Cet article présente une méthode rapide et simple pour l'administration de la bléomycine directement dans la trachée de souris par intubation. Les principaux avantages de cette méthode est qu'il est hautement reproductible, facile à maîtriser, et ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de longs temps de récupération.
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Article de méthode
Une méthode améliorée pour Rapid intubation de la trachée chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Malgré certaines différences anatomiques et physiologiques, les modèles murins continuent d’être un outil essentiel pour l’étude des maladies pulmonaires humaines. La toxicité de la bléomycine est un modèle couramment utilisé pour étudier à la fois les lésions pulmonaires aiguës et la fibrose, et plusieurs méthodes ont été développées pour administrer la bléomycine (et d’autres agents toxiques) dans les poumons. Cependant, bon nombre de ces approches, telles que l’instillation transtrachéale, présentent des inconvénients inhérents, notamment la nécessité d’anesthésiques puissants et d’une chirurgie de survie. Cet article fait état d’une méthode rapide et reproductible d’intubation intratrachéale qui implique une légère anesthésie inhalée, la visualisation de la trachée et l’utilisation d’un spiromètre de substitution pour confirmer l’exposition. À titre de preuve de concept, des souris C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines ont reçu soit 2,0 U/kg de bléomycine, soit un volume équivalent de PBS, et les paramètres dommageables et fibrotiques ont été mesurés après l’exposition. Cette procédure permet aux chercheurs de traiter une grande cohorte de souris dans un délai relativement court avec peu de frais et un minimum de soins post-procédure.
Introduction
En dépit de quelques différences anatomiques et physiologiques, 1 modèles murins continuent à être très précieux pour la modélisation de la biologie humaine et la pathogenèse de la maladie. 2 Du point de vue l'élevage, les souris sont faciles à manipuler, avoir un temps de reproduction faible, une durée de vie accélérée, et sont relativement peu coûteux à la maison. Avec le développement de souches diverses génétiques et stratégies (ex., Knock-out conditionnel, souris rapporteurs, les approches de la lignée de traçage, etc.), ainsi que la large gamme de réactifs disponibles (par ex., Des anticorps, des protéines recombinantes, des inhibiteurs, etc.), les souris sont devenues un organisme modèle vertébré essentiel pour découvrir les processus de l'homéostasie et les maladies humaines. 3
Les souris ont été particulièrement précieux pour l'étude des conditions pulmonaires, y compris les lésions aiguës du poumon (ALI) et la fibrose pulmonaire. 4 ALI chez l'homme peut être causée par un traumatisme, une blessure ou une septicémie et se caractérise par l'épithélium etfuite endothéliale (ie., oedème), l'inflammation et la fibrose naissante. Chez de nombreux patients, ALI progresse à sa forme sévère, syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), ce qui se traduit souvent par la fibrose et de la mort par insuffisance respiratoire. 5,6 La fibrose pulmonaire est une pathologie évolutive fatale caractérisée par le dépôt excessif de matrice extracellulaire , notamment collagène de type I, qui conduit à la fonction pulmonaire. 7,8 administration de la bléomycine (BLM) est le modèle le plus largement utilisé et le meilleur caractérisé pour induire ALI et de la fibrose chez les animaux expérimentaux. 9 Bien que BLM-induit une fibrose pulmonaire chez les rongeurs ne récapituler pas pleinement les phénotypes fibrotiques humains, 10 des études de souris avec ce modèle ont conduit à la découverte de nombreux facteurs importants influant sur l'apparition et la progression de la maladie 11.
Bien que le mécanisme exact (s) derrière fibrogenèse induite BLM-ne sont pas connus, la blessure initiationon pense résultant d'un contact dépendant des brins d'ADN des pauses dans les cellules épithéliales qui tapissent les voies aériennes et les alvéoles, et en particulier, tapez 1 pneumocytes. 12 La nécessité d'un contact direct entre BLM et l'épithélium pulmonaire met en évidence l'importance d'un itinéraire de livraison robuste , et ces préoccupations sont également pertinentes pour un large éventail de traitements ciblés pour les voies aériennes distales, y compris les protéines recombinantes, les anticorps, siRNA, virus, bactéries, particules, et plus encore. Aspiration oropharyngée (OPA) a été largement utilisé à cette fin 13, mais un défaut majeur de l'OPA est qu'une partie de l'agent livré peut être avalé dans le tractus gastro-intestinal, ce qui conduit à l'imprécision de la dose administrée. Une autre approche est largement utilisé instillation transtracheale, ce qui implique une trachéotomie sous anesthésie forte pour exposer la trachée et l'instillation d'un agent directement dans les voies respiratoires. 14 Cependant, non seulement, de tellesune procédure pas souhaitable en raison de son invasivité, mais il est aussi prend du temps, nécessite un peu juste de la formation, et provoque une blessure puissant pour les voies respiratoires. 15,16 Plusieurs protocoles ont été élaborés qui impliquent l'administration directe des agents dans le trachée sans avoir besoin d'une intervention chirurgicale, 16,17,18,19,20 mais ces méthodes impliquent étendues temps de récupération causée par les anesthésiques puissants, l'utilisation d'un équipement coûteux (ie., otoscope / laryngoscope, disponibles dans le commerce planches de procédure, fibre optique fils, etc.), un excès de manipulation dans la cavité buccale, et l'incertitude en ce qui concerne le dosage.
