bloc de chauffage, un four micro-ondes peut être utilisée pour faire bouillir les échantillons de tissu dans l'urée. des échantillons de micro-ondes sur un paramètre pour trois 15 intervalles de s haute puissance.
  5. Poster ébullition, laver sections à trois reprises, chaque fois que la suppression solution actuelle, en remplaçant la solutionavec PBS 1x et à agiter pendant 10 min.
  6. sections de bloc avec une solution de sérum d'âne (3% de sérum d'âne normal, 0,3% de triton X-100 dans du PBS) par un tissu en incubation dans du sérum pendant une heure avec agitation douce à température ambiante. Enlever la solution de sérum d'âne.
  7. Sections d'étiquetage avec 0,2 pg / ml anti-calbindin et 1: 2000 anti-ataxine-1 anticorps (11NQ) 16 dans une solution de sérum d'âne et incuber à 4 ° C pendant 72 h avec agitation douce.
  8. Laver les coupes avec du PBS comme à l'étape 6.5 avant l'incubation des sections dans un anticorps secondaire approprié (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-chèvre et 1: anticorps 500 Alexa Fluor-594 anti-lapin dilué dans une solution de sérum d'âne) à 4 ° C pendant 48 h avec agitation douce.
  9. Laver les articles à trois reprises avec du PBS comme à l'étape 6.5 avant que les noyaux de cellules de marquage avec du DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole), la solution diluée à une concentration finale de 0,5 pg / ml dans du PBS. DAPI incubation ne doit pas dépasser dix minutes. Retirer solution et laver avec du PBS comme dans l'étape 6.5.
  10. Monter les tissus sur des lames revêtues de gélatine 2% avec un milieu de montage pour réduire photoblanchiment. Coverslip et sceller avec du vernis à ongles.
  11. Avec un microscope confocal à balayage localiser la fissure principale du cervelet sous la lumière de fond clair. Avec un objectif 10X UIS2, numériser et exciter séquentiellement DAPI, AlexaFluor-488 et AlexaFluor-594 canaux à l'aide d'un laser de 405 nm de diode, un 488 nm laser à gaz d'argon et d'une diode laser 559 nm, respectivement, en conjonction avec un DM488 / 559 nm dichroïque diviseur de faisceau. Séparer et collecter la lumière émise en utilisant SDM490 et SDM560 séparateurs de faisceaux et un filtre passe-bande BA575-675, respectivement.
    1. Pour chaque canal, la construction d'un z-stack au sein de la fissure primaire avec z = 20 um et l'étape = 0,1 um. Utilisez le logiciel de post-traitement fourni avec le microscope confocal à ajouter dans un marqueur de taille à l'image finale.
      REMARQUE: les lasers alternatifs, les filtres et les fluorophores peuvent être substitués basés inspirty. Si AlexaFluor-488 ou AlexaFluor-594 détection est faible, un phosphure de gallium (GaAsP) détecteur haute sensibilité peut être utilisé pour amplifier le signal si disponible.

7. Couche Quantification moléculaire épaisseur et le nombre de cellules de Purkinje

  1. En utilisant ImageJ, ouvrez une image z-pile de fissure primaire teinté et divisé chaque image dans ses canaux rouge, bleu et vert en sélectionnant 'Image' de la barre de menu, "Couleur" de l'onglet Image et «Chaînes de Split 'de la couleur languette.
  2. Créer une projection de Z max de chaque canal qui a été divisé. Lorsque l'image de canal d'intérêt est ouvert, sélectionnez 'Image' de la barre de menus, «sections» de l'onglet Image et «Z-projet» de l'onglet «Sections». Dans le menu de commande 'Z-projet ", sélectionnez" Max Z projection' et cliquez sur 'OK'. Répétez l'opération pour chaque canal.
  3. Ouvrez le plug-in Cell Compteur en sélectionnant 'Plugins' de the barre de menu, "Analyser" de l'onglet Plugins et "Cell Counter" de l'onglet Analyser.
    NOTE: ImageJ et le compteur de cellules Plugin ImageJ peuvent être téléchargés sur les sites Web fournis dans la Table des matières et équipements.
  4. Quantifier le nombre de cellules de Purkinje en comptant les noyaux de Ataxin-1 marqué qui se trouvent le long d'un tronçon de 200 um prédéterminée de longueurs antérieure et postérieure de la fissure primaire. Utilisez la carte de seuil en sélectionnant 'Image' de la barre de menu, «Réglage» de l'onglet Image et «Seuil» de l'onglet Ajuster pour faire une carte de seuil du canal d'intérêt (rouge dans le cas des noyaux Ataxin-1 marqué ).
    1. Choisissez une gamme de pixels qui peut être normalisée à travers la quantification (31-225 pixels par exemple). Jeter le bruit des images en cochant la case "Arrière-plan foncé" dans la fenêtre de seuil. signal d'image peut être inversé pour la facilité de comptage.
  5. Quantifier couche moléculaire thiquekness dans le canal vert en utilisant les «canaux de Split 'et' Seuil Map 'outil comme dans les étapes 7.1 et 7.2. En utilisant le marqueur de taille sur chaque image comme un guide, mesurer au hasard trois longueurs de couches moléculaires dans chacun des deux désigné 200 um étendues de chaque image de fissure primaire. Effectuer des mesures à partir de l'extrémité proximale de l'arbre dendritique Purkinje à la base du soma Purkinje à l'extrémité distale de l'arbre dendritique Purkinje.
  6. Enregistrement Purkinje Les comptages de cellules et l'épaisseur de la couche moléculaire comme des moyens plus ou moins l'erreur standard. Effectuer une analyse de variance avec des comparaisons multiples analyse post-hoc pour tester l'effet des conditions de traitement ou de génotype sur le nombre de cellules et la longueur de l'arbre dendritique.

