Préparation de cultures Rat oligodendrocytes progénitrices et la quantification des oligodendrogenèse par analyse de fluorescence à double infrarouge

Résumé

Les oligodendrocytes sont les cellules myélinisantes du système nerveux central. Ce protocole décrit une méthode d’isolement et de culture de leurs précurseurs, des cellules progénitrices d’oligodendrocytes, à partir de cortex de rats, ainsi qu’une méthode quantitative rapide et fiable pour évaluer l’oligodendrogenèse in vitro en réponse à des facteurs expérimentaux.

Résumé

L’oligodendrogenèse efficace est l’objectif thérapeutique d’un certain nombre de domaines de recherche, notamment les lésions de la moelle épinière, l’hypoxie néonatale et les maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques et la myélite transverse. La myélinisation est nécessaire non seulement pour faciliter la propagation rapide des impulsions dans le système nerveux central, mais aussi pour fournir un soutien trophique aux axones sous-jacents. Les cellules progénitrices des oligodendrocytes (CPO) peuvent être étudiées in vitro pour aider à identifier les facteurs qui peuvent favoriser ou inhiber la différenciation des oligodendrocytes. À ce jour, de nombreuses méthodes disponibles pour évaluer ce processus ont soit nécessité un grand nombre de cellules, limitant ainsi le nombre de conditions pouvant être étudiées à un moment donné, soit des méthodes de quantification à forte intensité de main-d’œuvre. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l’isolement d’un grand nombre d’OPC hautement purs ainsi qu’une méthode rapide et fiable pour déterminer l’oligodendrogenèse à partir de plusieurs conditions simultanément. Les OPC sont isolés à partir de cortex de rat néonatal P5-P7 et cultivés in vitro pendant trois jours avant la différenciation. Quatre jours après la différenciation, l’oligodendrogenèse est évaluée à l’aide d’un test à balayage par fluorescence infrarouge double pour déterminer l’expression de la protéine de myéline.

Introduction

Efficace conduction nerveuse dans le système nerveux central des mammifères (CNS) exige la myélinisation des axones par les oligodendrocytes. Au cours du développement, les oligodendrocytes proviennent d'un pool de cellules progénitrices oligodendrocytes (OPC) qui sont pensés pour migrer des zones ventriculaires du cerveau antérieur développement et tube neural ^1. Après OPC de migration se différencient en oligodendrocytes matures, myélinisantes que non seulement faciliter la propagation de l'influx efficace, mais aussi de fournir des axones avec le soutien trophique ^2. Le SNC adulte conserve une population abondante d'OPC qui sont dispersées dans toute la substance grise et blanche comprenant environ 5-8% de toutes les cellules ^3. Suite à une insulte démyélinisante, OPC migrent vers le site de la lésion, prolifèrent, et se différencient pour remplacer les gaines de myéline perdus ou endommagés sur axones exposés. Cependant, dans certains contextes maladie / blessure, ce processus est jugée inefficace ou peut échouer complètement ^4. Tandis quedémyélinisation chronique est pensé pour ajouter à la charge de morbidité, oligodendrogenèse et la remyélinisation efficace peut atténuer les symptômes ^5. Il a donc été intéressant d'étudier les OPC in vitro pour déterminer l'effet de facteurs expérimentaux sur oligodendrogenèse.

Aperçu des différentes phases de différenciation des oligodendrocytes a été rendue possible par l'identification de marqueurs cellulaires spécifiques de la scène. Auto-renouvellement des cellules souches précoces sont définis par leur expression dérivé des plaquettes récepteur du facteur de croissance alpha (PDGFRa), l'antigène de neurones / cellules gliales 2 (NG2) et A2B5 ^6-8. Comme OPC lancer leur programme de différenciation et se retirent du cycle cellulaire, ils régulent à la baisse l'expression de ces marqueurs et commencent à exprimer des protéines indiquant premyelinating oligodendrocytes dont Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase) et O4. Enfin, leur différenciation en oligodendroc plus matureytes est caractérisé par l'expression de protéines associées à la myéline, y compris la glycoprotéine associée à la myéline (MAG), la protéine protéolipidique (PLP), et la protéine basique de la myéline (MBP). MBP est une protéine de membrane périphérique intracellulaire et une composante majeure de la gaine de myéline. Les souris dépourvues MBP développent un phénotype sévère dans laquelle myélinisation du SNC est diminué de façon significative conduit à des tremblements, des convulsions et la mort précoce ^9,10. Ce rôle important dans la myélinisation de MBP a conduit à son utilisation en tant que marqueur de la différenciation des oligodendrocytes in vitro et in vivo ^11.