Le présent document décrit une méthode relativement facile de l'administration par intubation qui permet à un chercheur rapidement, à moindre coût, et inculquer de manière fiable un réactif dans le poumon murin avec un risque limité de dommages résiduels aux tissus environnants.
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Protocole
Les soins et l'utilisation des comités institutionnels animaux (IACUC) à l'Université de Washington et de Cedars-Sinai Medical Center ont approuvé les travaux nécessaires à ces études animales.
1. Préparation
- Stériliser les deux pinces à extrémité franche et l'autoclave abaisse via.
- L'utilisation d'un poste de sécurité microbiologique, préparer un stock de travail de BLM dans PBS de la poudre lyophilisée. Sonication la solution pendant 10 min à 35 kHz pour assurer un mélange homogène.
Remarque: Un volume total compris entre 30 et 45 pi est recommandée pour éviter pipetage variation sur le bas de gamme, et la suffocation avec des volumes plus importants. - Préparer un espace de travail propre qui comprend environ 1 m 2 pour la procédure elle-même, ainsi que des endroits désignés pour les cages à la fois avant et après la procédure.
- Fixer la base de la procédure conseil sur le banc juste en face du chercheur en mettant 2 ou 3 bandes de ruban de laboratoire à travers la base et Ss-ying banc. Voir la figure 1 pour plus de spécifications sur la création d'un conseil.
- Attachez une seule longueur de taille 4.0 fil de suture entre les deux vis de la carte de la procédure de positionnement.
- Générer un spiromètre de fortune en enlevant et en écartant le piston de trois seringues de 1 ml, et le dépôt de 60 ul de PBS dans la partie supérieure de chaque cylindre pour former un joint étanche à l'air. Fixer le moyeu du cathéter de manière lâche l'une des seringues et le placer sur un côté de la planche.
- Aspirer 300 pi d'air dans une seringue de 1 ml et placez-le sur un côté de la planche.
- Couper une pièce supplémentaire de bande d'environ 6 pouces de longueur et la mettre de côté. Il sera utilisé pour fixer l'animal à la carte à l'étape 2.4.
- Mettre en place une chambre isoflurane. Fixez O 2, l'isoflurane et vide aux ports appropriés à la fois la chambre d'exposition et le vide de dégagement. Alternativement, d'administrer un anesthésique dans un isoflurane compatible biologiqueenceinte de sécurité.
2. intubation
- Anesthésier la souris avec de l'isoflurane dans la chambre jusqu'à ce qu'il perde conscience et la respiration ralentit à un taux approprié. Une exposition typique comprend 4% d'isoflurane et 2% d'O 2 pendant 3 à 4 min, et le résultat idéal est de 2 à 2,5 minutes de la sédation. Cela correspond à un taux de respiration 1 toutes les 2 s de respiration.
- En attendant que la sédation de mettre en, aspirer entre 30 et 45 pi de BLM dans une pipette et la mettre de côté.
- Lorsque vous êtes prêt, de suspendre la souris sous sédation par ses incisives supérieures du fil attaché aux vis de la plate-forme de la procédure de positionnement. Assurez-vous que le dos de l'animal repose à plat sur la surface de la plate-forme.
- En faisant attention de ne pas restreindre la ventilation, placez un morceau de ruban adhésif de manière lâche à travers le (caudale) partie inférieure de la cage thoracique, juste au-dessus du diaphragme. Le placement doit être assez serré pour maintenir un alignement correct au cours de la procedure, mais pas tellement serré qu'il restreint la respiration.
- Allumer le dispositif d'éclairage entre 80% et 100% d'intensité et d'orienter le col de cygne de sorte qu'il est de 1 à 2 cm de la surface de la peau, à proximité du plexus solaire. Vérifiez régulièrement la pointe du col de cygne pour la chaleur pour assurer qu'il ne nuit pas à la souris.
- Debout derrière la plate-forme, utilisez les, pince à extrémités franches stériles pour localiser la langue. En veillant à éviter les incisives inférieures, doucement adhérence et d'en tirer la langue hors de la cavité buccale.