8. HPLC Analyse des cérébelleuse succinique Concentrations acide post-traitement

  1. Préparation de l' échantillon pour l' analyse
    1. Peser chaque hémisphère cérébelleux droit récolté avantutiliser dans une analyse par HPLC. Émincer moitiés hémisphériques un à la fois dans un dounce homogénéisateur pré-refroidi et ajouter 0,5 ml de 75:25 (en volume) de l' eau: une solution de methanol à chaque moitié homogénéisé 17.
    2. L'utilisation d'un homogénéisateur pré-réfrigérée étroite, grossièrement briser le tissu avec 5 coups de Dounce. Continuer à hacher finement chaque échantillon de tissu avec un homogénéiseur plus large, en appliquant 20 coups de Dounce.
    3. Transférer les broyats de pré-réfrigérée microtube. Après chaque échantillon, rincer le homogénéisateur avec 0,5 mL d'eau glacée: solution de méthanol et ajouter le rinçage au tube de microcentrifugeuse.
    4. Centrifugeuse échantillons d'homogénat à 1300 xg pendant 30 min à 25 ° C et recueillir le surnageant dans un tube propre.
    5. Filtrer le surnageant à travers une unité de filtre centrifuge logé avec un filtre en cellulose régénérée de 10 kilodaltons (kDa) limite nominale du poids moléculaire. Si ne fonctionne pas immédiatement analyse HPLC, magasin filtré échantillons à -80 °C.
  2. HPLC Instrumentation et Conditions
    1. Fixer une colonne de chromatographie d'exclusion ionique avec une longueur d'au moins 30 cm et une dimension de particules de 7 pm à un chromatographe liquide à haute performance.
    2. Préparer et dégazer une quantité d'un tampon acétate 1 mM suffisamment ajustée à un pH de 5.
    3. Régler la HPLC avec une vitesse de phase mobile de 0,8 ml / min. Si l'on utilise un détecteur UV-vis, sélectionner une longueur d'onde de détection de 224 nm. temps d'élution typique de l'acide succinique dans ces conditions sont comprises entre 10 et 12 min.
  3. Exécution et analyse des normes et des échantillons
    1. Préparer un ensemble de normes en phase mobile de tampon d'acétate avec des concentrations d'acide succinique entre 0 et 250 ppm.
    2. Exécutez chaque norme et préparer une courbe d'étalonnage en utilisant la zone de pointe mesurée à partir de chaque essai.
    3. Une fois, on obtient une courbe standard précise, exécuter des échantillons préalablement préparés dilués dans un tampon d'acétate.Pour une plus grande précision de la mesure, les échantillons peuvent être dopés avec des concentrations connues de l'acide succinique qui ont été dilués dans la phase mobile. Exécutez tous les échantillons en triple exemplaire.
    4. Analyser les chromatogrammes HPLC pour déterminer la concentration d'acide succinique des échantillons en utilisant la courbe d'étalonnage et en multipliant ensuite par le volume de l'échantillon et en divisant par la masse de l'échantillon initial.