La quantification de la MBP peut être réalisée en utilisant plusieurs méthodes différentes. RT-PCR et l'analyse par transfert de Western pour permettre la quantification des niveaux MBP sous différents régimes de traitement. Immunocytochimie est une approche qualitative commune qui peut aussi être quantitative lorsque des approches de microscopie par caméra sont utilisés. Bien que ces systèmes sont fiables et fondamentale pourl'étude de la différenciation des oligodendrocytes, ils ont chacun leurs propres inconvénients qui limitent leur utilisation dans le criblage de médicaments. En premier lieu, la quantité d'OPC de base qui sont nécessaires pour la RT-PCR et l'analyse par Western blot de réduire le nombre de variables qui peuvent être examinées simultanément. Bien que l'exigence de la cellule pour immunocytochimie est beaucoup plus faible, beaucoup de temps doit être consacré à chaque expérience, si la quantification est le but. De nombreuses images doivent être capturés et ensuite quantifiés pour faciliter l'analyse expérimentale. Ces mises en garde deviennent des obstacles importants à considérer pour les études qui nécessitent une évaluation à haut débit. Nous décrivons ici un procédé qui utilise les aspects fondamentaux à la fois du immunocytochimie et les méthodes de Western blot pour la quantification de la myéline, tout en réduisant considérablement le nombre de cellules nécessaires et de temps pour terminer l'analyse quantitative.

Protocole

Procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par Institutional Animal Care et l'utilisation Commission (IACUC) et Johns Hopkins School of Medicine.

1. Préparation de l'essai plaques, Solutions mères et OPC Base de médias

Remarque: La base de OPC de rat (Sato) milieux décrits ici sont tirées d'études publiées antérieurement ^12,13. formulations de milieux alternatifs peuvent également être compatible avec cette procédure.

