Préparation de cultures Rat oligodendrocytes progénitrices et la quantification des oligodendrogenèse par analyse de fluorescence à double infrarouge

Résumé

Les oligodendrocytes sont les cellules myélinisantes du système nerveux central. Ce protocole décrit une méthode d’isolement et de culture de leurs précurseurs, des cellules progénitrices d’oligodendrocytes, à partir de cortex de rats, ainsi qu’une méthode quantitative rapide et fiable pour évaluer l’oligodendrogenèse in vitro en réponse à des facteurs expérimentaux.

Résumé

L’oligodendrogenèse efficace est l’objectif thérapeutique d’un certain nombre de domaines de recherche, notamment les lésions de la moelle épinière, l’hypoxie néonatale et les maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques et la myélite transverse. La myélinisation est nécessaire non seulement pour faciliter la propagation rapide des impulsions dans le système nerveux central, mais aussi pour fournir un soutien trophique aux axones sous-jacents. Les cellules progénitrices des oligodendrocytes (CPO) peuvent être étudiées in vitro pour aider à identifier les facteurs qui peuvent favoriser ou inhiber la différenciation des oligodendrocytes. À ce jour, de nombreuses méthodes disponibles pour évaluer ce processus ont soit nécessité un grand nombre de cellules, limitant ainsi le nombre de conditions pouvant être étudiées à un moment donné, soit des méthodes de quantification à forte intensité de main-d’œuvre. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l’isolement d’un grand nombre d’OPC hautement purs ainsi qu’une méthode rapide et fiable pour déterminer l’oligodendrogenèse à partir de plusieurs conditions simultanément. Les OPC sont isolés à partir de cortex de rat néonatal P5-P7 et cultivés in vitro pendant trois jours avant la différenciation. Quatre jours après la différenciation, l’oligodendrogenèse est évaluée à l’aide d’un test à balayage par fluorescence infrarouge double pour déterminer l’expression de la protéine de myéline.

Introduction

Efficace conduction nerveuse dans le système nerveux central des mammifères (CNS) exige la myélinisation des axones par les oligodendrocytes. Au cours du développement, les oligodendrocytes proviennent d'un pool de cellules progénitrices oligodendrocytes (OPC) qui sont pensés pour migrer des zones ventriculaires du cerveau antérieur développement et tube neural ^1. Après OPC de migration se différencient en oligodendrocytes matures, myélinisantes que non seulement faciliter la propagation de l'influx efficace, mais aussi de fournir des axones avec le soutien trophique ^2. Le SNC adulte conserve une population abondante d'OPC qui sont d....

Protocole

Procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par Institutional Animal Care et l'utilisation Commission (IACUC) et Johns Hopkins School of Medicine.

1. Préparation de l'essai plaques, Solutions mères et OPC Base de médias

Remarque: La base de OPC de rat (Sato) milieux décrits ici sont tirées d'études publiées antérieurement ^12,13. formulations de milieux alternatifs peuvent également être compatible avec cette procédure.

1. Remettre en suspension de poly-L-lysine (PLL) à une concentration de 10 ug / ml dans de l'eau déminéralisée stérile. Pipette 400 pi de la PLL diluée dans chaque puits d'un fond pl....

Résultats

OPC de A2B5 positifs sont isolés par sélection cellulaire positive en utilisant un système de séparation de la colonne magnétique. Avant la procédure d'isolement, l'ensemble du cerveau est retiré de ratons qui sont entre P5 et P7. Une fois l'ensemble du cerveau est détaché avec succès du crâne, des bulbes olfactifs et le cervelet sont enlevés à l'aide de pinces chirurgicales fines (figure 1A). Afin d'isoler des tissus du cortex cérébral de l'hypot.......

Discussion

Le protocole présenté ici décrit une méthode rapide et fiable pour isoler les OPC de rat et de quantifier en oligodendrogenèse vitro en réponse à des facteurs expérimentaux. Utilisation de la sélection positive, les rendements élevés de OPC viables et purs sont utilisés directement à des fins expérimentales. Cette méthode simplifie l'isolement, la culture, et les étapes de différenciation dans un délai de 1 semaine, et les cellules fixes peut être facilement stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaine.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dissection Materials
PBS sans Ca2+ et Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Boîtes de Pétri en polystyrène	Fisherbrand	0857512
Dissection Microscope	Motic	SM2-168
Dissociation Matériaux
Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Rotateur de tube de dissociation
dissociation du tissu neural (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Kit de dissociation enzymatique
PBS avec Ca2+ et Mg2+		Corning 20-030-CV	1x
40 &mu ; m Filtre à cellules	Corning	352340
A2B5 Purification en colonne  ; Microbilles
Anti-A2B5	Miltenyi Biotec	130-097-864	Colonnes d’anticorps A2B5 liées aux billes
LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	Colonnes de sélection magnétique
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS avec Ca2+ et Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Albumine sérique bovine  ;	Sigma-Aldrich	A9647	0,50 %
< fort>Matériaux de culture
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine  ;	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Sel de fumarate de clémastine	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 &mu ; M Sel
d’hémifumarate de quétiapine	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 &mu ; M
N-acétyl cystéine	Sigma-Aldrich	A9165	5 &mu ; g/ml
Progestérone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 &mu ; g/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 &mu ; g/ml
Sélénite de sodium	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotine	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insuline	Sigma-Aldrich	I6634 5	&mu ; g/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 &mu ; g/ml
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A4161	100 &mu ; g/ml
d’oligo-éléments B	Corning	25-022-CL	1x  ;
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1x  ;
Pénicilline/Streptomycine	Life Technologies	15140122	1x  ;
DMEM	Life Technologies	11995-065 1x	;
Visiplate noir 24 puits avec couvercle	Perkin Elmer	1450-605	Grade de culture tissulaire
Immunocytochimie et quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4 %
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0,10
Sérum de chèvre normal	Jackson Immuno Research	005-000-121	5 %
souris monoclonale anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1 000 Dilution
lapin polyclonal anti-actine	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
lapin polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1 000
Dilution chèvre anti-souris 680RD	Licor	926-68070	1:500
Dilution chèvre anti-lapin 800CW	Licor	926-32211	Dilution 1:500
Alexa Fluor 594 chèvre anti-souris	Life Technologies	A11032	Dilution 1:1 000
Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin	Life Technologies	A11008	Dilution 1:1 000
Prolong Gold anti-fade avec DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS avec Ca2+ et Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Système d’imagerie infrarouge	Licor

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