9. Ex Vivo Analyse des cérébelleuse mitochondrial Fonctionnalité L' utilisation d' une unité de contrôle des électrodes d'oxygène

  1. Créer une électrode de type Clark en utilisant un système disponible dans le commerce en appliquant d' abord une goutte de chlorure de potassium (50% KCl / v) solution sur la cathode en platine, en coupant un morceau de tabac commercial 1,5 cm2 papier à rouler et à placer délicatement le papier la cathode de platine.
    1. Couvrir la cathode et l' anode entourant avec un morceau de polytétrafluoroéthylène (PTFE) du papier de 2,5 cm 2 et snuggly garantir à la fois membranes avec joints toriques, en vous assurant qu'il n'y a pas de plis ou de bulles dans les membranes. Goutte à goutte une solution de KCl 50% dans le puits environnants.
  2. Fixer l'électrode premade dans la chambre de dosage et remplir avec de l'eau saturée d'air. Chauffer la chambre à 30 ° C, ajouter une barre d'agitation de 0,8 cm à la solution et agiter à 70 tours par minute à l'aide du logiciel de l'instrument. Calibrer la chambre en établissant l'oxygène zéro. Pour ce faire, ajoutez en série quelques cristaux de dithionite agent de sodium réducteur à la solution.
    1. Une fois que l' étalonnage est obtenue, laver la chambre une fois avec 70% d' éthanol, puis lavez six fois avec de l' eau déminéralisée avant de permettre à la chambre de s'acclimater dans 1,5 ml de tampon de respiration (5 mM de MgCl2, 60 mM de KCl, mannitol 100 mM, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de Na2EDTA, 60 mM de Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
      REMARQUE: toutes les traces de dithionite de sodium doit être complètement enlevé pendant les étapes de lavage avant de tenter de mesurerla concentration en oxygène au cours des expériences de respiration.
  3. Homogénéiser doucement les hémisphères cérébelleux pesés dans 0,5 ml de tampon d'homogénat (0,25 M de saccharose, 0,5 mM d'EDTA, 50 mM de Tris-HCl [pH 7,4]). Transfert homogénat à un tube propre de 1,5 ml et garder réfrigéré jusqu'à commencer l'essai.
  4. Ajouter l'homogénat à la chambre, pour atteindre un volume final de 2 ml. Perméabiliser le broyat par addition d'cérébelleux 40 ul de la digitonine ou la saponine (5 mg / mL); laisser incuber le tissu homogénéisé pendant 10 min.
    NOTE: Digitonine et saponine sont toxiques, et des temps d'incubation doivent être réduites au minimum.
  5. Pour commencer à enregistrer la consommation d'oxygène, déterminer la fonction mitochondriale par l'activation et l'inhibition de la phosphorylation oxydative de la chaîne en utilisant des substrats et des inhibiteurs, respectivement (3 enregistrements min par substrat).
    1. Ajouter des substrats en utilisant des seringues propres comme suit: 10 pi 2 M glutamate [concentration finale (fc) 0,01 M],5 ul de 0,8 M malate [fc 2 mM], 20 ul de 0,5 M d'adénosine diphosphate (ADP) [fc 5 mM], 1 pi 1 mM roténone [fc 0,5 uM], 20 pi 1M acide succinique [10 mM], 1 pi 5 mM antimycine A [fc 2,5 uM], 1 pi de 0,8 M d'ascorbate [fc 0,4 mm] et 5 ul de 0,2 M de tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD). [Fc 0,5 mM] Lors de l'ajout de substrats à la chambre veiller à ne pas introduire de bulles d'air dans le système.
      NOTE: Des informations détaillées sur l'effet fonctionnel induite par chaque substrat et inhibiteur est décrit dans un protocole précédemment publié 7. peuvent avoir besoin d'être généré pour déterminer les concentrations optimales des substrats et inhibiteurs dans les préparations / tissus / espèces non étudiées précédemment courbes dose-réponse individuelle. De même, le protocole peut être optimisé pour les tendances innées du métabolisme du tissu / espèces étudiées, telles que les préférences de substrat.
  6. Une fois la collecte des données est terminée, doucement unspirate les homogénats cérébelleux et nettoyer la chambre avec de l'éthanol et de l'eau déminéralisée. Une fois les échantillons propres, supplémentaires cérébelleux homogénat peuvent être exécutés sans étalonnage supplémentaire pour aussi longtemps que la membrane PTFE reste intacte. Après achèvement, nettoyer l'électrode avec de l'eau déminéralisée et de l'éthanol et le magasin avec un gel ou d'un déshydratant silice.
    NOTE: Entre le jour même court, remplir la chambre avec de l'eau déminéralisée veillant à ce que la membrane ne se dessèche pas.
  7. Utilisation de la feuille de données créé par le logiciel de l'instrument, l'exportation 40 min des données de respiration commençant deux minutes après l'addition du substrat à un programme de feuille de calcul.
  8. Calculer le taux de respiration par substrat ou un inhibiteur. Normaliser les données en divisant la respiration totale par le taux de respiration pendant l'addition du substrat de l'ascorbate-TMPD.
    NOTE: Le taux de respiration peut encore être normalisées par rapport à la teneur en protéines du tissu qui peut être particulièrement souhaitable dans des expériences de neurodégénérescencedans laquelle la teneur en tissu peut varier. Pour ce faire, réserver 50 ul de l'échantillon homogénat (de l'étape 9.3) pour une utilisation dans un dosage de protéines standard.