1. Remettre en suspension de poly-L-lysine (PLL) à une concentration de 10 ug / ml dans de l'eau déminéralisée stérile. Pipette 400 pi de la PLL diluée dans chaque puits d'un fond plat à parois noires, clairement 24 tissus et de qualité de la culture.
2. Manteau des boîtes de culture de tissu pendant 2 heures dans un 37 ° C tissu incubateur de culture ou toute la nuit dans un réfrigérateur C 4 °.
3. Aspirer PLL plats revêtus d'au moins 20 min avant le placage. Laisser le PLL restante de sécher du puits en plaçant des plaques de 24 puits avec le couvercle partiellement entrouverte dans une culture tissulairecapuche. Vérifiez que les puits sont complètement secs avant placage OPC isolés. Les cellules ne seront pas adhérer au plastique qui a liquide PLL présente.
4. Préparer N -acétyl-L-cystéine (NAC) solution mère (1,000x): dissoudre 100 mg N -acétyl-L-cystéine (NAC) dans 20 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM). Aliquote et conserver à -20 ° C.
5. Préparer la solution mère d'hydrocortisone (1,000x): Ajouter 1 ml d'éthanol à 1 mg d'hydrocortisone et agiter pour dissoudre. Ajouter 19 ml de DMEM, mélanger la solution, aliquote et conserver à -20 ° C. L'addition d'hydrocortisone sur le support de base a été montré pour améliorer la survie des cellules gliales ^14.
6. Préparer la solution mère de D-biotine (5000 x): Dissoudre 2,5 mg de d-biotine dans 50 ml de PBS. Ajouter 1-2 gouttes x 5 pi de NaOH 0,1 N pour aider à la dissolution. Aliquote et conserver à -20 ° C.
7. Préparer la solution de réserve d'insuline (100x): Dissoudre 25 mg d'insuline dans 50 ml de culture de tissus de l'eau de qualité. Ajouter 250 pi of 1 N HCl et mélanger jusqu'à ce que la solution est claire. Stériliser avec un filtre et un magasin de 0,22 um à 4 ° C pendant jusqu'à 6 semaines.
8. Préparer la solution mère Sato (100x):
   1. Préparer la solution de progestérone de stock (25 ug / ul): Dissoudre 2,5 mg de progestérone dans 100 pi d'éthanol.
   2. Préparer sélénite solution stock de sodium (400 ng / ul): Dissoudre sélénite de sodium à 4 mg dans 100 pi de NaOH 0,1 N. Ajouter 10 ml de DMEM et mélanger.
   3. A 100 ml de DMEM, ajouter 1 g de l'apo-transferrine humaine, 1 g de sérum-albumine bovine et 160 mg de putrescine et mélanger pour dissoudre complètement. Ajouter 25 pi de solution progestérone boursier, 1000 pi de solution de sélénite de sodium d'actions, et mélanger. Aliquote et conserver à -20 ° C.
9. Préparer OPC base de support: 100 ml de DMEM (avec 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamine et 110 mg / L de pyruvate de sodium), on ajoute 100 ul du CNA, 100 pl d'hydrocortisone, 20 pi de d-biotine, 1 ml insuline, 1 ml Sato actions, 100 pi d'oligo-éléments B,2 B-27 ml supplémentaire (50x), et 1 ml de pénicilline / streptomycine (100x). Stériliser avec un filtre et un magasin de 0,22 um à 4 ° C.
10. Préparer la solution mère PDGF-AA (1,000x): dissoudre 250 pg dans 12,5 ml de PBS avec 0,1% de sérum albumine bovine (BSA) pour faire une solution / ml à 20 ng. Aliquote et conserver à -80 ° C.
11. Préparer des milieux de prolifération OPC: les médias de base OPC complétées avec 20 ng / ml de PDGF-AA.
12. Préparer des milieux de différenciation OPC: les médias de base OPC complété avec 45 nM triiodothyronine.
13. Préparer tampon de colonne: Pour 500 ml de PBS, ajouter 2,5 g de BSA et 2 ml d'acide éthylènediaminetétra-acétique 0,5 M (EDTA) et ajuster le pH à 7,2. Stériliser avec un filtre et un magasin de 0,22 um à 4 ° C.

2. cerveau de rat Dissection

Remarque: chiots P5-P7 rat sont utilisés dans ce protocole. Chaque cortex raton donne environ 1,5-2,0 x 10 cellules positives ⁶ A2B5.