- En utilisant la main restant, insérer le dépresseur et l'utiliser pour aplatir la langue contre le fond de la cavité buccale. Relâchez la pince, mais laisser le abaisse en place pour les deux étapes suivantes.
- Orienter la lumière de sorte que la trachée est visible par le col de cygne de guidage de manière proximale par rapport au niveau du plexus solaire jusqu'à ce qu'il atteigne le niveau des bronches de l'axe principal.
Remarque: La trachée peut être facilement distinguée par l'action de la respiration, WHIch provoque la lumière émise à fluctuer en intensité. Lorsqu'il est correctement positionné, cette structure sera discernable dans le plan axial une broche situé au centre de la lumière avec un minimum de lumière ambiante dans la cavité buccale elle-même. - Angle de la seringue afin qu'il suive le chemin naturel de la trachée, et abaisser l'extrémité du cathéter 22-G, avec la seringue attachée contenant la goutte, directement dans la lumière. La bulle PBS va commencer à monter et descendre à chaque respiration lors du placement réussi.
Remarque: Cette action peut être retardée de plusieurs secondes à la suite de la sédation profonde. - Nourrir le cathéter dans un supplément de 5 mm. Retirer l'abaisse-langue.
- Décaler la seringue à la main opposée, et saisir le moyeu, retirez délicatement la seringue.
- Dépôt entre 30 et 45 pi de BLM dans le centre de l'intérieur du moyeu de cathéter, fixer la deuxième seringue et dispense 300 pi de l'air dans le moyeu.
- Remplacer la deuxièmeseringue avec le premier contenant la bulle de PBS. La bulle va continuer à augmenter et à l'automne si la procédure a été effectuée avec succès.
Soins 3. postopératoire
- Retirer le cathéter et la bande, et placer l'animal dans un endroit chaud et sec jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience - généralement au bout de quelques minutes.
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Résultats
Souris intubés ont été suivis quotidiennement pour perdre du poids et de la détresse, et sacrifiés 4, 10 ou 17 jours plus tard par injection intrapéritonéale de 2,5% 2,2,2 tribromoéthanol. Lavage broncho-alvéolaire (BAL) a été recueilli en trois lavages de PBS comme décrit par ailleurs 21 et le poumon droit a été fixé à 10% de formol, inclus dans la paraffine et coloré avec du trichrome de Masson par l'Université de Washington histologie et Imaging Core <...
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Discussion
Dans les cas où aérosol est impossible, en raison de la disponibilité limitée de réactifs, de la sécurité, ou le coût, l'administration de la trachée directe est une méthode supérieure pour l'administration d'agents exogènes dans les poumons 16 transtrachéale instillation a été largement utilisé à cette fin.; Cependant, comme pour toute intervention chirurgicale, il porte aussi en elle le risque de complications causées par la procédure elle-même, et pas nécessairement l'agent étant inculqué. ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Brian Johnson de l'histologie et Imaging Core à l'Université de Washington de l'aide pour la coloration et l'analyse trichrome. Ce travail a été soutenu par le NIH subventions HL098067 et HL089455.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bléomycine pour injection, 30 unités/flacon | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | Pour de meilleurs résultats, le BLM doit être suspendu dans du PBS, aliquoteé et stocké sous forme d’aliquotes lyophilisées à usage unique |
| bout émoussé | |||
| Abaisse-langue (c’est-à-dire électrode de lame Valleylab pliée, 2,4") ; | Covidien | E1551G | Avant utilisation, créez une courbure à 45 degrés à 1,5 cm de la pointe de la lame. Un abaisseur approprié peut également être créé à partir de n’importe quel outil métallique de dimensions similaires. |
| Exel Safelet Cathéter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Seringue jetable à tuberculine à embout glissant (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0,2 ml Pipette et embouts | |||
| Illuminateur Fiber-Lite. Modèle 181-1 : Le modèle 180 est accouplé à l’illuminateur standard à col de cygne double | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Les illuminateurs LED à faible rendement ne sont pas recommandés car ils n’éclairent pas correctement la trachée. |
| d’intubation | Voir schéma 1. | ||
| Ruban d’étiquette coloré : 0,5 po dans. Large Fisherbrand | 15-901-15A | ||
| Oxygène ; | |||
| Solution saline tamponnée au phosphate, 1X | Corning | 21-040-CV | Le produit doit être stérile |
| Bobine de suture tressée noire en soie non stérile, 91,4 m, taille 4-0 | Appareil de Harvard | 517698 | |
| appareil d’anesthésie de table Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquide pour inhalation 100 mL ; | Baxter | 1001936040 | |
| Système de pathologie numérique Nanozoomer | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit ; | Laboratoires Bethyl | E90-101 |
Références
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Réimpressions et autorisations