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Résultats

Par le ciblage pharmacologique des mitochondries cérébelleux avec de l'acide succinique, nous sommes en mesure d'empêcher un dysfonctionnement mitochondrial dans un modèle de souris de la maladie neuro-dégénérative SCA1 de cérébelleuse. Le donneur d'électrons canonique de la succinate déshydrogénase, acide succinique, a été dissous dans de l' eau potable à la maison de la cage de souris SCA1 pendant un mois, l'évaluation comportementale début au cours de la deuxième semaine de traitement...

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Discussion

Si ces méthodes sont utilisées, comme décrit, ils sont capables de détecter et d'atténuer l'oxydation dysfonctionnement mitochondrial à médiation par la phosphorylation dans des modèles murins de maladies neuro-dégénératives du cervelet. Les tests biochimiques et comportementaux combinés sont des méthodes multiples pour déterminer l'étendue de la contribution mitochondrial à cérébelleux pathologie de la maladie neurodégénérative. En traitant des souris avec de l'acide succinique pour stimuler le métaboli...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Harry Orr de l’Université du Minnesota pour son généreux don de souris transgéniques. Nous tenons également à remercier les anciens élèves du Skidmore College suivants pour leur travail dans la réalisation des expériences précédentes : Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson et Cheyanne Slocum. De plus, nous tenons à remercier le Skidmore College d’avoir financé le développement de ces méthodes.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Adénosine diphosphateSigma AldrichA2754ADP
AscorbateSigma AldrichA7631
Albumine sérique bovineSigma AldrichA2153BSA
4',6-Diamidino-2-phénylindoleSigma AldrichD9542DAPI
DigitoninSigma AldrichD141
DithiothreitolSigma AldrichD0632DTT
Sérum d’âneSigma AldrichD9663
GlutamateSigma Aldrich1446600
MalateSigma Aldrich6994
MannitolSigma AldrichM4125
ParaformaldéhydeSigma AldrichP6148
Lactobionate de potassiumSucres Bio69313-67-3
RoténoneSigma AldrichR8875
SaponineSigma Aldrich47036
Acide SucciniqueSigma AldrichS3674
N,N,N&prime ;,N&prime ; -Tétraméthyl-p-phénylènediamineSigma AldrichT7394TMPD
Triton X-100Sigma AldrichT9284
UreaSigma AldrichU0631
Vectashield support de montageVector LabsH-1000
Antibodies
11NQ anticorps (anti-ataxine-1 )Servadio, et al. 1995, PMID : 7647801
Alexa Fluor 488 anticorps secondaire anti-sourisLife TechnologiesA-11015
Alexa Fluor 594 anticorps secondaire anti-lapinLife TechnologiesA-11012
Anticorps Calbindin (chèvre)Santa CruzC-20
Animals
Souris transgéniques de contrôleHarry Orr, Ph.D.A02Burright, et al. 1997, PMID : 9217978
souris SCA1Harry Orr, Ph.D.B05Burright, et al. 1997, PMID : 9217978
Souris de type sauvageThe Jackson Laboratory001800
Equipment
ESM-100L microtomeERMAMicrotome Sledge
Fluoview FV1200 Microscope confocalOlympus
Lames de glycérol-gélatineFD Neuro TechnologiesPO101
Seringue HamiltonSigma AldrichVCAT 80465
OXYT1 Oxytherm Électrode Control UnitHansatech Instruments
P.T.F.E. papierCole-ParmerUX-08277-15
Rotallion RotarodPPP& Gcontacter l’auteur correspondant pour plus d’informations
Ultimate 3000 HPLCDionex
Software
ImageJNational Institute of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
Cell counter plugin (pour ImageJ)National Institute of Healthhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P& G Rota-Rod v3.3.3 (logiciel rotarod)PPP& Gcontacter l’auteur correspondant pour plus d’informations
Phidget21.dll (requis pour le logiciel rotarod)DLL-Files.comhttps://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

Références

  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
  3. Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
  4. Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).
  5. Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
  6. Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  8. Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
  9. Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
  10. Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
  11. Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
  12. Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
  13. Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
  14. Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
  15. Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
  16. Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
  17. Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
  18. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
  19. Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
  20. Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
  21. Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
  22. Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
  23. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).

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