1. Stériliser tous les équipements de dissection en utilisant un 2506; C bourrelet chauffé stérilisateur.
2. Ajouter 15-20 ml de PBS (sans Ca ^{2+ et} Mg ²⁺⁾ à 50 ml tubes coniques. Un 50 ml tube conique est suffisante pour 3-4 cortex chez les ratons. Placer 50 ml tubes coniques sur la glace. Utilisez 50 ml tubes coniques pour maintenir le tissu de cortex dés lors de la dissection.
3. Ajouter PBS froid pour une boîte de 10 cm de Pétri. Ce plat sera utilisé pour la dissection au microscope optique.
4. Sacrifier les ratons par décapitation avec de grands ciseaux chirurgicaux. Vaporiser tête avec 70% d'éthanol.
5. Extraire le Cerveau Global
   1. L'aide de petits ciseaux coupent la peau vers le bas de la ligne médiane et derrière les oreilles et les volets peler la peau du dos. Couper le crâne vers le bas à partir de la ligne médiane du tronc cérébral et se terminant au niveau des yeux. Veillez à ne pas couper trop profondément afin de préserver la structure du cortex sous-jacent.
   2. Faire deux coupes latérales inférieures au cervelet par l'insertion de petits ciseaux chirurgicaux dans le trou occipital. Faire une coupe supplémentaire entre les yeux, fourmierior aux bulbes olfactifs.
   3. Retirer délicatement chaque moitié du crâne en arrière. Retirer l'ensemble du cerveau et le placer dans la boîte de Petri 10 cm rempli de PBS froid.
6. Sous le microscope optique de dissection, retirez les bulbes olfactifs et cervelet avec pinces chirurgicales fines.
7. Retournez le cerveau de telle sorte que la surface ventrale est visible au microscope optique.
8. Aide de pinces fines droites effectuer une dissection en plaçant forceps fermés conseils entre le cortex et l'hypothalamus à une profondeur d'environ 2/3 du cerveau. Une fois la pince sont en place permettra aux extrémités d'ouvrir. Répétez l'opération pour l'autre hémisphère.
9. Taquiner le cortex de l'hypothalamus et les régions du mésencéphale.
10. Supprimer l'hypothalamus, le thalamus, le mésencéphale et en maintenant le mésencéphale, à sa face postérieure et le pelage vers l'extrémité antérieure du cerveau. Couper les connexions antérieures.
11. Retirer l'hippocampe par carillonner vers l'extérieur, puis couper sa connexion à lacortex à l'aide de fines pinces à dissection courbés.
12. Retirer restant striatum par la mise au rebut à partir du cortex sous-jacent dans un mouvement vers l'extérieur en diagonale à l'aide de fines pinces à dissection courbés.
13. Effacer les vaisseaux sanguins et les méninges de la surface ventrale du cortex.
14. Retourner le cerveau de sorte que la surface dorsale est visible. Méninges et les vaisseaux sanguins devraient être apparente. méninges Peel du cortex sous-jacent à l'aide de fines pinces à dissection. Lancer le pelage de l'emplacement olfactive de fixation de l'ampoule.
15. Suivez les étapes 2.4 à 2.14 pour un total de 3-4 ratons.
16. Placez 3-4 disséqués cortex chez les ratons dans une boîte de Pétri sec et hacher avec une lame de rasoir stérilisée jusqu'à 1 mm x 1 mm morceaux sont atteints. Prélever des tissus par rinçage lave avec du PBS d'un 50 ml tube conique (étape 2), puis replacer sur la glace.

3. La dissociation enzymatique et mécanique tissulaire

Remarque: Pour cette étape, un kit de dissociation de neurones en fonction de la papaïne est recommandée. avec NeKit de dissociation de l'Oural (P), des dispositions particulières qui sont optimales pour l'isolement de l'OPC sont décrits.

1. Préparer la première enzyme de dissociation en diluant enzyme P avec le tampon approprié. Le contenu de chaque conique de 50 ml (1 échantillon) sont remises en suspension avec un total de 1950 ul de mélange enzymatique. Place dans le mélange d'enzymes dans un bain de 37 ° C pendant 10 min.
   1 échantillon: 1.900 pi de tampon + 50 pl de la papaïne enzyme
2. Spin tous les tubes de 50 ml coniques contenant 3-4 dés rat cortex chiot à 300 g pendant 3 min.
3. Aspirer le surnageant et ajouter 1.950 pi de solution d'enzyme dans chaque tube de l'échantillon et briser le culot en inversant le tube et en secouant doucement.
4. Incuber dans un 37 ° C incubateur de culture de tissu pendant 15 minutes avec rotation du tube continu.
5. Pendant les 5 dernières minutes de l'incubation, préparer la seconde enzyme mélange A. Diluer l'enzyme dans sa mémoire tampon appropriée. Un total de 30 ul est ajoutéepour chaque 50 ml conique tube d'échantillon.
   Echantillon 1: 20 pl de tampon + 10 ul d'enzyme
6. Une fois l'incubation terminée ajouter 30 ul du deuxième mélange d'enzymes à chaque tube et mélanger par inversion.
7. En utilisant une pipette Pasteur en verre fixé à un dispositif de commande de pipette, dissocier mécaniquement le tissu par pipetage 10-15 fois ou jusqu'à ce que les morceaux de tissu sont de taille réduite et la solution est devenue trouble. Remettre l'échantillon à la 37 ° C tissu incubateur de culture pendant 15 minutes avec rotation continue.
8. Pipeter chaque échantillon d'homogénat de tissu 10-15 fois l'aide d'une pipette de 1 ml.
9. Pipeter chaque échantillon d'homogénat de tissu 15-20 fois à l'aide d'une pipette 200 ul
10. Tous les échantillons revenir à la 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 10 minutes avec rotation continue.
11. Ajouter 10 ml de PBS (avec du Ca ^{2+ et} Mg ²⁺⁾ à chaque échantillon et filtrer l'homogénat à travers un filtre de 40 um des pores placée sur un 50 ml tube. Rincer le filtre avec un 1-2 ml supplémentaires de PBS.
12. Regrouper tous les échantillons d'homogénat dans un tube conique de 50 ml et d'acquérir un nombre d'ensemble de cellules.
13. Après avoir effectué la numération cellulaire, répartis uniformément dans l'homogénat 15 ml tubes coniques (1 tube pour chaque échantillon). Centrifugeuse pour 10-12 min à 300 x g.

4. Anti-A2B5 application Perle, Colonne purification et placage

1. Effectuer des calculs pour tampon de la colonne et les microbilles anti-A2B5. Ajouter 7 ul tampon de colonne pour chaque 1 x 10 ⁶ cellules. Ajouter 2 ul microbilles anti-A2B5 pour chaque 1 x 10 ⁶ cellules.
2. Combiner tous les échantillons en remettant en suspension les cellules dans un volume total de 10 ml de tampon de colonne et centrifuger à 300 g pendant 10 à 12 min.
3. Remettre en suspension le culot cellulaire dans la quantité appropriée de tampon de colonne, tel que calculé à l'étape 4.1. Si la pastille est grand et lâche, ajouter seulement environ la moitié du volume de tampon de colonne pour maintenir la luttecorps à la concentration appropriée dans la mise en suspension des cellules.
4. Incuber la suspension de cellules pendant 10 min à 4 ° C.
5. Ajouter microbilles anti-A2B5 (calculée à l'étape 4.1), inverser plusieurs fois et incuber à 4 ° C pendant 30-60 min. Retourner doucement le tube à plusieurs reprises toutes les 10 minutes. De plus longues durées d'incubation peuvent accroître le rendement des cellules, mais peuvent augmenter la liaison non spécifique.
6. Ajouter 5 volumes de tampon de colonne. Si les cellules sont remises en suspension dans un volume de 1 ml, ajouter 5 ml de tampon de colonne, alors que si les cellules sont remises en suspension dans 2 ml, ajouter 10 ml de tampon de colonne.
7. Centrifuger pendant 10 min à 300 x g.
8. Déterminer le nombre de colonnes LS sera nécessaire pour la purification. Une colonne LS est suffisant pour 15-20 x 10 ⁶ cellules totales.
9. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1000 pi de tampon de colonne par colonne LS utilisé.
10. Premier chaque colonne LS en ajoutant 5 ml de tampon de colonne. Recueillir l'écoulement à travers un tube conique de 50 ml. Une fois que les bu de colonneffer ait complètement passé à travers la chambre supérieure, appliquer 1000 ul de la suspension cellulaire à chaque colonne et de permettre aux cellules de se traversent par gravité.
    Remarque: Si la densité des cellules est trop élevé, la colonne peut courir lentement.
11. Immédiatement après la suspension de cellules est passé à travers la colonne, on ajoute lentement 3 ml de tampon de colonne pour chaque colonne pour laver les cellules non liées. Si le lavage est facilement en cours d'exécution à travers la colonne (1 goutte pour chaque 30-45 sec), laver deux fois supplémentaires avec 3 ml de tampon de colonne.
12. Retirer chaque colonne et le placer sur un tube conique de 15 ml. Ajouter 5 ml de tampon de colonne et plonger le tampon à travers la colonne à un débit rapide à l'aide du piston en plastique qui est empaqueté avec la colonne. Plongeante sera déloger les cellules liées les libérant de la colonne.
13. Augmenter la pureté en exécutant l'échantillon à travers une deuxième série de colonnes LS. Utiliser un tiers du nombre de colonnes utilisées lors du premier passage. Amorcer les colonnes avec 5 ml de tampon de colonne.Laisser le tampon de la colonne de passer à travers la chambre supérieure.
14. Etant donné que le volume de la suspension cellulaire sera beaucoup plus grande, appliquer uniformément 1.000 pi de suspension cellulaire à chaque colonne et permettre à la suspension de passer à travers la chambre supérieure de la colonne avant la reconstitution avec un supplément de 1000 pi.
15. Une fois que la suspension de cellules a été complètement appliqué à la deuxième série de colonnes, laver 2-3 fois avec 3 ml de tampon de colonne.
16. Retirez chaque colonne et placez-le sur un tube de 15 ml conique stérile. Ajouter 5 ml de tampon de colonne et plonger le tampon à l'aide du piston en plastique qui est empaqueté avec la colonne. Plongeante sera déloger les cellules liées les libérant de la colonne.
17. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 12-15 min. Le culot doit apparaître compact.
18. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 à 10 ml de milieu OPC prolifération préchauffé (milieu de base supplémenté avec OPC PDGF-AA 20 ng / ml).
19. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
20. Plaque les cellules. Diluer les cellules à 60.000 cellules / ml avec les médias OPC de prolifération. Dans chaque noir, clair fond 24 ainsi, pipette 500 pi de cellules le long du côté du puits pour obtenir 30.000 cellules par puits. Mélanger les cellules en secouant la plaque horizontalement à l'aide d'un chiffre huit mouvement. Si la réalisation du test en 48, 96 ou 384 puits plaques, ajouter 15.000, 7.500 ou 1.500 cellules par puits, respectivement. Ces chiffres peuvent être ajustés en fonction de caractéristiques individuelles de la plaque.
21. Préparer une plaque séparée pour la journée 0 cultures de contrôle de base. Cette plaque de commande doit être fixé avec 4% de paraformaldehyde comme décrit à la section 5.7, lorsque la différenciation est initié le jour 0.
22. Culture des cellules dans des milieux de prolifération OPC à 37 ° C pendant 3 jours sans changement de support.

5. L'induction de la différenciation et OPC Fixation avec 4% de paraformaldehyde

Note: Lors du test de l'effet de petites molécules sur oligodendrogenèse, nous dissolv régulièremente médicaments dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer des stocks 1,000x qui peuvent ensuite être stockés à -80 ° C et diluées dans du milieu directement SATO pour obtenir une concentration finale de 0,1% de DMSO. Nous avons observé aucun changement dans les deux la prolifération ou la différenciation OPC en utilisant cette concentration de DMSO (données non présentées).

1. médias de base OPC préchauffer à 37 ° C et dégeler les stocks de traitement de la toxicomanie à la température ambiante. Lors de l'exécution des traitements en double exemplaire, préparer environ 1,25 ml de milieu par groupe de traitement dans un tube de 1,5 ml. Pour les échantillons en triple, utiliser 2 tubes ml de capacité de centrifugeuses pour tenir compte de jeu.
2. Préparer les mélanges maîtres de traitement pour les puits répliqués en diluant les stocks de traitement directement dans OPC médias de base. vortex brièvement ou mélanger doucement chaque mastermix d'assurer une répartition homogène du traitement.
3. Préparer 45 nM triiodothyronine (T ₃₎ que le contrôle positif et le véhicule approprié comme contrôle négatif. Diluer 10 mM T ₃ disponible1: 1 000 dans 1 ml de milieu de base OPC puis diluer dans le cadre d'un traitement mélange pour réduire la concentration finale de DMSO si nécessaire.
4. Aspirer le support du puits de culture une groupe de traitement à la fois, afin d'éviter le séchage des cellules. Utiliser un embout de pipette de 200 pi sur l'extrémité de la pipette Pasteur en verre pour éviter racler la matière noire sur les côtés du puits et dans la culture.
5. Ajouter lentement 500 pl de mélange maître de traitement le long du côté du puits à l'aide d'une pipette de 1 ml.
6. Incuber les cultures pour la période souhaitée, d'effectuer un échange de médias complète avec les médias de traitement frais tous les 2-3 jours. On observe régulièrement un 30-40% MBP ⁺ culture au bout de 4 jours dans les médias de différenciation.
7. À la fin de la période de traitement désiré, préparer frais paraformaldéhyde 4% (PFA) ou dégeler un stock congelé à la température ambiante. ATTENTION: PFA est extrêmement toxique et doit être préparé dans une hotte.
8. Aspirer les médias et ajouter lentement 4001; l de PFA sur le côté du puits pour fixer les cellules. Incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante.
9. Aspirer le PFA et ajouter lentement 500 pl de PBS stérile D-(avec Ca ^{2+ et} Mg ²⁺⁾ sur le côté du puits pour laver les cellules. Répétez le lavage d'un total de deux fois plus. Ne pas aspirer le lavage final.
10. Enveloppez la plaque dans parafilm et conserver à 4 ° C pour un traitement ultérieur ou passer directement à l'étape suivante. Les plaques peuvent être conservées pendant plusieurs semaines.

6. Immunocytochimie et la quantification de protéine basique de myéline

Remarque: Lors de l'exécution des procédures de manipulation de liquides dans les plaques et 24, il est recommandé de travailler vite pour éviter le dessèchement des cellules. Ici, l'utilisation d'un aspirateur à vide multi-canaux et multi-canal pipette sont recommandés.

1. Amener la plaque à la température ambiante, aspirer le puits et ajouter 250 ul de D-PBS (avec du Ca ^{2+ et} Mg ²⁺⁾ contenant 0,1% de Triton X-100 et 5%sérum de chèvre normal (NGS). Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 heure avec agitation orbitale douce.
2. Préparer la solution d'incubation par dilution primaire monoclonal de souris anti-MBP anticorps 1: 1000 et un anticorps polyclonal de lapin anti-Actine 1: 200 dans du D-PBS (avec du Ca ^{2+ et} Mg ²⁺⁾ contenant 5% de NGS. En variante, polyclonal de lapin anti-Olig2 à 1: 1000 peut être utilisé pour la normalisation des oligodendrocytes spécifique dans des cultures mixtes gliales. Préparer assez de solution primaire pour accueillir 250 pi par puits.
3. Incuber des anticorps primaires à 4 ° C pendant la nuit pour les 16-18 heures avec agitation orbitale douce.
4. Aspirer la solution d'incubation primaire et laver les cellules 3 x 10 min avec 500 ul de D-PBS (avec du Ca ^{2+ et} Mg ²⁺⁾ à la température ambiante avec une agitation douce orbital.
5. En lavant la plaque, préparer la solution d'incubation en diluant secondaire anti-souris 680 anti-lapin et d'anticorps 800 1: 500 dans du D-PBS (avec du Ca ²⁺ et ^{Mg 2+)} contenant 5% de NGS. Minimiser l'exposition de la lumière ambiante lors de la préparation de cette solution.
6. Aspirer le lavage final et ajouter 250 pi de solution d'incubation secondaire. Protéger la plaque de la lumière et incuber à température ambiante pendant 1 heure avec agitation orbitale douce.
7. Aspirer la solution d'incubation secondaire et laver les puits 3 x 10 min avec 500 ul de D-PBS (avec du Ca ^{2+ et} Mg ²⁺⁾ à la température ambiante avec une agitation douce orbital.
8. Balayer la plaque en utilisant un système d'imagerie capable de détecter à 700 nm et les émissions de fluorescence à 800 nm. Comme point de départ, régler le décalage de 3 et sensibilités à 1,5 pour MBP, 5.0 pour l'actine, et 3,5 pour Olig2 focal. Ajuster les valeurs de sensibilité au besoin pour éviter le signal de surexposition.
9. Quantifier l'ampleur des oligodendrogenèse utilisant des méthodes logicielles semi-automatisés.
   1. En utilisant le logiciel, réglez le mode d'analyse de plaque "24 Eh bien" et aligner des cercles autour de til périmètre extérieur des puits numérisés. Réglez le canal de normalisation à "800" et d'exporter les totaux et relatifs intensités de fluorescence pour le 700 nm (MBP) et 800 nm (Olig2 / actine) canaux.
   2. Diviser l'intensité à 700 nm par l'intensité à 800 nm pour obtenir l'expression de MBP normalisée en unités relatives de fluorescence. Calculer la moyenne des mesures répétées et l'échelle de l'expression à la Journée 0 contrôles + PDGF selon les besoins de l'analyse.

Résultats

OPC de A2B5 positifs sont isolés par sélection cellulaire positive en utilisant un système de séparation de la colonne magnétique. Avant la procédure d'isolement, l'ensemble du cerveau est retiré de ratons qui sont entre P5 et P7. Une fois l'ensemble du cerveau est détaché avec succès du crâne, des bulbes olfactifs et le cervelet sont enlevés à l'aide de pinces chirurgicales fines (figure 1A). Afin d'isoler des tissus du cortex cérébral de l'hypothalamus, le thalamus et ...

Discussion

Le protocole présenté ici décrit une méthode rapide et fiable pour isoler les OPC de rat et de quantifier en oligodendrogenèse vitro en réponse à des facteurs expérimentaux. Utilisation de la sélection positive, les rendements élevés de OPC viables et purs sont utilisés directement à des fins expérimentales. Cette méthode simplifie l'isolement, la culture, et les étapes de différenciation dans un délai de 1 semaine, et les cellules fixes peut être facilement stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaine...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dissection Materials
PBS sans Ca2+ et Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Boîtes de Pétri en polystyrène	Fisherbrand	0857512
Dissection Microscope	Motic	SM2-168
Dissociation Matériaux
Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Rotateur de tube de dissociation
dissociation du tissu neural (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Kit de dissociation enzymatique
PBS avec Ca2+ et Mg2+		Corning 20-030-CV	1x
40 &mu ; m Filtre à cellules	Corning	352340
A2B5 Purification en colonne  ; Microbilles
Anti-A2B5	Miltenyi Biotec	130-097-864	Colonnes d’anticorps A2B5 liées aux billes
LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	Colonnes de sélection magnétique
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS avec Ca2+ et Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Albumine sérique bovine  ;	Sigma-Aldrich	A9647	0,50 %
< fort>Matériaux de culture
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine  ;	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Sel de fumarate de clémastine	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 &mu ; M Sel
d’hémifumarate de quétiapine	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 &mu ; M
N-acétyl cystéine	Sigma-Aldrich	A9165	5 &mu ; g/ml
Progestérone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 &mu ; g/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 &mu ; g/ml
Sélénite de sodium	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotine	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insuline	Sigma-Aldrich	I6634 5	&mu ; g/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 &mu ; g/ml
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A4161	100 &mu ; g/ml
d’oligo-éléments B	Corning	25-022-CL	1x  ;
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1x  ;
Pénicilline/Streptomycine	Life Technologies	15140122	1x  ;
DMEM	Life Technologies	11995-065 1x	;
Visiplate noir 24 puits avec couvercle	Perkin Elmer	1450-605	Grade de culture tissulaire
Immunocytochimie et quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4 %
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0,10
Sérum de chèvre normal	Jackson Immuno Research	005-000-121	5 %
souris monoclonale anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1 000 Dilution
lapin polyclonal anti-actine	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
lapin polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1 000
Dilution chèvre anti-souris 680RD	Licor	926-68070	1:500
Dilution chèvre anti-lapin 800CW	Licor	926-32211	Dilution 1:500
Alexa Fluor 594 chèvre anti-souris	Life Technologies	A11032	Dilution 1:1 000
Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin	Life Technologies	A11008	Dilution 1:1 000
Prolong Gold anti-fade avec DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS avec Ca2+ et Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Système d’imagerie infrarouge	Licor